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方法文章

一种基于电化学发光的MeCP2蛋白变体检测方法

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DOI:

10.3791/61054

2020年5月22日

本文内容

摘要

电化学发光免疫分析法(ECLIA)是一种用于定量检测内源性和外源性MeCP2蛋白变体的新方法,可在较宽的工作范围内产生高度定量、准确且可重复的测量结果,且批内和批间误差较低。本文介绍了在96孔板格式中进行MeCP2-ECLIA的实验方案。

摘要

电化学发光免疫分析法(ECLIA)是一种多功能方法,可在96孔板体系中定量内源性和重组蛋白的含量。为验证ECLIA的检测效率,本实验利用该方法分析了小鼠脑组织中MeCP2的本底表达水平以及TAT-MeCP2在人皮肤成纤维细胞中的摄取情况。MeCP2-ECLIA检测结果具有高度的准确性和可重复性,且板内和板间误差较低。综上所述,我们建立了一种可用于高通量筛选的MeCP2蛋白变异体定量分析方法。

引言

电化学发光免疫分析法(ECLIA)基于一种利用标记物在电化学刺激下产生发光的检测过程。该技术广泛应用于基础工业和学术研究、食品工业以及临床诊断中对生物分析物的定量检测1。通常使用带有碳墨电极的一次性96孔板,这些电极作为免疫分析的固相载体。二抗与电化学发光标记物偶联,当系统施加电流时,化学标记物被激发并发光。超低噪声电荷耦合器件(CCD)记录发光强度,该强度与捕获抗体结合的抗原量成正比,从而实现对样本中目标分析物的定量2。与酶联免疫吸附测定法(ELISA)相比,ECLIA具有更高的灵敏度和重复性,以及更优的自动化程度和一致性,因此被认为更具优势3

本文利用新开发的电化学发光免疫分析法(ECLIA)系统,检测了人源和鼠源样本以及不同亚型的重组蛋白中甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)的水平。MeCP2是一种位于X染色体上的核酸结合蛋白,可与甲基化的DNA序列相互作用,参与基因表达的调控4,5。编码该蛋白的基因若发生功能缺失性突变,是导致Rett综合征(RTT)——一种严重的神经发育障碍疾病——的主要原因6。另一种与MeCP2相关的疾病——MECP2重复综....

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方案

已获得澳大利亚韦斯特米德儿童医院人类研究伦理委员会的批准,用于研究目的的皮肤活检样本采集。动物实验已获得奥地利联邦科学、研究和经济部的许可,并依照当地动物福利法规进行(批准编号:GZ: 66.009/0218-II/3b/2015)。

注意:电化学发光免疫分析系统(ECLIA)的原理如图1所示。

1. 抗体选择

  1. 评估多种 MeCP2 抗体的信噪比,确定在小鼠单克隆 MeCP2 一抗(克隆号 Mec-168)与兔多克隆 MeCP2 检测抗体(定制制备)组合下,信号强度最强且特异性最高的抗体组合。对于二抗,使用系统特异性的抗体(材料表),该抗体也经过实验验证。
    注意:表1 概述了 MeCP2-ECLIA 开发过程中所有经过验证的抗体及其测试的稀释范围。
功能名称克隆号

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结果

ECLIA 系统的原理如图1所示。两种 MeCP2 亚型的标准曲线见图2。该方法可在较宽浓度范围(1−1,800 ng/mL)内实现准确定量。在图3中,分析了小鼠脑组织和人包皮成纤维细胞(HDFs)裂解物中的 MeCP2 水平。图3A比较了杂合子、野生型和敲除型小鼠脑核裂解物中 MeCP2 的表达水平,而在图3B中,使用 ECLIA 方法在 MECP2 缺陷的人成纤维细胞(c.806delG)中未检测到 MeCP2 蛋白。此外,还对 TAT-MeCP2 在 MECP2 缺陷细胞系(c.806delG)中的摄取随时间的变化进行了研究(图4)。最后,如表3所示,验证了检测的批间和批内精密度。

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讨论

为了检测内源性MeCP2、重组MeCP2以及TAT-MeCP2的水平,我们开发了一种96孔板电化学发光免疫分析法(ECLIA)。已有研究表明,MeCP2蛋白功能的丧失会导致Rett综合征(RTT)6,目前对该病的治疗仅限于症状管理和物理治疗。一种有前景的治疗策略是所谓的蛋白替代疗法,该方法可将MeCP2水平滴定至所需浓度12,13,14,15。过去二十年的研究已证实,TAT融合蛋白具有穿越血脑屏障的能力,并取得了成功12,13,14,15。因此,这种MeCP2递送方法可能在蛋白替代疗.......

