实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

摘要

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。

摘要

多发性硬化症（MS）是一种由环境因素与易感遗传背景共同作用引起的中枢神经系统（CNS）自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究该病发病机制中广泛使用的典型疾病模型，其中针对髓鞘抗原特异性的T淋巴细胞在中枢神经系统内引发炎症反应。评估中枢神经系统内的淋巴细胞如何调控疾病的发展具有重要意义。然而，由于从脑组织中分离和检测浸润性淋巴细胞存在技术困难，目前可用于测定中枢神经系统内浸润淋巴细胞数量和质量的方法十分有限。本文提供了一种有效的实验方案，可用于中枢神经系统中浸润性淋巴细胞的分离、鉴定与特征分析，有助于深入理解淋巴细胞在中枢神经系统自身免疫性疾病发展过程中的作用机制。

引言

多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统的慢性脱髓鞘疾病，全球约有250万人受其影响，目前尚无治愈方法¹。该病也被认为是一种自身免疫性疾病，其中针对髓鞘抗原特异性的T淋巴细胞引发炎症反应，导致中枢神经系统出现脱髓鞘和轴突损伤²。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）被广泛用于研究MS的致病机制，是中枢神经系统中经典的自身免疫性脱髓鞘疾病模型³。EAE的诱导方法有两种：一种是通过用髓鞘成分免疫动物来主动诱导EAE，另一种是通过将致脑炎性T细胞转移至受体动物体内进行过继转移诱导^2,4,5。不同品系动物对EAE的易感性存在差异⁶。在C57BL/6小鼠中，髓鞘寡突胶质细胞糖蛋白（MOG）35–55免疫攻击可诱导出单相性疾病，伴有广泛的中枢神经系统脱髓鞘和炎症，这一模型常用于基因靶向小鼠的相关实验⁷。

髓鞘特异性反应性T细胞的产生是实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）发生和发展的必要条件，也是EAE和多发性硬化症（MS）共有的免疫学标志。活化的自身反应性T淋巴细胞穿过血脑屏....

方案

本文所述所有方法均已获得上海交通大学基础医学院动物伦理委员会的批准。

1. 材料准备

1. 使用MOG35–55的MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK序列从商业来源获取冻干肽。确保肽的纯度>95%。用磷酸盐缓冲液（PBS）配制10 mg/mL MOG储存液，并于-20 °C保存。
2. 通过将一管100 mg的M. tuberculosis H37 Ra加入25 mL完全弗氏佐剂（CFA）中并混匀，配制4 mg/mL的M. tuberculosis H37 Ra储存液。将储存液于-20 °C保存。
3. 将50 μg百日咳毒素（PTX）加入50 mL PBS中，配制1 ng/μL的百日咳毒素工作液（PTX）。工作液于-20 °C保存。
4. 将所有抗体（即FITC标记的抗小鼠CD3、PE/Cy7标记的抗小鼠CD4、PerCP/Cy5.5标记的抗小鼠CD11b、Alexa Fluor700标记的抗小鼠CD45.2、PE标记的抗小鼠IL-17A以及APC标记的抗小鼠IFN-γ）于4 °C保存。
5. 向500 mL PBS中加入2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和1%胎牛血清（FBS），配制流式细胞术染色缓冲液（FCS缓冲液）。

2. C57BL/6小鼠的饲养

1. 使用 ....

结果

对C57BL/6小鼠进行免疫后，每天对所有小鼠进行称重、检查，并评估其神经学症状的评分。典型的EAE临床病程应呈现如图2A所示的疾病曲线，以及如图2B所示的小鼠体重变化。经MOG35-55免疫的C57BL/6小鼠通常在免疫后第10至12天开始出现疾病症状，并在第15至21天左右达到疾病高峰（图2A）。体重变化是EAE模型中的一个重要指标。在疾病发作前，免疫小鼠的体重逐渐增加；随后，体重通常随着疾病症状的加重而下降。在EAE病情达到高峰时，小鼠的体重也降至最低点（图2B）。随后，随着临床症状的缓解，体重略有恢复。然而，小鼠通常无法完全恢复至正常状态。C57BL/6小鼠在MOG35–55攻击后会发展为单相性慢性疾病病理过程（图2A）。

EAE 的临床严重程度与自身反应性 T 细胞的活化直接相.......

讨论

本研究介绍了一种在C57BL/6小鼠中使用MOG35-55诱导并监测实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案，该品系小鼠被视为多发性硬化症（MS）典型的神经免疫学实验动物模型。根据研究目的，可通过选用不同小鼠品系或不同的诱导蛋白来建立EAE模型。例如，在SJL小鼠中使用PLP139–151肽段可诱导出复发-缓解型EAE病程，特别适用于评估治疗手段对疾病复发的干预效果¹⁵此处所述的实验方案也可应用于其他EAE方案⁷在此模型中，C57BL/6小鼠经MOG35–55多肽免疫后会发展为单相性疾病。采用5分制评分系统评估实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的严重程度。尽管目前已有多种评分系统用于评估疾病严重性，其评分范围从0–3分或0–10分不等^7,16,17这些结果表明，5分制评分系统能够确定组间疾病评分的统计学显著差异，而其他EAE评分系统并未带来明显改进。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor700 抗小鼠 CD45.2	eBioscience	56-0454-82
抗小鼠 CD16/CD32 Fc 封闭抗体	BioLegend	101302
APC 抗小鼠 IFN-γ	eBioscience	17-7311-82
BD LSRFortessa X-20	BD
邓氏匀浆器	Wheaton	353107542
eBioscience 细胞刺激混合液（含蛋白转运抑制剂）（500倍浓缩）	eBioscience	00-4975-03
eBioscience 细胞内固定 && 通透缓冲液套装	eBioscience	88-8824-00
FITC 标记的抗小鼠 CD3 抗体	BioLegend	100203
FITC 大鼠 IgG2b， κ 同型对照抗体	BioLegend	400605
完全弗氏佐剂（CFA）	Sigma-Aldrich	F5881
小鼠 IgG2a κ 同型对照 (eBM2a)，Alexa Fluor 700，eBioscience	eBioscience	56-4724-80
结核分枝杆菌 H37 Ra	Difco Laboratories	231141
PE 抗小鼠 IL-17A	eBioscience	12-7177-81
PE/Cy7 抗小鼠 CD4	BioLegend	100422
PE/Cy7 大鼠 IgG2b κ 同型对照抗体	BioLegend	400617
Percoll	通用电气	17-0891-01
PerCP/Cy5.5 抗小鼠 CD11b	BioLegend	101228
PerCP/Cy5.5 大鼠 IgG2b κ 同型对照抗体	BioLegend	400631
百日咳毒素（PTX）	Sigma-Aldrich	P-2980
大鼠IgG1 κ同型对照（eBRG1），APC，eBioscience	eBioscience	17-4301-82
大鼠IgG2a κ同型对照（eBR2a），PE，eBioscience	eBioscience	12-4321-80
大鼠 MOG35–55 个肽段	Biosynth International		MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK