使用 hepG2 细胞系演示控制组织工程的静电纺丝聚合物形态

摘要

该方法提供了测试不同聚己内酯纤维形态和拓扑结构以用于组织工程的方法。小纤维和大纤维采用随机取向、对齐取向以及多孔低温静电纺丝结构制成，并用作细胞培养平台。

摘要

静电纺丝为研究人员提供了制造可重复的微米到纳米级聚合物纤维的机会。静电纺丝聚合物的 3D 纤维结构被认为是细胞外基质 （ECM） 的结构模拟。因此，组织工程研究人员已广泛研究了由生物相容性聚合物制成的静电纺丝纤维作为人工 ECM 在体外和体内指导组织生长的潜在作用。所有细胞都对其机械环境高度敏感。通过与细胞骨架肌动蛋白丝内在相连的多个机械转导途径的发现证明了这一点。细胞骨架充当机械传感器，可以根据其基质的刚度和形态指导宿主细胞的功能和分化。静电纺丝纤维可以在纤维尺寸和形态方面进行调整，以轻松调节纤维聚合物支架内的机械环境。本文介绍了在两种不同纤维直径下针对三种不同形态的静电纺丝聚己内酯 （PCL） 的方法。形态纤维类别包括随机取向纤维、对齐纤维和多孔低温纺丝纤维，直径为 1 μm 和 5 μm。本研究中详述的方法被提议作为研究静电纺丝纤维结构对组织生成影响的平台。了解这些效应将使研究人员能够优化静电纺丝纤维的机械性能，并更彻底地展示这项技术的潜力。

引言

近几十年来，组织工程方法已经发展起来，为细胞提供仿生环境，以促进组织成功再生，无论是体外组织模型还是体内再生技术。这些方法通常鼓励细胞自行或使用导向支架¹ 形成 3D 聚集体。支架可以制造成多孔或纤维状聚合物纳米/微结构，或高吸水性水凝胶 ^2,3,4。聚合物静电纺丝是一种常见的制造技术，可产生可以模拟天然细胞外基质 （ECM） 纤维结构的未织造纳米微米级聚合物纤维基质⁵。多种生物相容性聚合物适用于静电纺丝工艺;因此，静电纺丝纤维是促进组织再生的常用介质 ^6,7,8。静电纺丝纤维已用于一系列组织的培养，为廉价且可重复的支架平台提供了一条有前途的途径 9,10,11,12,13。

细胞对其机械环境具有极强的敏感性。以前的研究强调了这种称为机械转导的重要关系，它可以影响细胞功能、形态和分化^14,15。真核细胞细胞骨架的基础由丝状肌动蛋白构成，在细胞分裂、粘附、迁移、收缩和形态学中起关键机械作用。它通过与细胞外表面蛋白的连接受到外部机械刺激的纵 16,17,18。许多研究已经证明，通过改变可附着底物的形状，形态学对干细胞分化的影响，然后能够控制细胞形状并指导分化过程^19,20。此外，细胞附着的基质的刚度也会影响干细胞的命运和谱系^21,22。除了干细胞，还观察到这些作用会影响不同谱系的细胞^23,24。三维组织工程方法已显示出类似于水凝胶和纤维支架 25,26,27 的 2D 机械转导研究中发现的结果。此外，底物力学通过 3D 细胞聚集体通过细胞-细胞信号传导²⁸ 进行传递。材料力学在指导细胞功能方面起着至关重要的作用，因此应该是工程组织支架设计的主要因素。

