该铁氧化还原形态分析方法基于毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱,结合样品堆积技术和单次运行中的快速分析。该方法可快速分析多种组织和生物流体样品中的铁氧化还原形态,并提供较低的定量限。
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该铁氧化还原形态分析方法基于毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱,结合样品堆积技术和单次运行中的快速分析。该方法可快速分析多种组织和生物流体样品中的铁氧化还原形态,并提供较低的定量限。
铁代谢失衡在多种疾病的病理生理机制中起重要作用,包括癌症和多种神经退行性疾病。过量的铁会导致细胞内产生游离的、具有氧化还原活性的亚铁离子(Fe(II)),从而引发氧化应激(OS)以及通过脂质过氧化导致的细胞死亡,即铁死亡(FPT)。因此,相较于总铁含量的测定,对亚铁(Fe(II))和高铁(Fe(III))离子进行定量检测是深入理解这些有害过程的关键。由于在脑脊液(CSF)等实际样本中,Fe(II)/(III)的测定可能受到快速的氧化还原状态转换及低浓度的限制,因此需要具备快速分析能力和低定量限(LOQ)的检测方法。毛细管电泳(CE)具有快速分离Fe(II)/Fe(III)的优势,且无需使用可能干扰氧化还原平衡或导致分析物吸附的固定相。将CE与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)联用作为检测器,可进一步提高检测的灵敏度和选择性。本方法采用20 mM盐酸作为背景电解质,电压为+25 kV。通过电导率-pH堆积技术改善了峰形和浓度检测限。为降低56[ArO]+的干扰,ICP-MS在动态反应池(DRC)模式下运行,反应气为NH3。该方法的检测限(LOD)达到3 µg/L。由于采用了堆积技术,可在不损害分离效果的前提下增加进样体积,从而改善检测限。以峰面积进行校准,在浓度高达150 µg/L范围内呈线性关系。测定精密度为2.2%(Fe(III))至3.5%(Fe(II))。迁移时间精密度对于两种形态均小于<3%,该数据基于人源神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞裂解液1:2稀释后的重复测定结果。通过标准加入法进行的回收率实验显示,Fe(III)的准确度为97%,Fe(II)为105%。在脑脊液等实际生物样本中,迁移时间可能因电导率(即盐度)的变化而波动,因此需通过标准加入法确认峰的归属。
目前,铁介导的氧化应激(OS)在多种疾病中发挥关键作用,尤其在阿尔茨海默病和帕金森病等神经退行性脑部疾病以及癌症中表现尤为明显1,2,3,4。OS 与氧化还原对 Fe(II)/Fe(III) 的状态和平衡密切相关。Fe(III) 为氧化还原非活性态,而 Fe(II) 可通过催化 H2O2 分解,进而产生活性氧(ROS)、羟基自由基并引发膜脂质过氧化,从而具有强效的促氧化能力5,6。在分子水平上,Fe(II) 生成的 ROS 和过氧化磷脂对蛋白质、脂质和 DNA 的完整性构成严重破坏7,8。此类有害的细胞功能障碍已被证实可导致线粒体功能障碍,表现为 ATP 含量降低9,甚至可触发一种程序性坏死性细胞死亡,即铁死亡(FPT)10,11。因此,对 Fe(II)/(III) 进行定量的氧化还原形态分析,在多种与氧化还原相关的疾病研究中具有极其重要的意义。
化学形态分析是研究痕量元素生物学作用及代谢的成熟工具,不仅广泛应用于一般研究7,8,也广泛应用于神经退行性疾病的研究12,13,14,15,16,17。文献中报道的铁氧化还原形态分析方法通常基于液相色谱(LC)分离,部分研究采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)作为元素选择性检测器。然而,在常规LC操作中,每次运行之间需要过长的清洗时间。更为严重的问题是,LC色谱柱的批间差异导致每次更换色谱柱后都必须重新优化洗脱条件。这些问题限制了高通量分析的实现,还需额外时间以获得可接受的可靠性,并对方法进行彻底的重新评估。
为克服这些缺点,本文介绍了一种基于毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱法(CE-ICP-MS)的 Fe(II)/Fe(III) 氧化还原形态分析方法。与液相色谱法相比,毛细管电泳具有多种优势18。毛细管无固定相,因此几乎不受批次差异的影响。当毛细管老化或堵塞时,可快速更换,且通常性能保持不变。样品间的冲洗和清洗步骤高效且耗时短,每个样品的分析时间也较短。
该方法具有良好的优度指标,可靠性高。作为原理验证,本方法应用于人源多巴胺能神经母细胞瘤(SH-SY5Y)细胞裂解液,此类样本在神经退行性疾病及癌症研究中具有重要意义19。
警告:该方法使用盐酸(HCl,从超纯品开始稀释,浓度为 1 M)和四甲基氢氧化铵(TMAH,从超纯品开始稀释,浓度为 25%)。这两种物质均具有强腐蚀性。请使用皮肤和眼睛防护装备。
1. 电解质的制备
2. 标准品与样品的制备及保存
| 起始浓度 | 移液体积 | 用 Milli-Q 水定容至 | 最终浓度 | 终体积 | 溶液用途 |
| 100 mg/L | 50 µL | 4950 µL | 1 mg/L | 50 mL | 每日工作储备液 |
| 1 mg/L | 200 µL | 1800 µL | 100 µg/L | 2 mL | 标准品 |
| 100 µg/L | |||||
| 1 mg/L | 100 µL | 1900 µL | 50 µg/L | 2 mL | 标准品 |
| 50 µg/L | |||||
| 1 mg/L | 50 µL | 1950 µL | 25 µg/L | 2 mL | 标准品 |
| 25 µg/L | |||||
| 1 mg/L | 25 µL | 1975µL | 12.5µg/L | 2 mL | 标准品 |
| 12.5 µg/l | |||||
| 1 mg/L | 20 µL | 1980µL | 10 µg/L | 2 mL | 标准品 |
| 10 µg/L | |||||
| 0 | 2000 µL | 0 µg/L | 2 mL | 空白 |
表1:配制标准品的移液方案。
3. 设置毛细管电泳与电感耦合等离子体质谱联用仪器

图1:CE-ICP-MS 接口的示意图与安装方式。该示意图标识了简单且低成本的 CE-ICP-MS 接口各部件的逐步安装位置。插图显示了毛细管在雾化器中最佳定位的照片。请点击此处查看此图的放大版本。
| 编号 | 部件 | 用途 |
| 1 | 导管(绿色-橙色色码),2 × 约 1 cm | 用于将毛细管电泳(CE)毛细管和出口电极固定在鲁尔接头部件上并保持密封 |
| 2 | 鲁尔接头,公头,3 ×,适用于内径 1.6 mm 硅胶管 | 连接硅胶管至出口电解液,并辅助固定毛细管电泳(CE)毛细管和铂丝电极 |
| 3 | 三通鲁尔接头,母头,2 × | 作为 T 型接头,连接电极、毛细管和抽吸式出口流路 |
| 4 | 鲁尔锥形接头,公头,2 × | 将母头鲁尔接头相互连接,并连接至雾化器 |
| 5 | 硅胶管,内径 1.6 mm,壁厚 0.8 mm,2 × 1 cm,1 × 约 25 cm | a) 1 cm;用于将毛细管电泳(CE)毛细管紧固至接口, b) 1 cm;用于将铂丝电极紧固至接口 c) 25 cm;用于从出口电解液瓶连接至接口 |
| 6 | 硅胶管,内径 3 mm,壁厚 1.2 mm,约 1 cm | 用于将鲁尔锥形接头紧固至雾化器 |
| 7 | 铂丝 | 出口电极 |
表2:用于构建简易自制CE-ICP-MS接口的部件。 表中编号对应图1及文中相应描述。
4. 测量前准备
注意:测量前,应使用强碱性溶液(此处为12% TMAH)冲洗毛细管以进行清洁,然后用背景电解质溶液填充。为了提高分离效果,基于电导率和pH梯度在样品周围构建堆叠缓冲层夹心结构。表3总结了毛细管的连续制备步骤,这些步骤由仪器根据预设方法自动完成:
| 步骤编号 | 步骤 | 化学物质 | 条件 |
| CE 柱的制备 | |||
| Prep 1 | 毛细管清洗 | 12 % TMAH | 4 bar, 1 min. |
| Prep 2 | 用背景电解质冲洗毛细管 | 20 mM HCl | 4 bar, 1 min. |
| Prep 3 | 堆积:前导电解质 | 12 % TMAH | 150 mbar, 3 s |
| Prep 4 | 进样 | Sample | 150 mbar, 3 s |
| Prep 5 | 堆积:终止电解质 | 0.05 mM HCl | 150 mbar, 3 s |
表3:测量前毛细管的制备步骤。 这些步骤通过毛细管电泳系统软件在电泳方法中进行编程,包括加压进样以及在样品周围形成“堆叠三明治”结构。
5. 测量与数据评估
标准品测定与校准
通过单次进样标准品确定迁移时间:Fe(III) 标准品的迁移时间为 118 秒,Fe(II) 标准品的迁移时间为 136 秒。检出限根据基线噪声采用 3σ 法则计算,参照标准浓度为 50 µg/L。Fe(II) 的检出限(LOD(Fe(II))为 3.1 µg/L,Fe(III) 的检出限(LOD(Fe(III))为 3.2 µg/L。两种铁形态的峰面积校准曲线在检出限至 150 µg/L 范围内均呈线性。尽管 Fe(III) 的线性在更高浓度下仍得到验证,但 Fe(II) 的校准曲线斜率有所下降。考虑到与 Fe(II)/(III) 测定相关的生物样品中铁的浓度通常较低,因此将 150 µg/L 作为上限浓度已足够。若样品浓度更高,可进行相应稀释。峰高校准在浓度高达 600 µg/L 范围内进行了验证,在整个测试范围内均表现出良好的线性关系。结果如图 2所示。

图 2:Fe(III) 和 Fe(II) 的校准曲线(峰高)。 两种铁氧化还原态的峰高相关校准曲线呈线性,斜率约为 161 *X 请点击此处查看此图的放大版本。
SH-SY5Y 细胞裂解液分析
对 SH-SY5Y 细胞裂解液的分析显示,由于电导率略高,铁氧化还原物种的迁移速度稍慢。Fe(III) 的迁移时间监测为 124 秒,Fe(II) 为 158 秒。在 SH-SY5Y 细胞裂解液中,Fe(III) 迁移时间的精密度为 2%,Fe(II) 为 3%。采用该方法进行的 Fe(II) 和 Fe(III) 定量测定结果显示,Fe(III) 浓度为 330 µg/L,Fe(II) 浓度为 84 µg/L,由此计算得到的 Fe(II)/Fe(III) 比值为 0.25。56Fe 选择性电泳图谱见图 3。

图3:SH-SY5Y细胞裂解液的56Fe特异性电泳图谱。 Fe(III)在123 s时被检测到,峰高为58025 cps,与158 s时的Fe(II)峰(峰高22800 cps)明显分离。请点击此处查看此图的放大版本。
由于铁在氧化应激(OS)进展中起重要作用,从而促进线粒体功能障碍或铁死亡(FTP),本文介绍了一种基于毛细管电泳-电感耦合等离子体质谱(CE-ICP-MS)的多功能定量方法,可同时实现Fe(II)/Fe(III)的形态分析,并以细胞裂解液为例展示了其应用。该方法分析时间短,其分析性能指标(定量限、精密度、回收率)适用于神经退行性疾病和癌症研究中与铁氧化还原形态分析相关的样品。与基于液相色谱(LC)的先前方法相比,该基于CE的方法实际上不受色谱柱批次影响,也避免了LC色谱柱更换后 previously observed reproducibility problems。每次运行前的毛细管预处理是 <每份样品分析时间约为4分钟,中等盐浓度下可缩短至3分钟。除了分子电荷和大小外,毛细管区带电泳(CZE)中的迁移时间还取决于样品塞内的电导率;当样品本身显著影响电导率时,会导致迁移时间变化或偏移。此类迁移时间偏移在毛细管电泳中已有明确认识,属于CZE固有现象,文献中已有广泛报道。21,22标准品和 SH-SY5Y 细胞裂解液具有中等且均匀的导电性,因此迁移时间变化较小,精密度良好。然而,对于导电性较高的样品,迁移时间可能延长,最长可达 5 分钟。因此,建议采用标准加入法以实现明确的物种鉴定。
