我们在此介绍一种改进的全胚制备及免疫染色方案 果蝇 睾丸组织适用于共聚焦显微镜观察，并可实现可重复且可靠的标记。我们通过S4-S5期大型精母细胞的三维成像及共定位实验的定量分析来展示该方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
Drosophila 睾丸是研究多种生物学过程的有力模型系统，包括干细胞生物学、核结构、减数分裂以及精子发育。然而，对完整 Drosophila 睾丸进行免疫标记时常因抗体渗透不均而导致染色不一致。压片制备法只能部分解决该问题，且会降低三维分析的质量。本文中，我们描述了一种整体封片技术，该方法在固定过程中使用 NP40 和庚烷，并在液体介质中进行免疫标记。该方法可保持适合共聚焦显微镜观察的组织体积，同时实现可重复且可靠的标记效果。我们展示了从共聚焦切片重建精母细胞核三维结构的多个示例。该方法在不同睾丸之间和同一睾丸内部均具有良好的可重复性，可用于对不同基因型个体中单个细胞的荧光信号进行三维定量与比较。我们以核内 MINT 结构（含 Mad1 的核内区域）的不同组分以及核孔复合体的两个相关组分为例，说明本方案及其在睾丸最大细胞——S4-S5 精母细胞中的应用。
引言
果蝇睾丸是研究核结构的宝贵模型。在有丝分裂的精原细胞中，细胞核体积的大部分被染色质占据。这些细胞经历四轮分裂，产生一个包含16个初级精母细胞的细胞 cyst。在接下来的数天中，精母细胞经过6个发育阶段（S1-S6），体积显著增加，大约扩大20倍1,2。同时，它们的细胞核形态也发生变化。由lamin Dm0标记所显示的细胞核轮廓变得不规则，并出现深陷的内陷结构1,3。这一过程伴随着广泛的基因表达变化以及染色质结构的重塑1,4,5,6,7。在S4-S5阶段，间期染色体结构清晰，形成三个明显的染色质团块，分别对应两对主要的二价常染色体以及与核仁锚定的X-Y染色体配对结构。
Mad1最初被鉴定为有丝分裂检查点的关键组分（详见文献8综述）。在间期细胞中，Mad1主要定位于核膜，同时也存....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 果蝇睾丸的采集
注意：为了检测二倍体生殖细胞（即精原细胞和精母细胞），必须使用新生雄性果蝇（羽化后0-15小时）。
- 尽可能选择年轻的果蝇，以尽量减少发育中的精子细胞的干扰。
- 用二氧化碳短暂处理果蝇以麻醉，并转移至果蝇操作垫14,15.
- 在解剖显微镜（10倍放大）下，使用镊子去除头部。
- 将5至10只去头果蝇转移至置于黑色背景支撑物上的硅涂层玻片中的100 µL任氏缓冲液（183 mM KCl, 47 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 完全蛋白酶抑制剂，pH 6.8）中。
- 在解剖显微镜下以40倍放大倍数观察，使用一对5号镊子夹住一个 胸部与腹部之间飞行，以及， 用另一把镊子将腹部从胸部拉开。迅速将睾丸及邻近组织从果蝇尸体中分离出来15 并置于同一载玻片上新的林格氏缓冲液滴中。
- 所有睾丸准备好后，清除附着的残留组织（附属腺体和外生殖器）。
- 去除含有解剖后睾丸液滴中的过量缓冲液。通常使用P200移液器，顶端套上200 μL移液枪头，并在其内插入10 μL枪头，通过较小的开口移除多余液体。在含有....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
获得果蝇睾丸充分染色的主要障碍在于抗体穿透能力有限，虽然使用压片制备法已部分解决了这一问题，但代价是限制了三维分析（例如共定位的三维呈现或测量）。本方法可实现均匀标记，并保持睾丸中所有细胞的体积完整。本文以S4-S5期精母细胞的三维呈现为例来重点说明该方法，因为这些细胞体积最大，因而对压片引起的形变更为敏感。我们使用了多种细胞核标记物，包括核孔蛋白以及由有丝分裂蛋白Mad112所描述的细胞核内MINT结构域（含Mad1的核内区域）的标记。由于MINT结构域可通过多种不同抗体检测，我们利用其来验证本方案在定量三维共定位分析中的稳健性，该方法要求具备准确的空间分辨率。
