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方法文章

一种用于研究肽类生物合成酶的氢-氘交换质谱（HDX-MS）平台

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DOI：

10.3791/61053

⸱

2020年5月4日

 , 
1Department of Chemistry, McGill University

本文内容

摘要

兰肽合成酶在肽类天然产物的生物合成过程中催化多步反应。本文介绍了一种连续的自下而上的氢氘交换质谱（HDX-MS）工作流程，可用于研究兰肽合成酶以及其他参与肽类天然产物生物合成的类似酶的构象动态。

摘要

氢-氘交换质谱法（HDX-MS）是一种用于酶构象变化及酶-底物相互作用生物物理表征的强有力方法。HDX-MS 具有诸多优势，仅需消耗少量样品，可在接近天然条件的环境中进行，无需对酶或底物进行标记，并且能够提供空间分辨的酶构象动力学信息——即使对于大型酶分子和多蛋白复合物也同样适用。该方法通过将目标酶稀释至以 D2O 配制的缓冲液中启动，从而触发肽键酰胺基团中的氢（N-H）与氘（N-D）发生交换。在设定的交换时间点，取出反应等分试样并进行淬灭，随后将酶蛋白酶解为肽段，肽段通过超高效液相色谱（UPLC）分离，并由质谱（MS）记录各肽段因氢-氘交换引起的质量变化。每个肽段的氘摄取量高度依赖于其局部的氢键环境：位于酶分子高度动态区域的肽段氘交换速率非常快，而来自结构有序区域的肽段则交换缓慢。因此，HDX 速率可反映酶局部的构象动力学特征。在不同配体存在下，氘摄取水平的变化可用于绘制配体结合位点、鉴定别构网络，并阐明构象动力学在酶功能中的作用。本文中，我们展示了如何利用 HDX-MS 更深入地理解一类称为羊毛硫肽（lanthipeptides）的肽类天然产物的生物合成过程。羊毛硫肽是由基因编码的肽，经由大型、多功能且构象动态的酶在翻译后修饰生成，这类酶难以通过传统的结构生物学方法进行研究。HDX-MS 为探究此类酶的机制特性提供了一个理想且灵活的平台。

引言

蛋白质是具有结构动态性的分子，可在从飞秒级化学键振动到整个蛋白质结构域重排（可能持续数秒）的时间尺度上采样不同的构象1。这些构象波动通常是酶/蛋白质功能的关键组成部分。例如，配体结合诱导的构象变化对于调节酶功能往往至关重要，其作用机制包括：有序排列催化反应所需的活性位点残基、在连续动力学机制中定义底物结合位点、屏蔽反应中间体免受环境影响，或通过别构网络调节酶的功能。最近的研究还表明，构象动力学在进化过程中可能具有保守性，且保守的分子运动受到扰动时，可能与底物特异性的改变以及新酶功能的出现相关2,3。

近年来，氢氘交换质谱法（HDX-MS）迅速发展成为一种强大的技术，可用于研究蛋白质构象变化如何响应配体结合或诱变等扰动4,5,6,7。在典型的HDX-MS实验中（图1），将目标蛋白质置于用D2O配制的缓冲液中，从而触发溶剂可交换的质子被氘取代。肽键中酰胺基团的交换速率强烈依赖于pH值、局部氨基酸序列以及酰胺所处的局部结构环境8。参与氢键相互作用的酰胺（如存在于α-螺旋和β-折叠中的酰胺）比暴露于溶剂中的无规卷曲区域的酰胺交换更慢。因此，氘摄取程度反映了酶的结构特征。对于具有构象动态性或在配体结合时发生结构转变的酶，预期会产生可测量的HDX响应。

结构化酰胺缓慢交换速率的机理基础如图25,8,9所示。为了发生氢氘交换（HDX），结构化区域必须首先瞬时采样一种去折叠构象，从而使催化HDX通过特定酸/碱化学机制的溶剂分子能够接触到可交换的酰胺质子。最终，实验中测得的HDX速率由化学交换速率（kchem）与折叠及去折叠速率（kopen 和 kclose）的相对大小决定5,8。根据这一简单的动力学模型，氘代摄取程度将反映底层的构象动力学特性（由 kopen 和 kclose 定义）。大多数HDX-MS实验采用“自下而上”（bottom-up）的工作流程：在完成交换反应后，目标蛋白质被消化为肽段，并通过质量增加来测量每个肽段的氘代摄取量7。通过这种方式，HDX-MS能够在肽段的局部空间尺度上定位酶构象动力学的扰动，使研究人员能够评估该扰动如何改变目标酶不同区域的动力学行为。