该方法的目的是了解静电纺丝聚己内酯 （PCL） 纤维大小和形态对体外细胞培养物的影响。该方法改编自以前专注于肾组织工程的研究⁹。这里提供了更详细的分步方案，以促进支架重建并开发适用于所有细胞类型的标准化方法。用这种方法构建了六组支架:三组是 5 μm 大纤维 （LG），另外三组是 1 μm 小纤维 （SM），使用不同的 PCL 浓度。在这些 LG 和 SM 基团中，有三种不同的形态结构:无规纤维 （RA）、对齐纤维 （AL） 和多孔低温纤维 （CR）。这些支架组都具有本质上不同的结构，因此提供了细胞附着的独特局部机械环境。为了证明这对细胞的形态学影响，将 hepG2 细胞系接种到每组支架上作为代表性研究。该方法作为从干细胞到细胞系和原代细胞的所有细胞类型的静电纺丝支架设计的基线分析提供。

方案

1. 溶液制备

1. 大（随机、对齐和低温）纤维
   1. 使用玻璃血清移液管将 50 mL 氯仿和 10 mL 甲醇混合在玻璃耐溶剂瓶中，制备 5:1 比例的氯仿和甲醇。
      注意:氯仿和甲醇是有毒溶剂，必须在通风橱中进行混合。
   2. 要在 5:1 氯仿:甲醇中制备 19 w/v% 的 PCL 溶液，称取 1.9 g PCL，然后加入 10 mL 5:1 氯仿:甲醇中，装在玻璃耐溶剂样品瓶中。使用石蜡膜对样品瓶进行双重密封，并将样品瓶放在滚筒上过夜，以使 PCL 完全溶解。
      注意: 混合必须在通风橱中进行。
2. 小（随机和对齐）纤维
   1. 要在六氟异丙醇 （HFIP） 中制备 7 w/v% 的 PCL 溶液，称取 0.7 g PCL 并在玻璃防溶剂小瓶中与 10 mL HFIP 混合。使用石蜡膜对样品瓶进行双重密封，并在滚筒上放置过夜，以使 PCL 完全溶解。
      注意:HFIP 具有剧毒，必须在通风橱中进行混合。
3. 小的低温纤维
   注意: 混合必须在通风橱中进行。
   1. 使用玻璃血清移液管将 30 mL 氯仿和 10 mL 甲醇混合在玻璃耐溶剂瓶中，制备 3:1 比例的氯仿和甲醇。
   2. 要在 3:1 氯仿:甲醇中制备 14 w/v% 的 PCL 溶液，称取 1.4 g PCL，然后加入 10 mL 3:1 氯仿:甲醇中，装在玻璃耐溶剂样品瓶中。使用石蜡膜对样品瓶进行双重密封，并在滚筒上放置过夜，以使 PCL 完全溶解。

2. 静电纺丝设置

注意: 在开始静电纺丝过程之前，必须设置参数。

1. 针头尺寸和位置
   1. 对于大纤维（随机、对齐和低温），请使用 1 mm 外径/0.8 mm ID 黄铜针，并将针放置在距离心轴表面 230 mm 的位置。
   2. 对于细纤维，使用 1 mm 外径/0.4 mm 内径的黄铜针，并将针放置在距离心轴表面 15 mm 的位置。
2. 针横向运动
   注意: 图 1 中详述的支架是用 100 毫米针头以 50 毫米/秒的速度制造的，在整个过程中左右重复运动。
   1. 要设置横向运动，请按 Motion |TNS 1 并将 起始位置 [mm] 设置为 -50， 距离 [mm] 设置为 100， 速度 [mm/s] 设置为 50 ， 转弯延迟 [ms] 设置为 750。
3. 注射泵流速
   1. 对于大纤维头（随机、对齐和低温），按下用户界面上的 "材料 "选项卡，并将注射泵设置为 4 mL/h。
   2. 对于小（随机和对齐的）纤维头，将注射泵设置为 0.8 mL/h。
   3. 对于小的低温纤维，将注射泵设置为 2.5 mL/h。
4. 电压设置
   1. 对于大型光纤，通过按下用户界面上的 Voltage（电压 ）选项卡并更改正负电压值，将针电压设置为 +15 kV，将心轴电压设置为 -4 kV。
   2. 对于小（随机和对齐）光纤，将针电压设置为 +17 kV，将心轴电压设置为 -4 kV。
   3. 对于小的低温纤维，将针电压设置为 +18 kV，将心轴电压设置为 -4 kV。
5. 心轴旋转（大纤维和小纤维）
   1. 对于随机纤维，按 Motion |瞄准 并将心轴转速设置为 250 rpm。
   2. 对于对齐的纤维，将心轴转速设置为 1,800 rpm。
   3. 对于低温纤维，将心轴转速设置为 180 rpm。

