利用宿主范围与可视化筛选快速无缝构建重组痘病毒

摘要

本方法利用宿主范围选择及重组病毒的可视化鉴定，实现“无痕”重组痘苗病毒的构建。

摘要

痘苗病毒（VACV）在根除自然界中的天花病毒（VARV，即天花的致病因子）方面发挥了关键作用。自首次被用作疫苗以来，VACV 已被开发为治疗性疫苗的载体以及溶瘤病毒。这些应用利用了 VACV 基因组易于操作和宿主范围广泛的优势，使其成为构建具有多种治疗用途的重组病毒的优秀平台。目前已开发出多种生成重组 VACV 的方法，包括标记物筛选法和瞬时显性筛选法。本文介绍了一种宿主范围筛选法的优化方案，并结合重组病毒的可视化鉴定。该方法利用宿主抗病毒蛋白激酶 R（PKR）所产生的选择压力，以及表达与 mCherry 融合标签的 E3L 蛋白（VACV 的两种 PKR 拮抗蛋白之一）的荧光融合基因。该表达盒包含目的基因和 mCherry-E3L 融合基因，两侧为来源于 VACV 基因组的序列。在目的基因与 mCherry-E3L 之间设有一个较小区域，其序列与 3’ 臂的前约 150 个核苷酸相同，以促进同源重组并在筛选后丢失 mCherry-E3L 基因。我们证明，该方法可在多种细胞类型中高效、无缝地生成重组 VACV，且无需药物筛选或对突变病毒进行大量筛选。

引言

痘苗病毒（VACV）在成功根除自然界中的人类病原体天花病毒（VARV）的过程中发挥了关键作用。自从天花病毒被消灭以来，包括痘苗病毒在内的痘病毒在人类和动物医学中持续被用作有效的治疗性病毒。例如，基于痘苗病毒的狂犬病病毒疫苗在欧洲¹和美国²预防森林型狂犬病传播方面已取得显著成效。最近，表达多种抗肿瘤分子（例如单链抗体或人促红细胞生成素）的重组痘病毒作为溶瘤剂已展现出令人鼓舞的应用前景^3,4,5。痘苗病毒作为载体尤其具有吸引力，因为它易于进行遗传操作，具有广泛的宿主范围，并且在多种条件下稳定性良好，便于运输并可在现场维持疫苗活性^6,7。尽管已开发出多种技术用于实验室研究和疫苗制备中重组痘苗病毒的构建，但目前的病毒构建策略仍存在明显局限性。

由于VACV具有多种用途，人们已开发出多种生成重组病毒的策略。第一种策略利用同源重组，将包含目的转基因和可筛选标记基因（如抗生素抗性基因）的表达盒导入病毒基因组。该表达盒两侧各带有约500个核苷酸（nt）或更长的同源臂，可引导基因插入病毒基因组的特定....

方案

1. 构建重组载体

1. 设计引物以生成筛选盒。使用任意一种在线引物设计工具，为每个独立扩增片段设计与相邻扩增片段及载体具有重叠序列的引物，以促进DNA分子的等温酶促连接（也称为Gibson连接）。
   注意：本实验方案也可使用传统的限制性内切酶克隆方法完成。若采用此方法，则应设计带有相应限制性酶切位点的引物，而非具有重叠序列的引物。
2. 使用步骤1.1中设计的引物，按从5’到3’的顺序依次PCR扩增以下元件（图1）：约500个核苷酸的VACV基因组E3L基因上游区域（5’臂）、EGFP或目的基因、约150个核苷酸的紧邻VACV基因组E3L基因下游的区域（短3’臂）、一段合成的痘病毒早期/晚期启动子²⁵、mCherry-E3L融合基因，以及包含短3’臂在内的约500个核苷酸的VACV基因组E3L下游区域（长3’臂）。
   1. 在PCR管中，按以下顺序为每个扩增片段加入试剂：17 μL无DNase水，每种引物各1.2 µL（初始浓度=10 μM，终浓度=0.5 μM），5 µL 5x PCR反应缓冲液，模板DNA（从质粒扩增的片段：EGFP和E/L启动子-mCherry-E3L盒，使用10 ng；从病毒基因组DNA扩增的片段：5’和3’臂，使用100 ng），以及0.5 µL DNA聚合酶。调整所加水量，使最终反应体积为50 μL。
      注意：模板DNA的....

