我们在此介绍一种改进的全胚制备及免疫染色方案 果蝇 睾丸组织适用于共聚焦显微镜观察，并可实现可重复且可靠的标记。我们通过S4-S5期大型精母细胞的三维成像及共定位实验的定量分析来展示该方案。
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摘要
摘要
Drosophila 睾丸是研究多种生物学过程的有力模型系统，包括干细胞生物学、核结构、减数分裂以及精子发育。然而，对完整 Drosophila 睾丸进行免疫标记时常因抗体渗透不均而导致染色不一致。压片制备法只能部分解决该问题，且会降低三维分析的质量。本文中，我们描述了一种整体封片技术，该方法在固定过程中使用 NP40 和庚烷，并在液体介质中进行免疫标记。该方法可保持适合共聚焦显微镜观察的组织体积，同时实现可重复且可靠的标记效果。我们展示了从共聚焦切片重建精母细胞核三维结构的多个示例。该方法在不同睾丸之间和同一睾丸内部均具有良好的可重复性，可用于对不同基因型个体中单个细胞的荧光信号进行三维定量与比较。我们以核内 MINT 结构（含 Mad1 的核内区域）的不同组分以及核孔复合体的两个相关组分为例，说明本方案及其在睾丸最大细胞——S4-S5 精母细胞中的应用。
引言
果蝇睾丸是研究核结构的宝贵模型。在有丝分裂的精原细胞中，细胞核体积的大部分被染色质占据。这些细胞经历四轮分裂，产生一个包含16个初级精母细胞的细胞 cyst。在接下来的数天中，精母细胞经过6个发育阶段（S1-S6），体积显著增加，大约扩大20倍1,2。同时，它们的细胞核形态也发生变化。由lamin Dm0标记所显示的细胞核轮廓变得不规则，并出现深陷的内陷结构1,3。这一过程伴随着广泛的基因表达变化以及染色质结构的重塑1,4,5,6,7。在S4-S5阶段，间期染色体结构清晰，形成三个明显的染色质团块，分别对应两对主要的二价常染色体以及与核仁锚定的X-Y染色体配对结构。
Mad1最初被鉴定为有丝分裂检查点的关键组分（详见文献8综述）。在间期细胞中，Mad1主要定位于核膜，同时也存在于核质中9,10,11。在果蝇睾丸中，我们报道Mad1在核质中显著存在，紧密地与两个主要的常染色质团块相关，与XY染色质的关联程度较弱。我们将这种染色质相关结构定义为MINT（含Mad1的核内区域，Mad1-containing IntraNuclear Territory）12。在精母细胞中，另有四种蛋白与MINT相关：核孔蛋白Mtor/Tpr、SUMO蛋白酶Ulp1、有丝分裂检查点蛋白Mad2，以及一个类似多梳复合物的亚基Raf212。
为了完成对MINTs的描述，我们需要使用抗体，但遇到了睾丸免疫染色中普遍存在的技术难题：组织通透性差，导致染色在睾丸深层分布显著不均，尤其是在 大的精母细胞。S压制的制备物 增加抗体通透性，但 导致图像被压缩，限制了三维分析， 和 防止定量测量 荧光，包括共定位抗体渗透问题也可通过使用通透剂（如0.3%脱氧胆酸钠）来解决。13，但该方法在我们实验中未能产生可重复的结果。由于我们进行了大量共标记实验，因此尝试优化透化方案。1% NP40 与庚烷联合使用后，结果的可重复性有所提高，尤其是在研究大型精母细胞时。
本方案对悬浮状态的睾丸组织进行固定和免疫染色，可提高样品质量并增强实验的可重复性，适用于共聚焦显微镜观察。我们利用该方案更清晰地定义了某些核膜蛋白与大型精母细胞核质结构之间的空间关系。该方法将有助于更深入地研究精母细胞发育过程中伴随的结构变化，例如细胞核内染色质、核质以及核孔的动态结构变化。
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方案
1. 果蝇睾丸的采集
注意：为了检测二倍体生殖细胞（即精原细胞和精母细胞），必须使用新生雄性果蝇（羽化后0-15小时）。
- 尽可能选择年轻的果蝇，以尽量减少发育中的精子细胞的干扰。
- 用二氧化碳短暂处理果蝇以麻醉，并转移至果蝇操作垫14,15.