3. 无规和排列纤维（大纤维和小纤维）的静电纺丝

1. 将针头（有关针头尺寸和位置的信息，请参阅第 2.1 节）插入 1 mm 孔径的 PTFE 管中，并固定在电旋转针架内。
2. 在通风橱下，将 10 mL 聚合物溶液转移到聚丙烯或玻璃（耐溶剂）注射器中。确保在灌注前让注射器静置以去除任何气泡。
3. 通过 PTFE 管将注射器连接到针头，并将注射器固定在注射泵内。连接后，通过挤压注射器柱塞并向管中填充聚合物溶液来灌注 PTFE 管。
4. 用铝箔包裹心轴并固定在心轴旋转装置上。
5. 通过按 Motion |目标 |按 压材料 |启动 Pump 1。
6. 当针头末端形成一小颗聚合物珠时，按 ACTIVATE HIGH VOLTAGE 打开电压。然后，聚合物射流应从聚合物溶液的锥形突起处发射，称为泰勒锥。检查心轴以确认纤维沉积在心轴表面。
7. 运行静电纺丝过程，直到静电纺丝到所需量的 PCL 溶液。
   注:对于 图 1 所示的支架，将 4 mL 溶液静电纺丝。
8. 静电纺丝终止后，从心轴上取下覆盖有纤维的铝箔，并在通风柜中放置过夜，以允许多余的溶剂蒸发。
9. 蒸发后，将纤维储存在室温 （RT） 下。

4. 低温纤维静电纺丝

1. 对于低温静电纺丝，请使用低温纺丝心轴。重复步骤 3.1-3.3，然后继续执行以下步骤。
2. 用铝箔包裹心轴。
3. 用干冰颗粒填充心轴。将冷冻纺丝芯轴盖固定在心轴上，以确保干冰无法逸出芯轴，但压力可以逸出。冰晶应该几乎立即在心轴表面形成。
   注意: 处理干冰时，请戴上防护手套，以免冷烫伤。
4. 将心轴固定到心轴旋转装置上，然后按 Motion |目标 |按 压材料 |启动 Pump 1。
5. 一旦在针头末端形成聚合物珠，按下 ACTIVATE HIGH VOLTAGE 打开电压。然后，应从聚合物溶液的锥形突起（即泰勒锥）射出聚合物射流。检查心轴以确认纤维沉积在心轴表面。
6. 静电纺丝 1 小时后，按 STOP ALL 暂停该过程，并在心轴上加满干冰。确保在重新填充心轴时充分防止溶剂蒸气。执行此作总共 3 次，总共 4 小时的静电纺丝时间。
   注意: 可以通过重复步骤 4.4 和 4.5 来恢复静电纺丝。
7. 静电纺丝结束后，小心地取出心轴并立即将其放入冷冻干燥机中 24 小时，以使心轴表面的冰晶升华。
8. 升华后，从心轴上取下纤维覆盖的箔片并存放在 RT 中，注意避免压碎。