HDX-MS 方法在阐明蛋白质结构动力学方面的优势众多。首先，该方法仅需少量天然蛋白质即可开展实验，也可用于具有四级结构的蛋白质复合物体系10。只要自下而上的 HDX-MS 工作流程能够提供足够数量且可靠鉴定的肽段，覆盖目标蛋白质序列，那么用于检测的酶制剂甚至无需高度纯化11,12。此外，HDX-MS 可在接近天然条件下提供有关构象动力学的信息，且无需像单分子荧光研究那样进行位点特异性蛋白质标记13；同时，该方法对所研究蛋白质或蛋白质复合物的大小没有限制（而核磁共振[NMR]波谱学等方法则面临挑战）7,14。最后，时间分辨的 HDX-MS 方法可用于研究内在无序蛋白质，这类蛋白质难以通过X射线晶体学进行分析15,16,17,18。HDX-MS 的主要局限性在于其数据的空间分辨率较低。HDX-MS 数据有助于指出构象动力学发生变化的区域，并揭示耦合的构象变化，但通常难以深入阐明驱动这些变化的精确分子机制。近年来，电子捕获解离技术与蛋白质 HDX-MS 数据相结合的研究已展现出将氢氘交换位点定位至单个氨基酸残基的潜力19，但通常仍需后续的生物化学和结构研究来进一步明确 HDX-MS 数据所提出的结构模型。

以下详细介绍了一种氢氘交换质谱（HDX-MS）分析方法的建立流程20。下文所述的样品制备方案通常适用于在水相缓冲液中具有良好溶解性的任何蛋白质。对于需要在去垢剂或磷脂存在条件下进行分析的蛋白质，已有更专业的样品制备方法和HDX-MS工作流程可供参考21,22,23,24。HDX-MS数据采集的仪器参数是针对配备液相色谱系统的高分辨四极杆飞行时间质谱仪（quadrupole time-of-flight mass spectrometer）进行描述的。类似复杂程度和分辨率的数据也可在多种市售的液相色谱-质谱联用（LC-MS）系统上获得。本文还提供了使用商业化软件包进行数据处理的关键步骤。我们同时给出了与HDX-MS研究领域广泛认可的建议相一致的数据采集与分析指南12。所描述的实验方案用于研究HalM2的动态结构特性，HalM2是一种兰肽合成酶，可催化抗菌肽天然产物的多步成熟过程20。我们展示了HDX-MS如何揭示此前未被表征的底物结合位点及别构特性。近年来已有若干关于蛋白质HDX-MS的其他实验方案发表25,26。结合本研究内容，这些前期工作应为读者在实验设计方面提供一定的灵活性。

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方案

1. 氘代试剂和酶储备液的制备

  1. 准备进行氢氘交换（HDX）反应所需的试剂（包括缓冲液、盐类、底物、配体等），用 D2O（氘原子分数为 99.9%）配制成 100−200 倍浓缩的储备液。每种缓冲液储备液至少准备 50 mL。
    注意：在对 HalM2 进行表征时，配制了以下溶液：500 mM MgCl2、100 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP）、750 mM ATP（溶于 HEPES 缓冲液）、800 mM HEPES pD 7.1、500 µM HalA2 和 500 mM AMPPNP。
  2. 将储备液冷冻并完全冻干。
  3. 用 D2O 重新溶解，并至少再重复一次冻干循环，以尽可能将可交换的质子替换为氘核。
  4. 使用浓 NaOD/DCl 将氘代 HEPES 缓冲液储备液的 pD 调整至所需值，同时注意以下关系27：
    figure-protocol-1
    注意：酰胺氢氘交换速率强烈依赖于溶液的 pL 值（pL = pH 或 pD）5。不同批次的缓冲液储备液必须以完全相同的方式配制、储存和使用，以避免实验间出现轻微的 pL 漂移。
  5. 计算一次 300 µL HDX 测定所需各试剂的用量，并分装成单次使用量，于 -80 °C 保存。
  6. 使用离心过滤装置（材料表）或等效设备，用质子化酶储存缓冲液配制浓缩的酶储备液（浓度约为 100−200 µM）。
    注意：具体缓冲液和离心过滤器的分子量截留值取决于目标蛋白/酶。HalM2 储存于 50 mM HEPES（pH 7.5）、100 mM KCl 和 10% 甘油中。制备浓缩酶时使用了 10 kDa 滤膜。
  7. 将酶分装成单次使用量，于 -80 °C 保存。
    注意：此处可作为暂停点。第 1 节中描述的所有储备液均可在 HDX 反应前预先配制。若保存于 -80 °C，大多数酶和氘代储备液可稳定保存数月。

2. HDX 淬灭体积的校准

  1. 使用第1节中制备的氘代试剂和浓缩酶原液，在 D2O 中配制300 µL的HDX反应液。
    1. 终浓度酶用量为1−5 µM。
    2. 终浓度氘代HEPES缓冲液浓度至少为50−100 mM。
    3. 确保其他组分的浓度足以维持酶所需的活性/功能。
  2. 配制1 L的HDX淬灭溶液（100 mM磷酸盐，0.8 M盐酸胍，pH 1.9）。将其分装为50 mL（用于长期储存）和1 mL（用于单次使用）的分装样品并冷冻保存。
    注意：淬灭缓冲液的确切组成取决于在自下而上HDX-MS工作流程的蛋白水解步骤（步骤3.3.3）中所使用的酶。此处提供的淬灭缓冲液适用于最常用的蛋白酶——胃蛋白酶。若使用其他蛋白酶，请咨询蛋白酶供应商以确认缓冲液的兼容性。
  3. 校准所需淬灭缓冲液体积，使淬灭后的HDX反应混合物的最终pL值调整至pH计读数为2.3。
    注意：肽段酰胺N-H键的溶剂H/D交换速率是pH依赖性过程，受酸催化和碱催化共同影响。在pH 2.5时（对于50:50 H2O:D2O混合体系，pH计读数为2.3）交换速率达到最低。因此，将最终pL值控制在接近2.5可最大限度减少自下而上LC-MS分析过程中发生的氢回交换，从而保留肽段中的氘标记。
    1. 取50 µL步骤2.1中的HDX反应混合物与50 µL淬灭缓冲液混合，并使用微电极测量淬灭后混合物的pL值。
    2. 根据需要增加淬灭缓冲液的体积，使最终pH计读数达到2.3。
    3. 确定合适的淬灭体积后，使用来自HDX反应（步骤2.1）的新鲜50 µL分装样品重复多次淬灭操作，以确保加入固定量的淬灭缓冲液后能获得一致的最终pL值。

3. 参考样品的制备及自下而上LC-MS工作流程的优化

  1. 以0.5 mL离心管制备目标蛋白的非氘代参考样品，每组三个重复。确保最终反应混合物的条件与真实HDX反应中使用的条件完全相同（步骤2.1），唯一区别是反应使用H2O配制，并且试剂储备液也使用H2O配制。
  2. 按照步骤2.3的方法，通过加入适量淬灭缓冲液将最终pH值调节至2.5，对样品进行淬灭。将样品在液氮中快速冷冻，并在-80 °C下保存，直至准备进行分析。
  3. 采用自下而上（bottom-up）的液相色谱-质谱（LC-MS）工作流程分析质子化酶参考样品。
    注意：在执行这些步骤之前，应确保用于数据采集的LC-MS系统已正确校准并可正常使用。自下而上LC-MS工作流程中所有步骤的时间和温度必须严格控制，以尽量减少样品间回交换（back exchange）的差异。使用本方案中所述的质谱仪器（材料表和支持信息），大多数步骤可通过仪器软件进行控制。为确保获得精确的重复数据，建议尽可能自动化工作流程中的各个步骤。
    1. 从冰箱中取出一份酶参考样品（按步骤3.2制备），在37 °C水浴中解冻1分钟。
    2. 在从冰箱取出样品并开始解冻后的精确第2分钟，将40 µL淬灭后的参考样品注入超高效液相色谱（UPLC）柱（2.1 x 30 mm，300 Å，5 µM），该色谱柱的固定相以胃蛋白酶（一种耐酸性蛋白酶）功能化修饰。
    3. 以100 µL/min的流速，在15 °C条件下使用含0.1%甲酸的H2O（pH = 2.5）作为流动相，对样品进行3分钟的消化。
    4. 当肽段从胃蛋白酶柱洗脱时，将其收集至一个保持在0.4 °C的C18捕获柱上，以最小化回交换。
    5. 将脱盐后的肽段从捕获柱转移至一根保持并运行在0.4 °C的C18分析柱（1 mm x 100 mm，1.7 µM，130 Å），用于分离肽段。
      注意：步骤3.3.3−3.3.5可通过某些用于HDX-MS数据采集的LC-MS系统实现自动化。或者，这些步骤也可独立操作，但需注意每一步的时间和温度必须严格控制，以实现稳定且较低的回交换水平。
    6. 使用乙腈/水/0.1%甲酸溶剂体系对C18柱进行梯度洗脱。针对目标蛋白优化LC梯度，以最大程度分离肽段并保留肽段中的氘标记。
      注意：梯度洗脱的具体参数详见支持信息。
    7. 对肽段消化产物进行电喷雾电离（ESI）质谱分析。
      注意：支持信息中提供的电离源条件足以使大多数肽段实现充分电离。
      1. 肽段在质谱仪中电离后，使用氮气作为缓冲气体进行气相离子淌度分离，以提高方法的峰容量。
      2. 在离子淌度分离之后，对肽段前体离子采用MSE工作流程，交替进行低碰撞能量（4 V）和高碰撞能量（21−40 V）的扫描周期。
        注意：交替使用低和高碰撞能量模式，可同时采集MS数据（低碰撞能量）和MSMS数据（高碰撞能量）。这使得前体离子与其相应的碎片离子之间能够实现时间相关性匹配，该匹配对于第4节中所述的肽段可靠鉴定至关重要。
      3. 使用分辨能力至少为20,000的质量分析器检测肽段前体离子和碎片离子。
      4. 在数据采集的同时，同步采集[Glu-1]-纤维蛋白肽B（GluFib）外部标准品的MS数据。
        注意：步骤3.3.7中描述的MS工作流程称为MSE方案。支持信息中提供了适用于自下而上HDX-MS分析的完整MSE方案仪器设置。
    8. 评估LC-MS数据的质量。
      注意：采用上述方案及支持信息中提供的仪器设置，参考样品应产生总离子色谱图，其最大信号强度约为1 x 108。在3−9分钟之间应有大量肽段洗脱（图3A−C）。
    9. 注入40 µL空白样品（水中含0.1%甲酸）以清洗胃蛋白酶柱和C18分析柱。
      注意：通常情况下，2−3次空白运行已足够。
    10. 对三个重复的参考蛋白样品分别重复执行步骤3.3.1−3.3.9。

4. 参考数据的处理及肽段列表的定义

  1. 分析原始质谱数据E 数据（步骤 3.3.7）使用蛋白质组学软件（材料清单）。使用蛋白质组学软件，导航至 文库 | 蛋白质序列数据库 通过导入目标蛋白的氨基酸序列来定义蛋白质数据库。
    注意：此步骤的目的是在参考质谱数据中搜索来源于目标蛋白的胃蛋白酶肽段，并利用同时获取的串联质谱（MSMS）数据验证任何假定肽段的鉴定结果。
  2. 为感兴趣的蛋白质序列命名。导入蛋白质序列（FASTA 格式）。软件将对数据库中的蛋白质进行计算机模拟消化，生成用于搜索 LC-MS 数据的肽段列表。
  3. 定义处理参数（位于下方） 文库 菜单）。选择 电喷雾质谱E 作为数据采集类型。在 电荷2的锁定质量 领域，输入 785.8426 对于质荷比（m/z）为2的情况+ [Glu-1]-纤维蛋白肽B（GluFib）的离子化及点击 完成.
  4. 定义 工作流程 参数（位于下方） 文库 菜单）。
    1. 选择 电喷雾质谱E 搜索类型。在下方 工作流程 | 数据库检索查询 标题：选择第4.2步中创建的蛋白质数据库 数据库 领域
    2. 改变 初级消化试剂 非特异性，并清除 固定修饰试剂 通过握住该区域 Ctrl 单击时按下按钮 羧甲基化半胱氨酸.
  5. 通过导航指定输出目录 选项 | 自动化设置 | 身份鉴定 E. 勾选以下方框 Apex 3D 与 Peptide 3D 输出 和 离子计数输出 并指定目标目录。
  6. 处理参考样本数据。
    1. 在蛋白质组学平台工作区的左侧工具栏中，通过右键单击创建一个新板 微量滴定板在微孔板中高亮选中三个孔（对应第3节中采集的每个参考样本各一个孔）。左键单击一个孔，按住并拖动至三个孔。
    2. 右键单击并选择 添加原始数据在出现的窗口中，浏览至包含第3节中三个参考文件的目录，并同时选中这些文件。
    3. 点击 下一步 并选择在步骤 4.3 中定义的处理参数。点击 下一步 并选择第 4.4 步中定义的工作流程参数。然后单击 完成.
  7. 当原始数据、处理参数和工作流程参数已分配至板上的每个孔后，这些孔将显示为蓝色。选择相应孔，右键单击并选择 处理最新原始数据单击窗口右下角以跟踪数据处理进度。当消息 没有要运行的任务 出现时，表示处理已完全完成。
  8. 数据处理完成后，培养板中的孔将变为绿色。右键单击孔，然后选择 查看工作流结果每个参考数据文件将打开一个独立的窗口。
  9. 检查数据，以确保参考样本数据中的大部分质谱信号已成功匹配到目标蛋白经计算机模拟消化所预测的肽段。在输出的谱图中，已匹配的肽段将显示为蓝色。图4）。双击 OK滤光片 并检查覆盖率是否大于 99%。
    注意：处理后，数据输出将自动保存为带有文件扩展名的文件（原始数据文件名在步骤4.5中指定的目录中生成_IA_final_peptide。
  10. 将蛋白质组学软件的输出结果导入氢氘交换数据处理软件（HDX-processing software）材料表）以进行额外的阈值处理。
    1. 点击 数据 位于 HDX-处理软件窗口的左上角。单击 导入 PLGS 结果 点击添加图标，然后通过导航至相应目录，选择步骤 4.9 中处理过的数据文件。
    2. 点击 下一步 并设置以下参数：连续离子数最小值 ≥ 2，质量误差 = 5 ppm，文件阈值 = 3。点击 完成.
  11. 当对阈值参数满意后，保存氢氘交换（HDX）项目。所有HDX数据将被导入该项目以进行分析和展示。
    注意：下一节中所述的氘代交换样品需采用完全相同的液相色谱-质谱（LC-MS）流程进行处理。因此，在开展氢氘交换（HDX）实验（第5节）之前，应确保样品制备（第2节）、自下而上（bottom-up）液相色谱-质谱流程（第3节）以及数据处理流程（第4节）能够为目标蛋白提供理想的重复性和序列覆盖度。若上述任一流程需调整以提高覆盖度，建议返回第2.1步，重新制备三份新鲜的参照样品，并重复第2–4节的操作（同时对实验方案进行必要的调整），以确保每个肽段均可被稳定生成并检测。

5. 进行氢氘交换反应

  1. 准备进行氢氘交换（HDX）反应的工作区域。
    1. 将淬灭缓冲液预先分装至正确标记的0.5 mL离心管中。每种时间点、每个重复样本以及每种待分析的生化状态均需准备独立的离心管。使用步骤2.2中所需的适当体积的淬灭缓冲液，以确保HDX反应中50 µL样品部分的最终pH计读数为2.3。
    2. 短暂离心0.5 mL离心管，使所有淬灭缓冲液沉降至管底。将离心管置于冰上。
    3. 用液氮填充一个小杜瓦瓶，并将其放置在工作区附近。
  2. 准备HDX反应。确保反应体系具有足够的体积，以采集所需数量的交换时间点（每个目标时间点需取一个50 µL的等分试样）。在时间尺度上跨越3−4个数量级，至少采集4−5个时间点（例如，15秒、60秒、300秒[5分钟]、1,800秒[30分钟]和14,400秒[4小时]的淬灭时间可充分覆盖大多数酶的交换动力学）。
    1. 在D2O中预先混合步骤1.1中除酶以外的所有氘代组分。
    2. 针对每种待检测的生化状态（游离酶、酶+配体、酶+抑制剂等），至少进行三次重复的HDX反应。
    3. 在加入酶之前，将反应混合物置于25 °C恒温水浴中孵育10分钟。
      注意：酶应配制成高浓度储备液（约100−200 µM，见步骤1.6），以尽量减少向HDX检测体系中引入质子（protium）。
    4. 将酶加入至终浓度为1−5 µM时，启动计时器。使用200 µL移液器小心且快速地混匀溶液，确保酶在样品中均匀分布。
    5. 在目标交换时间点，从HDX反应体系中取出50 µL等分试样，并迅速且均匀地与预分装的冰上预冷淬灭缓冲液在0.5 mL离心管中混合。
      注意：混合体积和操作过程必须尽可能精确且可重复，以确保所有样品中迅速达到目标终淬灭pL值2.3。保持淬灭缓冲液处于冰上低温状态有助于在酶变性后最小化反向交换。
    6. 在HDX样品淬灭后立即盖紧管盖，并在液氮中快速冷冻。
    7. 继续采集时间点，直至所有检测完成，随后将样品转移至-80 °C冰箱中保存。
      注意：此步骤可作为暂停点。在采集完所有HDX时间点后，样品可在-80 °C长期保存，直至进行LC-MS分析。理想情况下，所有感兴趣的生化状态的三重重复HDX反应应在同一天完成。至少应确保同一生化状态的所有重复反应在同一天平行进行。
  3. 在采集完所有淬灭后的HDX时间点后，将样品送入按照步骤3.3所述优化的自下而上（bottom-up）LC-MS工作流程。以随机顺序进样HDX样品，并在样品之间插入适当数量的空白运行，以确保肽段残留（carry over）最小化。
    注意：HDX数据无需以MSE模式采集。因此，应从质谱扫描周期中移除高碰撞能量段（步骤3.3.7.2）。这是对步骤3.3所述工作流程唯一需要的修改。
  4. 在数据采集过程中评估HDX数据质量。
    1. 确保未氘代参考样品的总离子流色谱图中出现的色谱峰，在氘代样品中具有相同的保留时间（如图3D−F所示）。
    2. 确保在参考样品和氘代样品中对特定时间段求和的质谱图显示出氘代证据（即，在氘代样品中，单个肽段的同位素分布向更高的m/z值发生位移[图6]）。

6. 处理 HDX 数据

  1. 通过点击顶部工具栏中的 数据 | 质谱文件，将 HDX 数据导入到步骤 4.11 中创建的 HDX 项目中。
    1. 根据需要点击 新建状态 和 新建暴露时间，以分别定义与分析相关的生化状态（例如，游离酶、酶+配体等）和氘暴露时间。
    2. 点击 新建原始数据 以选择待分析的 HDX 数据文件。为导入的每个原始数据文件分配相应的交换时间和生化状态。
      注意：数据可以批量导入和处理，也可以一次性全部导入。向项目中添加数据不会撤销该项目中先前已完成的任何分析。
  2. 数据文件添加完成后，点击 完成 以开始数据处理。短暂延迟后，软件将提示用户是否在继续之前保存数据。点击 是。
    注意：初始处理可能需要数小时，具体时间取决于待分析样本的数量、最终肽段列表中（步骤 4.10）的肽段数量、色谱窗口的大小以及质谱采集频率。
  3. 如有需要，可在 配置 菜单中修改处理参数，以调整离子搜索参数。请确保在同一项目中的所有数据使用相同的离子搜索参数。

7. HDX 数据的分析与可视化

注意：一旦原始数据的初步处理完成（步骤 6.2），HDX 处理软件将已在所分析的每个原始数据文件中定位到肽段列表（步骤 4.10 生成）中的肽段。当某肽段的同位素分布在原始数据文件中被定位后，HDX 处理软件会用“竖线”表示该肽段的每一个同位素（如图 6C−E所示）。随后，利用给定肽段各竖线的相对强度，计算其相对于参考谱图的氘代摄取量。尽管 HDX 处理软件在为大多数肽段正确分配竖线方面表现良好，但仍需进行大量人工校验以确保氘代摄取值的准确性。

  1. 分析肽段的氘代摄取值
    1. 在肽段列表中选择第一个肽段，并从 视图 菜单中打开堆叠光谱图。在堆叠光谱图窗口中上下滚动，查看所选肽段在不同氘代交换时间下的质谱图（图7D,E）。
    2. 根据需要通过鼠标点击分配或取消分配峰（sticks），以确保已在数据中正确定位同位素分布，并且每个同位素峰均已分配（已分配的峰将显示为蓝色）。点击堆叠光谱图中的任意光谱（图7D,E），可在活动数据查看窗口（图7C）中进行峰的分配或取消分配。
    3. 通过切换堆叠光谱图窗口顶部的电荷态，检查每种电荷态下的峰分配情况。
    4. 对每种感兴趣的生化状态重复步骤 7.1.1−7.1.3。生化状态也可在堆叠光谱图窗口顶部进行切换。为获得最准确的氘代摄取差异测量结果，应确保每种生化状态下的相同电荷态集合均已完成峰分配。
    5. 对肽段列表中的每个肽段重复步骤 7.1.1−7.1.4。
    6. 使用覆盖率图检查肽段氘代摄取值的标准偏差。
      1. 从 视图 菜单中打开覆盖率图，该图将肽段列表中的每个肽段沿目标蛋白的氨基酸序列进行映射（图8C）。根据相对标准偏差（单位为 Da）对肽段进行着色。
      2. 在图中目视查找相对标准偏差较高的异常肽段。在覆盖率图中点击这些异常肽段，可将目标肽段加载至堆叠光谱图（图8B）和数据查看窗口（图8A）中。
      3. 利用堆叠光谱图，仔细检查异常肽段的所有电荷态和所有时间点是否均已正确分配峰。
        注：通常情况下，标准偏差较大（>0.3 Da）的肽段是由于软件未能正确分配其同位素峰所致（如 图8B 所示）。补充分配缺失的峰通常可将肽段的相对标准偏差降低至 <0.3 Da。
      4. 若无法将相对标准偏差降低至 0.3 Da 以下，则将该肽段从列表中隐藏。
  2. 导出两种生化状态之间的氢氘交换（HDX）差异数据，并映射到目标蛋白的结构模型上。
    1. 在覆盖率图中显示感兴趣的差异。右键点击覆盖率图，将差异数据导出为 .csv 文件。通过主工具栏中的 数据 | 导出状态数据 导出状态数据（.csv 格式）。
      注：差异数据和状态数据文件的适当格式详见 支持信息。
    2. 将差异数据、状态数据以及目标蛋白的 pdb 文件导入 Deuteros28。选择 99% 置信区间，勾选 启用求和，并处理数据。
      注：运行 Deuteros 需要在计算机上安装 MATLAB。Deuteros 将利用数据集中的重复测量值计算每个肽段摄取数据的标准偏差。该标准偏差将用于定义显著交换的置信区间，并在图中显示。
    3. 在 PyMOL 选项下，选择 导出摄取数据 | 导出，生成一个 PyMOL 脚本，用于将显著交换差异区域映射到目标蛋白的 pdb 结构上。
      注：根据本实验方案所述的工作流程，特定肽段在单个时间点的显著氘代摄取差异的 99% 置信区间通常为 0.3−0.5 Da；在所有交换时间点上累加后的差异的 99% 置信区间通常为 0.7−1.0 Da。

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结果

必须评估每组样品进样时蛋白酶解的质量以及实验流程的可重复性。因此，在进行氢氘交换质谱（HDX-MS）分析之前，必须首先建立针对目标蛋白的有效酶解条件、利用反相液相色谱和气相离子淌度分离肽段的条件，以及利用质谱（MS）检测肽段的条件。为此，应首先检测目标蛋白的参考样品（在无氘条件下采集）（第3节）。图3A−C中的色谱数据显示了HalM2类羊毛硫肽合成酶三种参考样品的总离子色谱图（TIC）。TIC是指在质谱扫描所包含的所有m/z值范围内，所有离子计数总和随时间的变化情况。图3D−F展示了TIC在3至8分钟区间内的放大视图。图3G−I所示的质谱图是对每个TIC在一小段时间区间内（5.0至5.1分钟）所有质谱图的累加结果。应特别关注图3中的以下特征。

首...

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讨论

本方案中介绍的氢氘交换质谱（HDX-MS）工作流程为绘制蛋白质中结构动态元件的空间分布，以及研究这些动态在外界扰动（如配体结合、酶突变等）下的变化提供了极为稳健的平台。相较于其他常用于研究构象动态的结构生物学方法，HDX-MS具有若干显著优势。最突出的是，所需蛋白样品量极少。采用本文所述的工作流程，1 mL浓度为1 µM的蛋白样品即可满足三次重复实验，每次实验包含5个氢氘交换时间点。此外，该方法对目标蛋白的分子量几乎没有限制，蛋白复合物同样适用于HDX-MS分析。其实际限制仅在于胃蛋白酶消化产生的肽段在色谱分离中的分辨能力，以及在质荷比（m/z）和离子迁移率维度上的分辨能力。因此，对于许多蛋白质或蛋白复合物，HDX-MS可提供有关蛋白-蛋白相互作用界面、配体结合位点、构象动态及别构网络的宝贵信息。最后，氢氘交换反应在温和、接近天然的条件下进行，无需对蛋白进行位点特异性标记或工程化改造，有助于保持蛋白的天然活性。该方法的主要局限性（就其对目标蛋白提供的机制性信息而言）在于，肽段水平的HDX数据本身空间分辨率较低。因此，此类数据足以推断二级结构是否发生变化，但要全面解读结构扰动的机制性影响，仍需借助更高分辨率的结构技术（如核磁共振、冷冻电镜...

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致谢

本工作得到了加拿大自然科学与工程研究理事会、魁北克省自然与技术研究基金会、加拿大创新基金会以及麦吉尔大学启动资金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)BioBasicNA
0.5 mL Amicon Ultracel 10k 离心过滤装置 (Millipore)Milipore SigmaUFC501096
乙腈FisherA955-1
AMP-PNPSIGMAA2647-25MG
ATPSIGMAa2383-5G
D2OALDRICH435767-100G
甲酸Thermo Fisher28905
盐酸胍VWR97063-764
HEPESFisherBP310-1
氯化镁SiGMA-Aldrich63068-250G
氯化钾BioBasicPB0440
磷酸钾BioBasicPB0445
TCEP 盐酸盐TRC CanadaT012500肽由请求合成
材料/设备名称公司目录编号备注/说明
软件
DeuterosAndy M C Lau, et alversion 1.08
DynamXWatersversion 3.0
MassLynxWatersversion 4.1
Protein Lynx
Global Server (PLGS)		Watersversion 3.0.3
PyMOLSchrödingerversion 2.2.2
材料/设备名称公司目录编号备注/说明
仪器与设备
ACQUITY UPLC BEH C18 分析柱Waters186002346
ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard 保护柱Waters186003978
ACQUITY UPLC M-Class HDX 系统Waters
HDX ManagerWaters
微型pH电极Thermo Fisher13-620-291
Waters Enzymate BEH 柱或胃蛋白酶柱Waters186007233
Waters Synapt G2-SiWaters

参考文献

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蛋白质构象动力学酶-底物相互作用超高效液相色谱质谱分析氘吸收量测定羊毛硫肽生物合成蛋白质结构表征
一种用于研究肽类生物合成酶的氢-氘交换质谱（HDX-MS）平台
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