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们非常感谢 Brigitte Sturm 博士在 ECLIA 仪器使用方面提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1,4-二硫苏糖醇(DTT)Sigma-AldrichD9779低渗裂解试剂,提取缓冲液
Bio-Rad 蛋白检测试剂浓缩液Bio-Rad Laboratories Inc.500-0006样品制备
检测抗体 SULFO-TAG 标记抗兔抗体Meso Scale DiagnosticsR32AB-1抗体
Discovery Workbench 4.0Meso Scale Discovery软件
DMEM(1×)gibco by Life Technologies41966-029样品制备
Dulbecco’s PBS(无菌)Sigma-AldrichD8537-500ML样品制备,洗涤液,包被液
EDTASigma-AldrichEDS提取缓冲液
胎牛血清Sigma-AldrichF9665样品制备
甘油Sigma-AldrichG2025提取缓冲液
含表面活性剂的 Gold Read Buffer T(1×)Meso Scale DiagnosticsR92TGMeCP2 ECLIA 实验方案
HEPESSigma-AldrichH3375低渗裂解试剂,提取缓冲液
KIMBLE Dounce 组织研磨器套装Sigma-AldrichD8938样品制备
实验室摇床,往复式(低速)GFL3014MeCP2 ECLIA 实验方案
六水合氯化镁(MgCl·6H₂O)Sigma-AldrichM2670低渗裂解试剂,提取缓冲液
MeCP2(人源)重组蛋白(P01)Abnova CorporationH00004204-P01细胞处理
Microseal B 密封膜Bio-Rad Laboratories Inc.MSB1001用于板密封
小鼠来源单克隆抗-MeCP2 抗体,克隆 Mec-168,纯化免疫球蛋白Sigma-AldrichM6818-100UL; RRID:AB_262075抗体,包被液
MSD 封闭剂 AMeso Scale DiagnosticsR93BA-4封闭剂
MSD SECTOR 成像仪 2400Meso Scale DiagnosticsI30AA-0MeCP2 ECLIA 实验方案
Multi-Array 96 孔板Meso Scale DiagnosticsL15XB-3/L11BX-3MeCP2 ECLIA 实验方案
青霉素-链霉素gibco by Life Technologies15140122样品制备
兔来源多克隆抗-MeCP2 抗体Eurogentec S.A.定制设计抗体
氯化钾(KCl)Merck KGaA1049361000低渗裂解试剂
一抗小鼠抗-MeCP2(1B11)Sigma-AldrichSAB1404063; RRID:AB_10737296抗体
一抗小鼠抗-MeCP2(4B6)Sigma-AldrichWH0004204M1; RRID:AB_1842411抗体
一抗小鼠抗-MeCP2(Mec-168)Sigma-AldrichM6818; RRID:AB_262075抗体
一抗小鼠抗-MeCP2(Men-8)Sigma-AldrichM7443; RRID:AB_477235抗体
一抗兔抗-MeCP2(D4F3)Cell Signaling Technology3456S; RRID:AB_2143849抗体
蛋白酶抑制剂混合物(100×)Sigma-Aldrich8340低渗裂解试剂,提取缓冲液
二抗兔抗-MeCP2Eurogentec S.A.定制抗体
二抗兔抗-MeCP2Merck07-013抗体
氯化钠(NaCl)Sigma-AldrichS3014提取缓冲液
SULFO-TAG 标记抗兔抗体(山羊)Meso Scale DiagnosticsW0015528S抗体
TAT-MeCP2 融合蛋白实验室自制细胞处理
0.25%(1×)胰蛋白酶-EDTAgibco by Life Technologies25200-056细胞处理
Tween 20Sigma-AldrichP9416洗涤液

参考文献

  1. Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
  2. Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electr....

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MeCP2 96 Western ELISA Tween 20 A MeCP2 Tris Base Gold