5. 脚手架冲孔

1. 使用 10-12 mm 活检打孔器从纤维片上打孔支架。如果纤维仍然粘附在铝箔上，请将支架放入 70% 乙醇中以促进分离。

6. 灭菌和等离子涂层

1. 将支架（每孔 1 个支架）放入 24 或 48 孔板中，并在 70% 乙醇中洗涤 3 次。在最终洗涤液中浸没，放入 -80 °C 冰箱中，并冷冻。
2. 冷冻后，将板放入冷冻干燥机中并冻干 24 小时。干燥的支架现在可以进行等离子涂层。
   注:如果无法使用等离子涂布机，请将支架浸入磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中的 1% 抗生素-抗真菌剂（Anti-Anti）中，并在 37 °C 下孵育过夜。
3. 将板放入血浆室中并取下盖子。以 500 mTorr 和中等射频 （RF） 功率运行等离子涂布机 30 秒。
4. 等离子体包被后，将支架浸入 1 mL PBS 和 1% Anti-Anti 中。支架应易于吸收 PBS 溶液。
   注意:支架现在可以接种细胞。

7. 细胞的制备和接种

注:下面提供的基本细胞培养技术适用于代表性结果中用于演示目的的 hepg2 细胞。这些原则可应用于任何贴壁细胞类型;但是，不同的细胞可能需要不同的材料和不同的工艺。细胞处理必须在生物安全柜中按照无菌技术进行。

1. 取 1 x 10⁶ 个冻存的 hepg2 细胞，接种到装有 12 mL 完全培养基的 T75 细胞培养瓶中，该培养基由补充有 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素-链霉素、5 mM L-谷氨酰胺和 1% 非必需氨基酸的 Eagle 最低必需培养基 （EMEM） 组成。
2. 一旦细胞达到 80% 汇合，通过在 PBS 中洗涤 3 次并在 37 °C 下在 2 mL 胰蛋白酶中孵育 4 分钟，将细胞从培养瓶中分离出来。敲击培养瓶后，细胞应分离。
3. 通过添加 8 mL 完全培养基来灭活胰蛋白酶。将细胞悬液转移到 15 mL 试管中，并在离心机中以 120 x g 的速度离心细胞 5 分钟。
4. 用吸液管去除细胞沉淀上方的上清液，并替换为 5 mL 完全培养基。用 5 mL 血清移液管上下移液重悬细胞。
5. 通过台盼蓝排除法计数所得细胞悬液。取 100 μL 细胞悬液，加入 1.5 mL 样品瓶中的 100 μL 台盼蓝中。将混合物引入玻璃盖玻片下的血细胞计数器上，并在显微镜下计数细胞。
6. 通过添加或去除完全培养基，将细胞浓度调节至 2.6 x 10⁶ 个细胞/mL。要去除培养基，将细胞以 220 x g 离心 5 分钟，去除所需的培养基，然后重悬细胞。
7. 从孔板中吸出 PBS 中的 1% 抗抗体，并使用 200 μL 移液器将 50 μL 2.6 x 10⁶ 个细胞/mL 细胞悬液接种到支架表面。
8. 让细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 1-3 小时，确保它们不会变干。连接后，加入 300 μL（对于 48 孔板）或 500 μL（对于 24 孔板）培养基，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育。
   注:从这里开始使用标准细胞培养技术，直到进一步的功能分析。

结果

图 1 显示了由 PCL 溶液制备的小纤维 （~1 μm） 和大纤维 （~5 μm） 的扫描电子显微镜 （SEM） 图像。在 SEM 成像之前，使用溅射镀膜机用金钯 （60:40） 溅射镀膜纤维 30 s。在氯仿和甲醇的 5:1 溶液中使用 19 w/v% 的高浓度 PCL 生产大纤维，以制备高粘度 PCL 溶液。然后以高流速静电纺丝这种高粘度溶液，在电场内发射一大丝聚合物溶液。因此，针头和心轴之间需要 230 mm 的大距离，以确保溶剂在沉积到心轴上之前有效蒸发。相反，在 HFIP 中使用 7 w/v% 的低浓度 PCL 生产更小的纤维，以产生低粘度的 PCL 溶液。以低流速静电纺丝低粘度 PCL 溶液可确保在电场内从针头中喷出更细的 PCL 溶液线。较细的线有助于更快地蒸发溶剂，并且针需要在 70 毫米处更靠近心轴，以确保纤维的稳定沉积。对于静电纺丝小的低温纤维，改变 PCL 溶液是获得可靠方案的必要条件。HFIP 中的 PCL 静电纺丝到低温心轴上反复导致纤维结构分解。在 3:1 氯仿甲醇中对浓度为 14 w/v% PCL 的静电纺丝解决了这个问题;然而，这在整个支架上造成了更大的纤维尺寸变化。通过 ImageJ DiameterJ 插件²⁹ 分析每个支架的纤维排列程度（纤维半径和方向），如图 2 和 图 3 所示。

