电化学发光免疫分析法（ECLIA）是一种用于定量检测内源性和外源性MeCP2蛋白变体的新方法，可在较宽的工作范围内产生高度定量、准确且可重复的测量结果，且批内和批间误差较低。本文介绍了在96孔板格式中进行MeCP2-ECLIA的实验方案。
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摘要
摘要
电化学发光免疫分析法（ECLIA）是一种多功能方法，可在96孔板体系中定量内源性和重组蛋白的含量。为验证ECLIA的检测效率，本实验利用该方法分析了小鼠脑组织中MeCP2的本底表达水平以及TAT-MeCP2在人皮肤成纤维细胞中的摄取情况。MeCP2-ECLIA检测结果具有高度的准确性和可重复性，且板内和板间误差较低。综上所述，我们建立了一种可用于高通量筛选的MeCP2蛋白变异体定量分析方法。
引言
电化学发光免疫分析法（ECLIA）基于一种利用标记物在电化学刺激下产生发光的检测过程。该技术广泛应用于基础工业和学术研究、食品工业以及临床诊断中对生物分析物的定量检测1。通常使用带有碳墨电极的一次性96孔板，这些电极作为免疫分析的固相载体。二抗与电化学发光标记物偶联，当系统施加电流时，化学标记物被激发并发光。超低噪声电荷耦合器件（CCD）记录发光强度，该强度与捕获抗体结合的抗原量成正比，从而实现对样本中目标分析物的定量2。与酶联免疫吸附测定法（ELISA）相比，ECLIA具有更高的灵敏度和重复性，以及更优的自动化程度和一致性，因此被认为更具优势3。
本文利用新开发的电化学发光免疫分析法（ECLIA）系统，检测了人源和鼠源样本以及不同亚型的重组蛋白中甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）的水平。MeCP2是一种位于X染色体上的核酸结合蛋白，可与甲基化的DNA序列相互作用，参与基因表达的调控4,5。编码该蛋白的基因若发生功能缺失性突变，是导致Rett综合征（RTT）——一种严重的神经发育障碍疾病——的主要原因6。另一种与MeCP2相关的疾病——MECP2重复综....
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方案
已获得澳大利亚韦斯特米德儿童医院人类研究伦理委员会的批准，用于研究目的的皮肤活检样本采集。动物实验已获得奥地利联邦科学、研究和经济部的许可，并依照当地动物福利法规进行（批准编号：GZ: 66.009/0218-II/3b/2015）。
注意：电化学发光免疫分析系统（ECLIA）的原理如图1所示。
1. 抗体选择
- 评估多种 MeCP2 抗体的信噪比，确定在小鼠单克隆 MeCP2 一抗（克隆号 Mec-168）与兔多克隆 MeCP2 检测抗体（定制制备）组合下，信号强度最强且特异性最高的抗体组合。对于二抗，使用系统特异性的抗体（材料表），该抗体也经过实验验证。
注意：表1 概述了 MeCP2-ECLIA 开发过程中所有经过验证的抗体及其测试的稀释范围。
| 功能 | 名称 | 克隆号 |
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结果
ECLIA 系统的原理如图1所示。两种 MeCP2 亚型的标准曲线见图2。该方法可在较宽浓度范围（1−1,800 ng/mL）内实现准确定量。在图3中，分析了小鼠脑组织和人包皮成纤维细胞（HDFs）裂解物中的 MeCP2 水平。图3A比较了杂合子、野生型和敲除型小鼠脑核裂解物中 MeCP2 的表达水平，而在图3B中，使用 ECLIA 方法在 MECP2 缺陷的人成纤维细胞（c.806delG）中未检测到 MeCP2 蛋白。此外，还对 TAT-MeCP2 在 MECP2 缺陷细胞系（c.806delG）中的摄取随时间的变化进行了研究（图4）。最后，如表3所示，验证了检测的批间和批内精密度。
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讨论
为了检测内源性MeCP2、重组MeCP2以及TAT-MeCP2的水平，我们开发了一种96孔板电化学发光免疫分析法（ECLIA）。已有研究表明，MeCP2蛋白功能的丧失会导致Rett综合征（RTT）6，目前对该病的治疗仅限于症状管理和物理治疗。一种有前景的治疗策略是所谓的蛋白替代疗法，该方法可将MeCP2水平滴定至所需浓度12,13,14,15。过去二十年的研究已证实，TAT融合蛋白具有穿越血脑屏障的能力，并取得了成功12,13,14,15。因此，这种MeCP2递送方法可能在蛋白替代疗.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们非常感谢 Brigitte Sturm 博士在 ECLIA 仪器使用方面提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,4-二硫苏糖醇（DTT） | Sigma-Aldrich | D9779 | 低渗裂解试剂，提取缓冲液 |
| Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液 | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | 样品制备 |
| 检测抗体 SULFO-TAG 标记抗兔抗体 | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | 抗体 |
| Discovery Workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | 软件 | |
| DMEM（1×） | gibco by Life Technologies | 41966-029 | 样品制备 |
| Dulbecco’s PBS（无菌） | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | 样品制备，洗涤液，包被液 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | 提取缓冲液 |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | F9665 | 样品制备 |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | G2025 | 提取缓冲液 |
| 含表面活性剂的 Gold Read Buffer T（1×） | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA 实验方案 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | 低渗裂解试剂，提取缓冲液 |
| KIMBLE Dounce 组织研磨器套装 | Sigma-Aldrich | D8938 | 样品制备 |
| 实验室摇床，往复式（低速） | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA 实验方案 |
| 六水合氯化镁（MgCl·6H₂O） | Sigma-Aldrich | M2670 | 低渗裂解试剂，提取缓冲液 |
| MeCP2（人源）重组蛋白（P01） | Abnova Corporation | H00004204-P01 | 细胞处理 |
| Microseal B 密封膜 | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | 用于板密封 |
| 小鼠来源单克隆抗-MeCP2 抗体，克隆 Mec-168，纯化免疫球蛋白 | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | 抗体，包被液 |
| MSD 封闭剂 A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | 封闭剂 |
| MSD SECTOR 成像仪 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA 实验方案 |
| Multi-Array 96 孔板 | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA 实验方案 |
| 青霉素-链霉素 | gibco by Life Technologies | 15140122 | 样品制备 |
| 兔来源多克隆抗-MeCP2 抗体 | Eurogentec S.A. | 定制设计 | 抗体 |
| 氯化钾（KCl） | Merck KGaA | 1049361000 | 低渗裂解试剂 |
| 一抗小鼠抗-MeCP2（1B11） | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | 抗体 |
| 一抗小鼠抗-MeCP2（4B6） | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | 抗体 |
| 一抗小鼠抗-MeCP2（Mec-168） | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | 抗体 |
| 一抗小鼠抗-MeCP2（Men-8） | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | 抗体 |
| 一抗兔抗-MeCP2（D4F3） | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | 抗体 |
| 蛋白酶抑制剂混合物（100×） | Sigma-Aldrich | 8340 | 低渗裂解试剂，提取缓冲液 |
| 二抗兔抗-MeCP2 | Eurogentec S.A. | 定制 | 抗体 |
| 二抗兔抗-MeCP2 | Merck | 07-013 | 抗体 |
| 氯化钠（NaCl） | Sigma-Aldrich | S3014 | 提取缓冲液 |
| SULFO-TAG 标记抗兔抗体（山羊） | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | 抗体 |
| TAT-MeCP2 融合蛋白 | 实验室自制 | 细胞处理 | |
| 0.25%（1×）胰蛋白酶-EDTA | gibco by Life Technologies | 25200-056 | 细胞处理 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 洗涤液 |
参考文献
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electr....
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重印与许可