- 在解剖显微镜（10倍放大）下，使用镊子去除头部。
- 将5至10只去头果蝇转移至置于黑色背景支撑物上的硅涂层玻片中的100 µL任氏缓冲液（183 mM KCl, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 完全蛋白酶抑制剂，pH 6.8）中。
- 在解剖显微镜下以40倍放大倍数观察，使用一对5号镊子夹住一个 胸部与腹部之间飞行，以及， 用另一把镊子将腹部从胸部拉开。迅速将睾丸及邻近组织从果蝇尸体中分离出来15 并置于同一载玻片上新的林格氏缓冲液滴中。
- 所有睾丸准备好后，清除附着的残留组织（附属腺体和外生殖器）。
- 去除含有解剖后睾丸液滴中的过量缓冲液。通常使用P200移液器，顶端套上200 μL移液枪头，并在其内插入10 μL枪头，通过较小的开口移除多余液体。在含有解剖后睾丸的液滴上方加入一滴4%多聚甲醛固定液，随后迅速将睾丸转移至含有新鲜固定液的离心管中。
2. 多聚甲醛固定
- 使用前立即配制 2 mL 固定液：在 2 mL 硅化微量离心管中，将 600 µL 4% 多聚甲醛（溶于磷酸盐缓冲液 PBS 中）与 30 µL 20% NP40 及 1200 µL 正庚烷混合。4% 多聚甲醛 PBS 溶液可预先分装为 600 μL 每份，于 -20°C 保存。
注意：正庚烷和多聚甲醛具有毒性，应在通风橱中操作。废弃物应按照所在机构的规定进行处理。 - 使用带有宽口吸头的 p200 移液器将睾丸转移至 PFA/NP40/正庚烷溶液中。手动上下振荡试管 30 秒。随后在室温下于旋转混合仪上继续固定睾丸 30 分钟。
- 停止旋转混合仪，将试管放入试管架中，静置以使液相分层，并让睾丸沉降至管底。
- 移除所有正庚烷及固定液，用 1× PBS 快速冲洗睾丸三次。
- 转移至洁净的 200 µL 单个试管中。所有孵育步骤均在此类小管中进行，以尽量减少抗体使用量。
- 使用配有 P200 和 P10 吸头的 200 µL 移液器吸除多余缓冲液。注意避免吸取到睾丸组织。
- 将睾丸置于冰上，用 1× PBS 浸泡，直至所有样品准备就绪。
3. 溶液中的抗体染色
- 弃去 PBS，将睾丸组织置于 0.3% PBS-T 中，室温孵育 30 分钟，以通透细胞膜。
- 在相同缓冲液中加入 5% 正常山羊血清（NGS），预孵育 1 小时。
- 加入 200 µL 用 0.3% PBS-T 加 5% NGS 稀释的一抗溶液（材料表）。
- 在 4 °C（或室温）轻轻振荡孵育一抗过夜。
- 用 0.3% PBS-T 在室温振荡洗涤 3 次，每次 15 分钟。让睾丸组织依靠重力自然沉降至管底。
- 加入 200 µL 用 DyLight 标记系列二抗按 1:500 稀释的溶液。
- 将二抗在避光环境中室温孵育 4 小时。
- 在室温振荡条件下用 0.3% PBS-T 洗涤 15 分钟；随后依次用 0.2% PBS-T 和 0.1% PBS-T 各洗涤 30 分钟，均在室温振荡进行。最后用 1x PBS 洗涤 30 分钟，以去除去垢剂。
- 加入 180 µL DAPI 溶液（1 µg/mL 溶于 1x PBS），孵育 15 分钟。DAPI 储存液浓度为 10 mg/mL 溶于 H2O。避免将储存液配制在 PBS 中，否则可能减弱在较大精母细胞弥散染色质上的 DAPI 染色信号。
- 每次 5 分钟，共洗涤 3 次。
- 使用疏水屏障笔在洁净载玻片上画一个圆圈。
- 吸除液体，将睾丸组织转移至载玻片上。用 0.1% PBS-T 预润洗宽口吸头可防止组织粘附于吸头。去除多余的 PBS。
- 加入一滴 Citifluor AF1（约 100 µL）。
- 轻轻将盖玻片覆盖在组织上，注意避免产生气泡。
- 用透明指甲油将盖玻片密封固定于载玻片上。
- 将载玻片置于显微镜下观察。
4. 共定位分析
- 获取共聚焦图像。我们使用蔡司 LSM 710 共聚焦显微镜（63倍 Plan Apochromatic 油镜），z轴分辨率为 0.5 或 1 µm。
- 从独立的睾丸样本中选择不同的细胞。
- 将图像导入图像处理软件（例如 Imaris）。
- 通过手动分割定义细胞核，以排除邻近的细胞核。使用 Coloc 软件；该软件可采集两个荧光染料在整个体积内的皮尔逊相关系数（PCCs）。
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结果
获得果蝇睾丸充分染色的主要障碍在于抗体穿透能力有限，虽然使用压片制备法已部分解决了这一问题，但代价是限制了三维分析（例如共定位的三维呈现或测量）。本方法可实现均匀标记，并保持睾丸中所有细胞的体积完整。本文以S4-S5期精母细胞的三维呈现为例来重点说明该方法，因为这些细胞体积最大，因而对压片引起的形变更为敏感。我们使用了多种细胞核标记物，包括核孔蛋白以及由有丝分裂蛋白Mad112所描述的细胞核内MINT结构域（含Mad1的核内区域）的标记。由于MINT结构域可通过多种不同抗体检测，我们利用其来验证本方案在定量三维共定位分析中的稳健性，该方法要求具备准确的空间分辨率。
上述方案可获得足够高质量的共聚焦图像，用于后续三维重建处理。图中展示了S5期精母细胞的四个相邻连续切片。 图1A，显示MINT（使用GFP增强剂对Mad1进行免疫标记，红色）与DAPI（青色）共染的代表性免疫荧光图像。染色体组织成特征性的三个主要独立簇，MINT结构在DNA周围呈现精细结构，与常染色体染质团块紧密关...