图 1:显示每个支架组形态质量的 SEM 图像。 顶行显示细纤维，底行显示大纤维。形态组从左到右分别列为随机纤维、对齐纤维和低温纤维。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:来自一小组纤维的 DiameterJ 插件的纤维半径（左）和纤维取向（右）数据。 形态学从上到下分别列为随机纤维、对齐纤维和低温纤维。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:来自大量纤维的 DiameterJ 插件的纤维半径（左）和纤维取向（右）数据。 形态学从上到下分别列为随机纤维、对齐纤维和低温纤维。 请单击此处查看此图的较大版本。

该方法为我们提供了一组具有六种明显不同的拉伸性能的支架，这些支架使用拉伸试验机根据前面描述的方法⁹ 确定。如 表 1 所示，宏观杨氏模量范围从大对齐纤维的 46.94 ± 3.48 MPa 到大低温纤维的 0.20 ± 0.01 MPa。生理组织刚度值范围从 100 Pa（神经组织）到 2-4 GPa（骨组织）³⁰;此处报告的所有脚手架刚度值都在此范围内。

脚手架	应变的杨氏模量 （MPa） %
	0–2%	2–4%	4–6%	6–8%	8–10%
SM.RA 类	11.14 ± 2.13	9.31 ± 0.43	6.75 ± 0.64	4.75 ± 0.59	3.32 ± 0.40
SM.铝	27,94 ± 8,63	28.27 ± 7.36	16,34 ± 4,87	9.10 ± 3.75	5.85 ± 3.11
SM.铬	0.27 ± 0.11	0.31 ± 0.44	0.31 ± 0.65	0.29 ± 0.59	0.26 ± 0.40
LG.RA 类	9.23 ± 0.78	8,22 ± 0,87	5.96 ± 0.68	3.96 ± 0.59	2.63 ± 0.45
LG.铝	46,94 ± 3,48	38.03 ± 2.46	27,69 ± 1,22	16.10 ± 1.61	7.87 ± 1.32
LG.铬	0.20 ± 0.01	0.16 ± 0.01	0.12 ± 0.01	0.10 ± 0.01	0,09 ± 0,01

表 1:每个支架组以 2% 应变为间隔的拉伸测试数据。 SM.RA = 小随机，SM。AL = 小对齐，SM。CR = 小低温，LG。RA = 大随机，LG。AL = 大对齐，和 LG。CR = 大低温。数据以 SD ±平均值表示，n = 5。

图 4 显示了用于可视化细胞形态的 DAPI 和鬼笔环肽染色。使用的染色方法在文献^11,12 中建立。使用具有 40 倍放大倍率物镜的显微镜（材料表）获得图像。图像显示，这种方法产生的对齐纤维拉长了 hepG2 细胞形态，并沿着纤维的长度引导增殖的细胞，从而在细胞培养物中产生方向性。相比之下，随机纤维上的 hepG2 细胞没有显示出在对齐结构中观察到的定向增殖和伸长。在随机结构上，hepG2 细胞表现出更规则的形态，延长的突起附着在周围的 PCL 纤维上。

图 4:DAPI（蓝色）和鬼笔环肽（绿色）染色的 hepG2 细胞在不同的支架形态上:随机（左）、对齐（中）和低温（右）。 顶行显示细纤维，底行显示大纤维。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

使用不同的溶剂、PCL 浓度和静电纺丝参数的组合来实现不同纤维尺寸的产生。聚合物的类型、分子量和溶剂对所得溶液的粘度和电荷性质有很大影响，因此对静电纺丝性能有很大影响³¹。该方法中显示的电压会根据静电纺丝的进行条件而变化。温度和湿度影响静电纺丝过程的行为³².因此，建议读者准备好改变电压以应对任何障碍并获得稳定的泰勒锥。建议将静电纺丝机安装在环境控制外壳内，以减少静电纺丝过程中的批次间差异。

由于 IME 静电纺丝装置的功能，实现该方法中呈现的不同形态是可能的。变速心轴对于控制光纤对准至关重要。由于聚合物射流的行为，以低转速 （<250 rpm） 旋转芯轴会产生随机取向的纤维。当带电的聚合物溶液从针中喷出时，内部电荷和空气动力会引起混沌的鞭打效应，该效应用于在芯轴上形成纤维的混沌排列^33,34。这种鞭打效应可以通过将心轴转速提高到 1,800 rpm 以上来克服。沉积在如此高转速心轴上的纤维表现出对齐的结构，因为表面速度足以有效抵消鞭打纤维表现出的任何横向运动。需要注意的是，当使用高心轴速度时，它可能会破坏周围的空气，从而对稳定的泰勒锥的产生不利影响。

高度多孔的低温支架是通过在 -78.5 °C 下用干冰填充心轴来生产的。 这降低了心轴的温度，并促进了表面水滴的冷凝和冻结。形成的晶体表现出从心轴表面出现的峰，纤维沉积在整个峰中。一旦冰晶升华出来，纤维的多孔结构就会留在心轴^{上 35,36}。晶体的重量和易碎性限制了制造多孔排列纤维的能力，因为过高的心轴速度 （>250 rpm） 会导致晶体和纤维由于过大的向心力和空气动力而从心轴上脱落。由于形成的结构的脆弱性，这种方法可能会遇到困难。在处理心轴以及之后处理脚手架时必须小心，因为从液体中取出时，结构在挤压和折叠时容易被压平。还有一种可能性是，在没有低温心轴的情况下成功静电纺丝的溶液可能会被温度变化和晶体结构致命地破坏。在低温纺丝时，心轴表面形成的冰量在很大程度上取决于湿度，从而在最终结果中产生变化。因此，强烈建议将静电纺丝过程包含在环境控制外壳内。

为了评估这些支架上的细胞性能，有必要事先对材料进行消毒。聚合物灭菌有多种选择，包括化学方法、辐射方法和热方法^37,38。评估每种方法的有效性以及对材料使用和材料本身的适用性非常重要。该方案在冻干、血浆处理和浸没在 1% Anti-Anti 溶液之前在 70% 乙醇中消毒。乙醇的使用使蛋白质和微生物变性和脱水，同时不会破坏 PCL 材料³⁷。使用更强的溶剂可能会导致 PCL 溶解。该方法中加入等离子体涂层主要是为了增加 PCL 的亲水性，而 PCL 是众所周知的疏水性，并改善细胞粘附^39,40。方便的是，这也可以作为二次灭菌步骤，但必须注意在血浆处理前后将支架保持在无菌环境中。该方法已被证明适用于使用抗生素处理培养基的体外研究。然而，对于体内应用，必须考虑更稳定的选择，例如环氧乙烷 （EtO） 和 γ 暴露。完成灭菌后，可以将细胞接种到支架上，并应用标准细胞培养技术在体外形成 3D 细胞培养物。