结果

我们采用图1所示的流程，通过在已缺失K3L的病毒（vP872）中用EGFP替换E3L，构建了一种同时缺失两种PKR拮抗因子E3L和K3L的VACV。在PKR功能完整的RK13细胞中，图2显示了呈红色荧光的噬斑，表明病毒表达了mCherry-E3L；而在RK13+E3L+K3L细胞中观察到EGFP的表达，证实E3L已被缺失，且mCherry-E3L筛选标记已发生丢失。图3证实，这种同时缺失两种PKR拮抗因子的重组病毒VC-R4无法在PKR功能完整的RK13细胞中复制，而表达E3L的亲本病毒vP872则具有复制能力。为了验证VC-R4在RK13细胞中复制失败仅由E3L缺失所致，我们使用相同的筛选方案，将VC-R4中的EGFP重新替换为E3L，构建了回复病毒。同时，图3也验证了该回复病毒在RK13细胞中的复制效率与vP872相当。有趣的是，在通常用于筛选“无痕”重组体的RK13+E3L+K3L细胞中，尚未进.......

讨论

本文介绍了一种瞬时标记选择策略的改进方法³²，用于构建不含外源DNA的重组痘苗病毒。该策略利用宿主抗病毒蛋白PKR介导的选择压力，而非抗生素等其他形式的选择压力。使用宿主抗病毒基因可避免药物诱导的细胞表型改变，或因筛选药物导致突变风险增加的问题。此外，与药物筛选不同，本方法不存在滞后阶段，因为PKR在所有细胞中均组成型表达。基于mCherry表达的次级视觉筛选也提高了该方法的特异性，确保在第一轮筛选中仅挑选表达外源基因的噬斑；同时，在筛选已丢失mCherry-E3L基因的成熟重组病毒时，该标记同样可高效发挥阴性选择标记的作用。

该重组策略最关键的步骤是构建合适的重组载体，以及进行适当的噬斑纯化，以确保所选病毒为克隆来源。本文建议采用“Gibson 组装”法来构建重组载体。该方法效率极高，可在一天内完成重组载体所有片段的组装。然而，由于短3’臂与长3’臂具有相同的序列，这些片段在克隆反应过程中可能相互连接，导致部分载体中缺失mCherry-E3L表达盒。根据我们的经验，这种情况较为罕见，但在克隆后确认载体结构仍属必要。我们亦曾使用传统的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2X-Q5预混液	NEB	M0492L	PCR中使用的高保真聚合酶
氨苄青霉素	ThermoFisher Scientific	11593027	细菌筛选剂
一次性细胞刮刀	ThermoFisher Scientific	08-100-242	用于收集感染细胞的细胞刮刀
EVOS FL Auto 2细胞成像系统	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	荧光显微镜
EVOS光源立方体，GFP	ThermoFisher	AMEP4651	GFP立方体
EVOS光源立方体，RFP	ThermoFisher	AMEP4652	RFP立方体
GenJet	SignaGen Laboratories	SL100489	转染试剂
LB（Luria Bertani）肉汤	Gibco	10855021	细菌培养基
Monarch DNA凝胶回收试剂盒	NEB	T1020L	用于纯化扩增子和线性化载体的凝胶纯化试剂盒
Monarch质粒小提试剂盒	NEB	T1010L	用于质粒纯化的小提试剂盒
NanoDrop One	ThermoFisher Scientific	ND-ONE-W	用于测定RNA和DNA浓度的分光光度计
NEBuilder预混液	NEB	E2621L	用于构建重组载体的等温酶促连接试剂盒
Q500超声破碎仪	Qsonica	Q500-110	用于病毒裂解物的超声处理
RK13细胞	ATCC	CCL-37	兔肾细胞
VWR多孔细胞培养板	VWR	10062-892	细胞培养板