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讨论
本方案提供了一种对整体成年黑腹果蝇（Drosophila）睾丸进行成功免疫标记的方法。如其他实验流程所述，必须使用年轻雄性个体（我们甚至将使用年龄缩短至羽化后不足20小时），以尽量减少发育中精子的存在，因为后者可能阻碍精母细胞的观察。解剖操作应迅速完成，且抗体稀释比例需经过优化，以提高信噪比21,22,23。由于采用其他方案时，我们未能观察到睾丸深层区域的完整染色，因此我们开发了一种固定方法，联合使用PFA、NP40和正庚烷。目前我们常规使用的固定液为：600 µL含4%多聚甲醛的PBS溶液，加入30 µL 20% NP40及两倍体积的正庚烷。此步骤至关重要，可实现充分的通透化。将NP40用量减少至10 µL时，标记效果明显减弱。所有后续步骤均在悬浮状态下进行，通过重力使睾丸自然沉降至管底，从而去除多余缓冲液。在最后将样品转移至载玻片时，我们用0.1% PBS-T冲洗移液枪头尖端，以防止睾丸黏附于枪头锥部。据观察，该免疫组织化学染色方案适用于多种核蛋白...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 P. Verrijzer、J. Johansen H.、Okhura 提供抗体，感谢 A. Debec 以及布卢明顿和维也纳果蝇资源中心提供果蝇品系。感谢 C. Jackson 提出的建议和富有启发性的讨论。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 果蝇品系 | |||
| ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO | A. Debec（法国巴黎，Jacques Monod 研究所，UMR 7592）惠赠 | ||
| Mad1-GFP | J Cell Sci. 2011年5月15日；124(第10期)：1664-71 | ||
| Mtor RNAi | VDRC | ID 110218 | 维也纳果蝇RNAi中心 |
| 材料 | |||
| DAPI | 赛默飞世尔科技 | D1306 | 储备液必须用 H2O 配制 |
| Dumont #5 精细镊子 | Fine Science Tools | ||
| MBP 宽口移液器吸头 | Fisherbrand | 11917744 | 宽口径吸头 |
| Thermo Scientific 0.2 mL 个体管 | 赛默飞 | AB-0620 | |
| 2 ml 微型离心管 | Sigma | T3531-200EA | 硅化 2ml 管 |
| Citifluor AF1 | Citifluor | AF1 | |
| Dakopen | Sigma | Z377821-1EA | |
| 正常山羊血清（NGS） | Sigma | NS02L-1ML | |
| 4% 多聚甲醛 | Sigma | P6148-500G | 4% 多聚甲醛溶于 1× PBS ；每份分装600 ml |
| PBS 1× | Thermo | 14190094 | DPBS，无钙，无镁 |
| 0.1%（0.2 或 0.3%）PBS-T | PBS 1X 含 0.1%（0.2% 或 0.3%）Triton X-100 | ||
| Triton X-100，用于分子生物学， | Sigma | T8787 | |
| 抗体 | |||
| GFP增强剂 | Chromotek | gba488 | 1/200 |
| 小鼠抗 Mtor | 1/40 赠品，来自 J. Johansen，爱荷华州立大学 | ||
| 大鼠抗Nup62 | 1/200，由 H. Ohkura（英国爱丁堡大学）惠赠 | ||
| 豚鼠抗Ulp1 | 1/200，由 C. P. Verrijzer 提供，鹿特丹伊拉斯姆斯大学 | ||
| 兔抗Raf2 | 1/200，由 C. P. Verrijzer 提供，鹿特丹伊拉斯姆斯大学 | ||
| DyLight 荧光染料偶联系列 | 赛默飞 | 1/500 驴抗-（豚鼠、小鼠， 兔或大鼠作为二抗 |
参考文献
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