一种用于研究肽类生物合成酶的氢-氘交换质谱（HDX-MS）平台

摘要

兰肽合成酶在肽类天然产物的生物合成过程中催化多步反应。本文介绍了一种连续的自下而上的氢氘交换质谱（HDX-MS）工作流程，可用于研究兰肽合成酶以及其他参与肽类天然产物生物合成的类似酶的构象动态。

摘要

氢-氘交换质谱法（HDX-MS）是一种用于酶构象变化及酶-底物相互作用生物物理表征的强有力方法。HDX-MS 具有诸多优势，仅需消耗少量样品，可在接近天然条件的环境中进行，无需对酶或底物进行标记，并且能够提供空间分辨的酶构象动力学信息——即使对于大型酶分子和多蛋白复合物也同样适用。该方法通过将目标酶稀释至以 D₂O 配制的缓冲液中启动，从而触发肽键酰胺基团中的氢（N-H）与氘（N-D）发生交换。在设定的交换时间点，取出反应等分试样并进行淬灭，随后将酶蛋白酶解为肽段，肽段通过超高效液相色谱（UPLC）分离，并由质谱（MS）记录各肽段因氢-氘交换引起的质量变化。每个肽段的氘摄取量高度依赖于其局部的氢键环境：位于酶分子高度动态区域的肽段氘交换速率非常快，而来自结构有序区域的肽段则交换缓慢。因此，HDX 速率可反映酶局部的构象动力学特征。在不同配体存在下，氘摄取水平的变化可用于绘制配体结合位点、鉴定别构网络，并阐明构象动力学在酶功能中的作用。本文中，我们展示了如何利用 HDX-MS 更深入地理解一类称为羊毛硫肽（lanthipeptides）的肽类天然产物的生物合成过程。羊毛硫肽是由基因编码的肽，经由大型、多功能且构象动态的酶在翻译后修饰生成，这类酶难以通过传统的结构生物学方法进行研究。HDX-MS 为探究此类酶的机制特性提供了一个理想且灵活的平台。

引言

蛋白质是具有结构动态性的分子，可在从飞秒级化学键振动到整个蛋白质结构域重排（可能持续数秒）的时间尺度上采样不同的构象¹。这些构象波动通常是酶/蛋白质功能的关键组成部分。例如，配体结合诱导的构象变化对于调节酶功能往往至关重要，其作用机制包括：有序排列催化反应所需的活性位点残基、在连续动力学机制中定义底物结合位点、屏蔽反应中间体免受环境影响，或通过别构网络调节酶的功能。最近的研究还表明，构象动力学在进化过程中可能具有保守性，且保守的分子运动受到扰动时，可能与底物特异性的改变以及新酶功能的出现相关^2,3。

近年来，氢氘交换质谱法（HDX-MS）迅速发展成为一种强大的技术，可用于研究蛋白质构象变化如何响应配体结合或诱变等扰动^4,5,6,7。在典型的HDX-MS实验中（图1），将目标蛋白质置于用D₂O配制的缓冲液中，从而触发溶剂可交换的质子被氘取代。肽键中酰胺基团的交换速率强烈依赖于pH值....

方案

1. 氘代试剂和酶储备液的制备

1. 准备进行氢氘交换（HDX）反应所需的试剂（包括缓冲液、盐类、底物、配体等），用 D₂O（氘原子分数为 99.9%）配制成 100−200 倍浓缩的储备液。每种缓冲液储备液至少准备 50 mL。
   注意：在对 HalM2 进行表征时，配制了以下溶液：500 mM MgCl₂、100 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP）、750 mM ATP（溶于 HEPES 缓冲液）、800 mM HEPES pD 7.1、500 µM HalA2 和 500 mM AMPPNP。
2. 将储备液冷冻并完全冻干。
3. 用 D₂O 重新溶解，并至少再重复一次冻干循环，以尽可能将可交换的质子替换为氘核。
4. 使用浓 NaOD/DCl 将氘代 HEPES 缓冲液储备液的 pD 调整至所需值，同时注意以下关系²⁷：
   
   注意：酰胺氢氘交换速率强烈依赖于溶液的 pL 值（pL = pH 或 pD）⁵。不同批次的缓冲液储备液必须以完全相同的方式配制、储存和使用，以....