上述方案可获得足够高质量的共聚焦图像，用于后续三维重建处理。图中展示了S5期精母细胞的四个相邻连续切片。 图1A，显示MINT（使用GFP增强剂对Mad1进行免疫标记，红色）与DAPI（青色）共染的代表性免疫荧光图像。染色体组织成特征性的三个主要独立簇，MINT结构在DNA周围呈现精细结构，与常染色体染质团块紧密关.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案提供了一种对整体成年黑腹果蝇（Drosophila）睾丸进行成功免疫标记的方法。如其他实验流程所述，必须使用年轻雄性个体（我们甚至将使用年龄缩短至羽化后不足20小时），以尽量减少发育中精子的存在，因为后者可能阻碍精母细胞的观察。解剖操作应迅速完成，且抗体稀释比例需经过优化，以提高信噪比21,22,23。由于采用其他方案时，我们未能观察到睾丸深层区域的完整染色，因此我们开发了一种固定方法，联合使用PFA、NP40和正庚烷。目前我们常规使用的固定液为：600 µL含4%多聚甲醛的PBS溶液，加入30 µL 20% NP40及两倍体积的正庚烷。此步骤至关重要，可实现充分的通透化。将NP40用量减少至10 µL时，标记效果明显减弱。所有后续步骤均在悬浮状态下进行，通过重力使睾丸自然沉降至管底，从而去除多余缓冲液。在最后将样品转移至载玻片时，我们用0.1% PBS-T冲洗移液枪头尖端，以防止睾丸黏附于枪头锥部。据观察，该免疫组织化学染色方案适用于多种核蛋白.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 P. Verrijzer、J. Johansen H.、Okhura 提供抗体，感谢 A. Debec 以及布卢明顿和维也纳果蝇资源中心提供果蝇品系。感谢 C. Jackson 提出的建议和富有启发性的讨论。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 果蝇品系 | |||
| ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO | A. Debec（法国巴黎，Jacques Monod 研究所，UMR 7592）惠赠 | ||
| Mad1-GFP | J Cell Sci. 2011年5月15日；124(第10期)：1664-71 | ||
| Mtor RNAi | VDRC | ID 110218 | 维也纳果蝇RNAi中心 |
| 材料 | |||
| DAPI | 赛默飞世尔科技 | D1306 | 储备液必须用 H2O 配制 |
| Dumont #5 精细镊子 | Fine Science Tools | ||
| MBP 宽口移液器吸头 | Fisherbrand | 11917744 | 宽口径吸头 |
| Thermo Scientific 0.2 mL 个体管 | 赛默飞 | AB-0620 | |
| 2 ml 微型离心管 | Sigma | T3531-200EA | 硅化 2ml 管 |
| Citifluor AF1 | Citifluor | AF1 | |
| Dakopen | Sigma | Z377821-1EA | |
| 正常山羊血清（NGS） | Sigma | NS02L-1ML | |
| 4% 多聚甲醛 | Sigma | P6148-500G | 4% 多聚甲醛溶于 1× PBS ；每份分装600 ml |
| PBS 1× | Thermo | 14190094 | DPBS，无钙，无镁 |
| 0.1%（0.2 或 0.3%）PBS-T | PBS 1X 含 0.1%（0.2% 或 0.3%）Triton X-100 | ||
| Triton X-100，用于分子生物学， | Sigma | T8787 | |
| 抗体 | |||
| GFP增强剂 | Chromotek | gba488 | 1/200 |
| 小鼠抗 Mtor | 1/40 赠品，来自 J. Johansen，爱荷华州立大学 | ||
| 大鼠抗Nup62 | 1/200，由 H. Ohkura（英国爱丁堡大学）惠赠 | ||
| 豚鼠抗Ulp1 | 1/200，由 C. P. Verrijzer 提供，鹿特丹伊拉斯姆斯大学 | ||
| 兔抗Raf2 | 1/200，由 C. P. Verrijzer 提供，鹿特丹伊拉斯姆斯大学 | ||
| DyLight 荧光染料偶联系列 | 赛默飞 | 1/500 驴抗-（豚鼠、小鼠， 兔或大鼠作为二抗 |
参考文献
- Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
- Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
标签