铁氧化还原形态分析中的一个关键问题是样品制备过程中形态的稳定性(即 Fe(II)/(III) 平衡的维持)8,13。不合适的 pH 值或螯合化学物质,以及不适当的储存条件(例如样品接触氧气(空气)或深冻储存过程中断),都可能轻易改变 Fe(II)/(III) 的平衡。因此,在制备 SH-SY5Y 细胞裂解液时,选择了一种不含任何螯合化学物质、具有生理 pH 值的裂解缓冲液,并在样品制备过程中及样品容器中覆盖惰性气体,同时立即进行深冻保存。
在文献中,可以找到一些用于监测 Fe(II) 的半定量方法。为了更深入地理解铁在氧化应激中的作用,多个研究团队开发了针对 Fe(II) 的特异性探针,用于在体外半定量监测和可视化亚铁离子的异常升高。然而需要注意的是,这些探针不考虑 Fe(III),也无法实现定量,仅能报告 Fe(II) 的“增多”或“减少”。迄今为止,可用于测定氧化应激(OS)和铁池总量(FPT)的生物标志物仍然有限,这主要是由于缺乏可靠的方法来同时定量 Fe(II) 和 Fe(III) 这两种氧化还原态的铁23,24。鉴于这一现状,本文所介绍的方法能够在一次运行中快速定量 Fe(III) 和 Fe(II),有望成为深入研究铁依赖性分子过程的有力工具。
作者无任何利益冲突需要披露。
VV 获得了哥廷根大学医学中心内部研究资助(Forschungsförderung)以及 Else Kröner-Fresenius 基金会 Else Kröner 研究项目的资助。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 毛细管电泳毛细管 | CS-Chromatographie Service, Langerwehe, Germany | 105180-25 | |
| 毛细管电泳系统 | PrinCe technolgies | 0005.263 | 型号 PrinCe 760 |
| 15 ml 圆锥形超透明离心管 | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777704 | |
| 50 ml 圆锥形超透明离心管 | Analytics-shop.com by Altmann Analytik | PEN0777694 | |
| FeCl2 * 4H2O | Merck | 103861 | |
| FeCl3 | Merck | 803945 | |
| Fluidflex 硅胶 HG 软管 | ProLiquid | 4001106HG | |
| 熔融石英毛细管,外径 360 µm,内径 50 µm | Chromatographie Service GmbH | 105180-25 | |
| 盐酸,1 M | Merck | 1101652500 | 腐蚀性 |
| ICP-MS | Perkin Elmer | N814003 | |
| 鲁尔接头,三通雌性 | BioRad | 7318229 | |
| 鲁尔接头,锥形雄性 | neoLab Migge | 2-1895 | |
| 鲁尔接头,雄性 | neoLab Migge | 2-1880 | |
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| 铂丝 | Carl Roth | 0737.1 | |
| PVC 软管 | ProLiquid | 6000002 | |
| RIPA 缓冲液 | Abcam | ab156034 | |
| 四甲基氢氧化铵,25 % | Merck | 814748 | 腐蚀性 |
| TYGON R-3607 软管 | ProLiquid | 3700203A |