结果

必须评估每组样品进样时蛋白酶解的质量以及实验流程的可重复性。因此，在进行氢氘交换质谱（HDX-MS）分析之前，必须首先建立针对目标蛋白的有效酶解条件、利用反相液相色谱和气相离子淌度分离肽段的条件，以及利用质谱（MS）检测肽段的条件。为此，应首先检测目标蛋白的参考样品（在无氘条件下采集）（第3节）。图3A−C中的色谱数据显示了HalM2类羊毛硫肽合成酶三种参考样品的总离子色谱图（TIC）。TIC是指在质谱扫描所包含的所有m/z值范围内，所有离子计数总和随时间的变化情况。图3D−F展示了TIC在3至8分钟区间内的放大视图。图3G−I所示的质谱图是对每个TIC在一小段时间区间内（5.0至5.1分钟）所有质谱图的累加结果。应特别关注图3中的以下特征。

首.......

讨论

本方案中介绍的氢氘交换质谱（HDX-MS）工作流程为绘制蛋白质中结构动态元件的空间分布，以及研究这些动态在外界扰动（如配体结合、酶突变等）下的变化提供了极为稳健的平台。相较于其他常用于研究构象动态的结构生物学方法，HDX-MS具有若干显著优势。最突出的是，所需蛋白样品量极少。采用本文所述的工作流程，1 mL浓度为1 µM的蛋白样品即可满足三次重复实验，每次实验包含5个氢氘交换时间点。此外，该方法对目标蛋白的分子量几乎没有限制，蛋白复合物同样适用于HDX-MS分析。其实际限制仅在于胃蛋白酶消化产生的肽段在色谱分离中的分辨能力，以及在质荷比（m/z）和离子迁移率维度上的分辨能力。因此，对于许多蛋白质或蛋白复合物，HDX-MS可提供有关蛋白-蛋白相互作用界面、配体结合位点、构象动态及别构网络的宝贵信息。最后，氢氘交换反应在温和、接近天然的条件下进行，无需对蛋白进行位点特异性标记或工程化改造，有助于保持蛋白的天然活性。该方法的主要局限性（就其对目标蛋白提供的机制性信息而言）在于，肽段水平的HDX数据本身空间分辨率较低。因此，此类数据足以推断二级结构是否发生变化，但要全面解读结构扰动的机制性影响，仍需借助更高分辨率的结构技术（如核磁共振、冷冻电镜.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)	BioBasic	NA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k 离心过滤装置 (Millipore)	Milipore Sigma	UFC501096
乙腈	Fisher	A955-1
AMP-PNP	SIGMA	A2647-25MG
ATP	SIGMA	a2383-5G
D2O	ALDRICH	435767-100G
甲酸	Thermo Fisher	28905
盐酸胍	VWR	97063-764
HEPES	Fisher	BP310-1
氯化镁	SiGMA-Aldrich	63068-250G
氯化钾	BioBasic	PB0440
磷酸钾	BioBasic	PB0445
TCEP 盐酸盐	TRC Canada	T012500	肽由请求合成
材料/设备名称	公司	目录编号	备注/说明
软件
Deuteros	Andy M C Lau, et al	version 1.08
DynamX	Waters	version 3.0
MassLynx	Waters	version 4.1
Protein Lynx Global Server (PLGS)	Waters	version 3.0.3
PyMOL	Schrödinger	version 2.2.2
材料/设备名称	公司	目录编号	备注/说明
仪器与设备
ACQUITY UPLC BEH C18 分析柱	Waters	186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard 保护柱	Waters	186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX 系统	Waters
HDX Manager	Waters
微型pH电极	Thermo Fisher	13-620-291
Waters Enzymate BEH 柱或胃蛋白酶柱	Waters	186007233
Waters Synapt G2-Si	Waters