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方法文章

一种基于电化学发光的MeCP2蛋白变体检测方法

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DOI：

10.3791/61054

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2020年5月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Genetics, Center for Pathobiochemistry and Genetics, Medical University of Vienna (MUV), 2Murdoch Children's Research Institute and Department of Paediatrics, University of Melbourne, Discipline of Child & Adolescent Health, Sydney Medical School, 3Department of Medical Chemistry and Pathobiochemistry, Medical University of Vienna

本文内容

摘要

电化学发光免疫分析法（ECLIA）是一种用于定量检测内源性和外源性MeCP2蛋白变体的新方法，可在较宽的工作范围内产生高度定量、准确且可重复的测量结果，且批内和批间误差较低。本文介绍了在96孔板格式中进行MeCP2-ECLIA的实验方案。

摘要

电化学发光免疫分析法（ECLIA）是一种多功能方法，可在96孔板体系中定量内源性和重组蛋白的含量。为验证ECLIA的检测效率，本实验利用该方法分析了小鼠脑组织中MeCP2的本底表达水平以及TAT-MeCP2在人皮肤成纤维细胞中的摄取情况。MeCP2-ECLIA检测结果具有高度的准确性和可重复性，且板内和板间误差较低。综上所述，我们建立了一种可用于高通量筛选的MeCP2蛋白变异体定量分析方法。

引言

电化学发光免疫分析法（ECLIA）基于一种利用标记物在电化学刺激下产生发光的检测过程。该技术广泛应用于基础工业和学术研究、食品工业以及临床诊断中对生物分析物的定量检测1。通常使用带有碳墨电极的一次性96孔板，这些电极作为免疫分析的固相载体。二抗与电化学发光标记物偶联，当系统施加电流时，化学标记物被激发并发光。超低噪声电荷耦合器件（CCD）记录发光强度，该强度与捕获抗体结合的抗原量成正比，从而实现对样本中目标分析物的定量2。与酶联免疫吸附测定法（ELISA）相比，ECLIA具有更高的灵敏度和重复性，以及更优的自动化程度和一致性，因此被认为更具优势3。

本文利用新开发的电化学发光免疫分析法（ECLIA）系统，检测了人源和鼠源样本以及不同亚型的重组蛋白中甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）的水平。MeCP2是一种位于X染色体上的核酸结合蛋白，可与甲基化的DNA序列相互作用，参与基因表达的调控4,5。编码该蛋白的基因若发生功能缺失性突变，是导致Rett综合征（RTT）——一种严重的神经发育障碍疾病——的主要原因6。另一种与MeCP2相关的疾病——MECP2重复综合征，也会引起与RTT相似的神经系统症状7。值得注意的是，RTT主要影响女性，而MECP2重复综合征则主要发生在男性6,7。

这些疾病分别与中枢神经系统（CNS）中MeCP2水平不足或过量相关。因此，针对雷特综合征（RTT）且旨在提高CNS中MeCP2水平的治疗策略，必须避免MeCP2过量所带来的有害影响7。正因如此，利用ECLIA系统对MeCP2蛋白水平进行高灵敏度和高准确性的定量，对于推进RTT以及MECP2重复综合征的研究至关重要。本研究展示了来自人源细胞系、小鼠组织样本中的内源性和外源性MeCP2水平的精确定量结果，以及一种重组蛋白的定量分析；该重组蛋白包含人源MeCP2异构体B（也称为异构体e1）和一个最小N端HIV-TAT转导结构域（TAT-MeCP2），具有穿越血脑屏障的潜力8,9。

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方案

已获得澳大利亚韦斯特米德儿童医院人类研究伦理委员会的批准，用于研究目的的皮肤活检样本采集。动物实验已获得奥地利联邦科学、研究和经济部的许可，并依照当地动物福利法规进行（批准编号：GZ: 66.009/0218-II/3b/2015）。

注意：电化学发光免疫分析系统（ECLIA）的原理如图1所示。

1. 抗体选择

  1. 评估多种 MeCP2 抗体的信噪比，确定在小鼠单克隆 MeCP2 一抗（克隆号 Mec-168）与兔多克隆 MeCP2 检测抗体（定制制备）组合下，信号强度最强且特异性最高的抗体组合。对于二抗，使用系统特异性的抗体（材料表），该抗体也经过实验验证。
    注意：表1 概述了 MeCP2-ECLIA 开发过程中所有经过验证的抗体及其测试的稀释范围。
功能名称克隆号稀释比例
一抗小鼠抗-MeCP2Mec-1681:500−1:10,000
一抗小鼠抗-MeCP24B61:250−1:4,000
一抗小鼠抗-MeCP2Men-81:500−1:4,000
一抗小鼠抗-MeCP21B111:500−1:4,000
一抗兔抗-MeCP2D4F31:500−1:4,000
二抗兔抗-MeCP2多克隆1:2,000−1:20,000
二抗兔抗-MeCP2多克隆1:2,000−1:20,000
检测SULFO-TAG 标记的抗兔抗体多克隆1:500−1:1,000

表1：抗体列表及所用工作稀释度。

  1. 或者，使用每一对在常规ELISA中效果良好的MeCP2抗体。

2. 用TAT-MeCP2融合蛋白处理HDF细胞

注意：TAT-MeCP2 在大肠杆菌（Escherichia coli）中通过重组表达，并采用标准的层析技术进行纯化，具体方法见先前描述8，纯化产物储存于 -80 °C。

  1. 在100 mm培养皿中接种1 × 106个人类真皮成纤维细胞（HDF），于37 °C、5% CO2条件下培养过夜，直至细胞融合度达到约90%。
  2. 取出一管TAT-MeCP2融合蛋白，冰上融化并轻轻混匀。
  3. 将TAT-MeCP2用HDF培养基稀释至终浓度为500 nM，总体积为50 mL。
  4. 吸除100 mm培养皿中的培养基，加入500 nM TAT-MeCP2溶液，在37 °C孵育不同时间，最长可达24小时。
  5. 移除TAT-MeCP2溶液，用预热的Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞两次。
  6. 加入2 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，在37 °C处理5分钟10。
  7. 加入6 mL HDF培养基以终止胰酶消化，将细胞收集至15 mL离心管中。
  8. 在室温下以500 × g离心5分钟，沉淀细胞。
  9. 吸弃上清液，用预冷的DPBS洗涤细胞两次。将细胞沉淀置于冰上，随后进行样品制备。

3. 样品制备

  1. HDF 裂解物
    1. 根据 Suzuki 等人的方法11，采用 REAP 法进行细胞质和细胞核亚细胞组分的分离，以确定 MeCP2 蛋白水平的最高值。每次实验的分离样本数不得超过六个。
  2. 小鼠脑组织裂解物
    1. 分别配制 100 mL 的低渗裂解试剂和提取缓冲液。
      1. 低渗裂解试剂：将 10 mM HEPES、1.5 mM 氯化镁和 10 mM 氯化钾充分混合。
      2. 提取缓冲液：将 20 mM HEPES、1.5 mM 氯化镁、0.42 M 氯化钠、0.2 mM EDTA 和 25% (v/v) 甘油充分混合。
      3. 将两种缓冲液的 pH 值均调节至 7.9。
      4. 使用前新鲜加入 1 mM 二硫苏糖醇（DTT）和 1× 蛋白酶抑制剂混合物，并置于冰上预冷。
    2. 将 100 mg 总小鼠脑组织（品系：C57BL/6J，野生型雄性和雌性，以及 B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J，半合子雄性和杂合子雌性；年龄：4−8 周龄）悬浮于 1 mL 冰冷的低渗裂解试剂中。
    3. 使用预冷的全玻璃 Dounce 匀浆器，分别用 A 型杵（松散型，较大间隙）和 B 型杵（紧密型，较小间隙）各进行 15 次匀浆，以匀浆脑组织。
    4. 将匀浆后的细胞转移至洁净离心管中，在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 20 分钟。弃去上清液（或保留作为细胞质组分以供后续使用）。
    5. 每 100 mg 起始材料用 140 µL 提取缓冲液重悬沉淀。将离心管置于预冷的金属浴中，在 4 °C 轻柔混匀 30 分钟。
    6. 在 4 °C 条件下以 16,000 g 离心 10 分钟。将上清液（即核组分）转移至新的预冷离心管中，并于 -80 °C 保存备用。
      注：小鼠脑组织和 HDFs 来源的裂解物的蛋白浓度可通过 BCA 蛋白定量法测定。

4. MeCP2-ECLIA 检测方案

  1. 洗涤液、封闭缓冲液和检测稀释液的配制（第1天）
    1. 向1 L PBS中加入500 µL Tween 20，配制含0.05% Tween 20的PBS溶液，充分混匀，并标记为“洗涤液”。
      注意：确保仅使用新鲜配制的洗涤缓冲液。
    2. 配制含3% 封闭剂A（材料表）的磷酸盐缓冲液（PBS）。轻轻搅拌混匀，过滤除菌后置于冰箱中保存，最多可使用两周。
    3. 将5 mL封闭溶液加入10 mL PBS中，配制检测稀释液（含1% 封闭剂A的PBS）。
  2. 高吸附酶标板的包被
    1. 取出一块96孔单点高吸附多阵列酶标板。
      注意：高吸附酶标板比具有疏水表面的标准酶标板具有更高的结合容量和更宽的动态范围。
    2. 将单克隆小鼠抗MeCP2抗体置于冰上解冻，取0.67 µL抗体与4 mL PBS混合（PBS中抗体稀释比例为1:6,000）。涡旋振荡使抗体溶液充分混匀，并将该管标记为“包被液”。
    3. 使用多通道移液器，小心地将25 µL包被液加入每个孔的底部角落，此方法称为溶液包被法。轻轻敲击96孔板的每一侧，确保包被液覆盖每个孔的底部。
    4. 用自粘性铝箔密封酶标板，于4 °C冰箱中孵育过夜（12−16 h）。
  3. 封闭（第2天）
    1. 从冰箱中取出酶标板，撕去密封箔。
    2. 将孔内的抗体包被液甩入废液桶中，并将酶标板在纸巾上轻拍，以去除各孔中残留的包被液。
    3. 每孔加入125 µL封闭液。再次密封酶标板，并将其置于轨道微孔板摇床上。
    4. 在室温下以800 rpm持续振荡孵育90分钟。
  4. 标准品与样品的准备
    1. 在孵育期间，准备MeCP2和/或TAT-MeCP2蛋白标准品以及各种样品。
      注意：用于标准品稀释的裂解缓冲液必须与分析样品所用的裂解缓冲液相同。
    2. 从-80 °C冰箱中取出一瓶MeCP2和/或TAT-MeCP2蛋白储备液（250 µg/mL）、小鼠脑组织裂解物和HDF裂解物，置于冰上解冻。
    3. 根据表2在洁净离心管中稀释标准品储备液（MeCP2和/或TAT-MeCP2）。
    4. 用裂解缓冲液稀释样品如下：每25 µL裂解缓冲液中加入1−20 µg小鼠脑组织裂解物，或每25 µL裂解缓冲液中加入0.25−1 µg HDF裂解物。每种样品需准备足够体积，以完成三复孔检测。
标准品浓度稀释方法
标准品 11,800 ng/mL1.08 µL 标准品储备液 + 148.92 µL 裂解缓冲液
标准品 2600 ng/mL50 µL 标准品 1 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 3200 ng/mL50 µL 标准品 2 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 466.67 ng/mL50 µL 标准品 3 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 522.22 ng/mL50 µL 标准品 4 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 67.41 ng/mL50 µL 标准品 5 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 72.47 ng/mL50 µL 标准品 6 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 80.82 ng/mL50 µL 标准品 7 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 90.27 ng/mL50 µL 标准品 8 + 100 µL 裂解缓冲液
标准品 100 ng/mL150 µL 裂解缓冲液

表2：0至1,800 ng/mL的标准系列。

  1. 添加样品和标准品溶液
    1. 将封闭液甩入废液桶中，并将酶标板在纸巾上轻拍，以去除各孔中的全部封闭液。
    2. 用150 µL洗涤液洗涤酶标板3次，每次加入洗涤液后立即移除。
    3. 使用单通道移液器将25 µL标准品和样品加入孔的底部角落。
    4. 密封酶标板，并在室温下以800 rpm持续振荡孵育4小时。
  2. 未标记检测抗体
    1. 将多克隆兔抗MeCP2抗体置于冰上解冻。用检测稀释液将抗体按1:6,000比例稀释。
    2. 将标准品和样品甩入废液桶中，并将酶标板在纸巾上轻拍。
    3. 用150 µL洗涤液洗涤酶标板3次，每次加入洗涤液后立即移除。
    4. 使用多通道移液器向每孔中加入25 µL未标记检测抗体。密封酶标板，并在室温下以800 rpm持续振荡孵育1小时。
  3. 特异性偶联抗体
    1. 从冰箱中取出特异性二抗（材料表），置于冰上。用检测稀释液将抗体按1:666.67比例稀释，并轻轻混匀。
    2. 将未结合的未标记二抗甩入废液桶中，并将酶标板在纸巾上轻拍。
    3. 用150 µL洗涤液洗涤酶标板3次，每次加入洗涤液后立即移除。
    4. 使用多通道移液器向每孔中加入25 µL特异性偶联抗体（材料表）。密封酶标板，并在室温下以800 rpm持续振荡孵育1小时。
  4. 读板
    1. 将未结合的偶联抗体（材料表）甩入废液桶中，并将酶标板在纸巾上轻拍。
    2. 用150 µL洗涤液洗涤酶标板3次。
    3. 向酶标板中加入150 μL含表面活性剂的1x Tris基金读取缓冲液 （材料表），其中含有三丙胺作为发光反应的共反应物。采用反向移液技术以避免产生气泡。
    4. 将酶标板置于微孔板检测平台（材料表）上，并立即开始测量。使用96孔板检测的仪器设置。
    5. 通过电化学发光检测系统（材料表）内置的CCD相机采集电化学发光信号，并记录信号计数，该数值对应于相对光单位（RLU），且与光强度成正比。
      注：在电化学刺激下，结合于碳电极上的钌标记物在620 nm处发射发光信号。使用仪器配套软件（材料表）分析数据。

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结果

ECLIA 系统的原理如图1所示。两种 MeCP2 亚型的标准曲线见图2。该方法可在较宽浓度范围（1−1,800 ng/mL）内实现准确定量。在图3中，分析了小鼠脑组织和人包皮成纤维细胞（HDFs）裂解物中的 MeCP2 水平。图3A比较了杂合子、野生型和敲除型小鼠脑核裂解物中 MeCP2 的表达水平，而在图3B中，使用 ECLIA 方法在 MECP2 缺陷的人成纤维细胞（c.806delG）中未检测到 MeCP2 蛋白。此外，还对 TAT-MeCP2 在 MECP2 缺陷细胞系（c.806delG）中的摄取随时间的变化进行了研究（图4）。最后，如表3所示，验证了检测的批间和批内精密度。

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讨论

为了检测内源性MeCP2、重组MeCP2以及TAT-MeCP2的水平，我们开发了一种96孔板电化学发光免疫分析法（ECLIA）。已有研究表明，MeCP2蛋白功能的丧失会导致Rett综合征（RTT）6，目前对该病的治疗仅限于症状管理和物理治疗。一种有前景的治疗策略是所谓的蛋白替代疗法，该方法可将MeCP2水平滴定至所需浓度12,13,14,15。过去二十年的研究已证实，TAT融合蛋白具有穿越血脑屏障的能力，并取得了成功12,13,14,15。因此，这种MeCP2递送方法可能在蛋白替代疗...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们非常感谢 Brigitte Sturm 博士在 ECLIA 仪器使用方面提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,4-二硫苏糖醇（DTT）Sigma-AldrichD9779低渗裂解试剂，提取缓冲液
Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液Bio-Rad Laboratories Inc.500-0006样品制备
检测抗体 SULFO-TAG 标记抗兔抗体Meso Scale DiagnosticsR32AB-1抗体
Discovery Workbench 4.0Meso Scale Discovery软件
DMEM（1×）gibco by Life Technologies41966-029样品制备
Dulbecco’s PBS（无菌）Sigma-AldrichD8537-500ML样品制备，洗涤液，包被液
EDTASigma-AldrichEDS提取缓冲液
胎牛血清Sigma-AldrichF9665样品制备
甘油Sigma-AldrichG2025提取缓冲液
含表面活性剂的 Gold Read Buffer T（1×）Meso Scale DiagnosticsR92TGMeCP2 ECLIA 实验方案
HEPESSigma-AldrichH3375低渗裂解试剂，提取缓冲液
KIMBLE Dounce 组织研磨器套装Sigma-AldrichD8938样品制备
实验室摇床，往复式（低速）GFL3014MeCP2 ECLIA 实验方案
六水合氯化镁（MgCl·6H₂O）Sigma-AldrichM2670低渗裂解试剂，提取缓冲液
MeCP2（人源）重组蛋白（P01）Abnova CorporationH00004204-P01细胞处理
Microseal B 密封膜Bio-Rad Laboratories Inc.MSB1001用于板密封
小鼠来源单克隆抗-MeCP2 抗体，克隆 Mec-168，纯化免疫球蛋白Sigma-AldrichM6818-100UL; RRID:AB_262075抗体，包被液
MSD 封闭剂 AMeso Scale DiagnosticsR93BA-4封闭剂
MSD SECTOR 成像仪 2400Meso Scale DiagnosticsI30AA-0MeCP2 ECLIA 实验方案
Multi-Array 96 孔板Meso Scale DiagnosticsL15XB-3/L11BX-3MeCP2 ECLIA 实验方案
青霉素-链霉素gibco by Life Technologies15140122样品制备
兔来源多克隆抗-MeCP2 抗体Eurogentec S.A.定制设计抗体
氯化钾（KCl）Merck KGaA1049361000低渗裂解试剂
一抗小鼠抗-MeCP2（1B11）Sigma-AldrichSAB1404063; RRID:AB_10737296抗体
一抗小鼠抗-MeCP2（4B6）Sigma-AldrichWH0004204M1; RRID:AB_1842411抗体
一抗小鼠抗-MeCP2（Mec-168）Sigma-AldrichM6818; RRID:AB_262075抗体
一抗小鼠抗-MeCP2（Men-8）Sigma-AldrichM7443; RRID:AB_477235抗体
一抗兔抗-MeCP2（D4F3）Cell Signaling Technology3456S; RRID:AB_2143849抗体
蛋白酶抑制剂混合物（100×）Sigma-Aldrich8340低渗裂解试剂，提取缓冲液
二抗兔抗-MeCP2Eurogentec S.A.定制抗体
二抗兔抗-MeCP2Merck07-013抗体
氯化钠（NaCl）Sigma-AldrichS3014提取缓冲液
SULFO-TAG 标记抗兔抗体（山羊）Meso Scale DiagnosticsW0015528S抗体
TAT-MeCP2 融合蛋白实验室自制细胞处理
0.25%（1×）胰蛋白酶-EDTAgibco by Life Technologies25200-056细胞处理
Tween 20Sigma-AldrichP9416洗涤液

参考文献

  1. Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
  2. Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
  3. Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
  4. Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17(2017).
  5. Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
  6. Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
  7. Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
  8. Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929(2019).
  9. Laccone, F. A. Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , Canada. CA2647125C (2007).
  10. Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
  11. Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294(2010).
  12. Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
  13. Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
  14. Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
  15. Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
  16. Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
  17. Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
  18. Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).

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