需要注意的是，刚度值应归因于支架内形成的不同微观结构。散装材料 （PCL） 在支架之间保持不变。因此，块状材料刚度在组之间不会改变。由于纤维基体内的连接性降低，低温支架的刚度比其他组低得多，如 表 1 所示。与纤维结构内的拉伸主导变形相反，减少的连通性被认为会引起更弯曲为主的变形⁴¹。有趣的是，在随机组和低温组中，支架刚度并不高度依赖于纤维尺寸。然而，排列的纤维的纵向刚度对纤维尺寸的依赖性明显更高，在 0-2% 应变下的杨氏模量为 27.94 ± 8.63 MPa（小纤维）和 46.94 ± 3.48 MPa（大纤维）。由于拉伸试验的拉伸性质，这意味着纵向横截面内的体积 PCL 密度更高。有必要重申的是，这里提供的机械数据是纤维结构的宏观机械快照。进一步的微观力学表征将有助于充分了解对细胞规模的机械影响。

该方法包括随机和对齐结构，以提供各向同性和各向异性形态之间的比较。在图 2 的 SEM 图像以及图 2 和图 3 中的纤维分析中可以观察到纤维排列的程度。在身体的许多组织中都观察到各向异性。特别是，这通常在对齐的细胞结构中观察到，例如在肌肉和神经组织中发现的细胞结构。排列的聚合物纤维结构提供了在体外概括这些排列结构的能力^42,43。如前所述，细胞功能对形态和机械变化很敏感，因此应对支架结合的细胞进行进一步的功能分析，以确定每种支架类型的生物学影响。

与其他现有的脚手架制造技术相比，该方法提供了一种简单的方法来生产微尺度脚手架结构，对机械性能和形态的控制相对较高。替代 PCL 支架制造，如相分离、盐浸出和气体发泡，允许在空隙空间和孔径方面进行形态控制。然而，孔隙和结构几何形状基本保持不变 44,45,46,47。因此，与静电纺丝相比，各向同性水平等质量不能像静电纺丝那样容易改变。水凝胶材料在支架生产中很受欢迎，它提供了通过改变交联聚合物链的水平来改变聚合物基材刚度的方法⁴⁸。还可以通过多种方法进行 3D 打印，从而对形态⁴⁹ 进行出色的控制。然而，在生物相容性水凝胶材料中实现静电纺丝尺度分辨率仍然是一个实际实施的挑战^50,51。在过去十年中，静电纺丝支架在组织工程研究中很常见，并且一直在探索不同电池类型的新材料和应用的引入。虽然为了静电纺丝支架的目的不断开发新材料，但对现有静电纺丝材料和方法进行进一步生物表征的机会仍然存在。所描述的方法被提议作为一种促进体外生物学研究的方法，因为它直接适用于基本的细胞培养技术。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mm 活检穿刺	Acuderm	P1025
15 mL Falcon 管	Thermo-scientific	339650
20 mL 玻璃样品瓶	Fisherbrand	11513542
48 孔细胞培养板	Greiner Bio-one	677180
抗 100X	Gibco	15240062
氯仿	Acros 有机物
DAPI	Sigma-aldrich	D9542
Eagles 最低必需培养基	Gibco	11090081
电纺器	IME 技术	EC-DIG
胎牛血清	GE Healthcare	SH30071.03
金钯溅射涂布机	Emscope	SC500A
HepG2 细胞	Sigma-Aldrich	85011430
六氟异丙醇 （HFIP）	Manchester Organics	G26383
L-谷氨酰胺 200 mM	Gibco	25030081
MEM 非必需氨基酸	Gibco	11140050
甲醇	Acros Organics	11984591
青霉素-链霉素 10,000 U/mL	Gibco
鬼笔环肽	Abcam	ab176754
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Sigma-aldrich	P4417-100TAB
等离子涂布机	Harrick Plasma	PDC-002
聚己内酯（平均分子量 80,000）	Sigma-aldrich	440744
PTFE 注射器	Fisherbrand	12941031
扫描电子显微镜	Hitachi	S4700
T75 培养瓶	康宁	CLS430641
台盼蓝 （0.4%）	Gibco	15250061