需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

人调节性T细胞克隆的制备

1.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61075

⸱

2020年5月17日

 , 
1Department of Medicine, Division of Rheumatology, New York University School of Medicine, 2Immunobiology and Immunotherapy in Chronic Diseases, Institute for Advanced Biosciences, Université Grenoble Alpes, Inserm U1209/CNRS UMR 5309, 3Etablissement Français du Sang Auvergne-Rhône-Alpes

本文内容

摘要

本方案描述了用于扩增和克隆人调节性T细胞的方法，以获得具有Treg特异性去甲基化区域（TSDR）稳定去甲基化状态及Treg特异性表型特征的超高纯度、有活力的人调节性T细胞。

摘要

人类调节性T细胞（Treg）由于现有Treg富集方法的局限性，极难实现高纯度分离。当前方法主要依赖于通过多种随生理和病理状态不同而表达水平各异的活化依赖性细胞表面标志物来鉴定Treg。因此，被分离为“Treg”的细胞群体中往往含有大量非Treg效应T细胞（即Teff），这会干扰对这些细胞的精确表型与功能特征分析、基因组与蛋白质组学表征、在不同健康与疾病状态下的可靠计数，以及为治疗目的而进行的分离与扩增。尤其是后者仍是一个主要障碍，因为在与Treg相关的细胞区室（例如CD4+CD25+ T细胞）中无意扩增效应细胞，可能导致基于Treg的免疫治疗无效，甚至产生危害。本研究提出一种规避基于细胞群体的Treg分离与扩增相关问题的方法，并证明：通过生成Treg候选克隆，继而仅对经过严格筛选的单克隆细胞进行选择、培养和扩增，能够获得超纯的Treg细胞产物，该产物可在体外长期培养数月之久，从而支持对这些细胞的后续研究，包括潜在的治疗应用。

引言

本实验方案的目的是实现超高水平纯度的克隆性人调节性T细胞（Treg）的体外扩增。通过分离富集Treg的细胞群体并进行后续克隆，可筛选出具有理想表型的Treg细胞，并将其扩增，以进一步研究这些细胞的生物学特性、探索其潜在的治疗价值以及其他实验性下游应用。

与多克隆分离和扩增方法相比，Treg克隆能够显著提高Treg的纯度。这是因为该方法可以可靠且可控地排除表型相似或不同的效应T细胞（Teffector cells），从而获得更纯净的细胞群体，其中包括表达FOXP3的非Treg细胞（FOXP3intCD45RAnegCD25int）以及CD4+ CD25+ FOXP3- Teff1等。通过该方法获得的克隆细胞系不会出现快速扩增的非Treg克隆过度生长的问题，而这一问题使得长期（即数月）体外培养和扩增在实际操作中几乎不可能或至少极具挑战性。此外，克隆来源的Treg还可在扩增后对其表型特征进行广泛验证，包括采用已被公认为评估人源真正天然Treg（bona fide natural Treg）表观遗传特征的标准方法（例如TSDR区域的稳定去甲基化）进行分析1,2,3,4。

Treg细胞的扩增主要用于多克隆细胞扩增，以满足研究和治疗需求5,6,7。效应T细胞（Teff）污染问题是Treg细胞为基础的免疫治疗策略成功实施的主要障碍。文献中此前关于扩增或生成单克隆Treg细胞的尝试较少，且未能在长期培养中维持Treg细胞的特征8。

该方法将引起研究细胞、分子及代谢特性的科研人员的兴趣 真正有效的 人调节性T细胞（Treg）。通过本方案获得的超纯Treg产物特别适用于基因组学方法的相关分析。鉴于人源Treg总体扩增效率相对较低，该方法对于需要快速大量扩增细胞的研究者可能用途有限。然而，由于本方案所产生的Treg纯度极高，较少数量的Treg可能具有与含有效应细胞的多克隆细胞系的大规模扩增产物相当甚至更优的抑制效能，后者因含有削弱整体抑制潜力的效应细胞而受限。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本方案遵循所有与涉及人类样本研究的伦理规范相关的机构指南。人类细胞及其他人源血液制品的操作必须至少在符合BSL-2标准的认证环境中进行，并至少遵守BSL-2安全准则。

1. 对人外周血单个核细胞中 CD4+CD127loCD25hi 细胞进行预富集

警告：全程使用无菌技术。立即将锐器丢弃至适当的锐器容器中。在丢弃前，对任何接触过血液和/或血液制品的物品使用漂白剂处理。在生物安全柜中操作。

  1. 从外周血采集或白细胞单采术获取人外周血或预先富集人白细胞的血液制品（即“白细胞富集包”）。应立即处理细胞。
    注意：若无法避免过夜储存，请在室温（RT）下储存和运输细胞。避免暴露于低温环境。
  2. 通过密度梯度介质梯度离心法分离外周血单个核细胞（PBMCs），方法如前所述9。
  3. 使用血细胞计数板或细胞计数仪仔细计数PBMCs。如条件允许，应使用至少300 × 106个PBMCs进行调节性T细胞（Treg）的分离。
  4. 将PBMCs重悬于分离缓冲液（含1.5 mM EDTA的磷酸盐缓冲液[PBS]中加入2%混合人AB型血清[PHS-AB]）中，调整细胞浓度至50 × 106个/mL，并根据所用分选试剂盒的制造商说明进行磁性分选。例如，可使用磁性细胞分选技术（材料表）对CD4+CD127lo T细胞群体进行阴性分离，随后对CD25+细胞进行阳性选择分选。
    注意：可用于Treg磁性纯化的试剂种类多样，包括基于层析柱和无柱分选的方法。此外，也可采用荧光激活细胞分选（FACS），通过设门筛选CD127loCD25high CD4+ T细胞。然而，标准FACS设备难以实现完全无菌操作，存在显著污染风险。此外，流体系统可能引起细胞应激和损伤，且仪器激光可能影响实验结果。
  5. 通过CD4、CD3、CD127和CD25染色检测最终富集的Treg细胞群体纯度（图1）。为获得准确结果，应选择识别与分选试剂盒中不同CD25结合域的抗人CD25抗体，例如材料表中指定的抗体。使用标准表面染色方案（如Nowatzky等10所述）对细胞进行染色和固定。

2. 从经CD127loCD25hi预富集的人CD4+ T细胞悬液中克隆Treg细胞

  1. 将步骤 1.4 中获得的 Treg 富集细胞（CD4+CD127loCD25hi）重悬于 T 细胞培养基（[TCM]；RPMI 1640，5% 人血清-AB，1% 链霉素/青霉素，1% HEPES，1% 非必需氨基酸，1% 谷氨酰胺）中，并加入 300 IU/mL 人重组白细胞介素-2（IL-2）（材料表），调整细胞浓度至约 ~1−3 × 106 个细胞/mL，并进行计数。在继续操作前，至少进行三次独立的细胞计数并计算平均细胞数，因为准确的计数至关重要。
  2. 制备两种不同浓度的单细胞悬液：（1）3 个细胞/mL，（2）6 个细胞/mL。将五块圆底 96 孔板每孔加入 100 µL 悬液 1，另五块板每孔加入悬液 2。加样时务必保持细胞处于充分悬浮状态，以确保每孔分别含有约 0.3 和 0.6 个细胞。
    注意：不要将细胞浓度提高至每孔 1 个细胞，因为这会增加获得寡克隆细胞系而非真正单克隆的风险。
  3. 使用通过密度梯度离心法从新鲜分离的人同种异体外周血单个核细胞（PBMC）中制备饲养细胞，方法同步骤 1.2。
  4. 为每块克隆板准备至少 10 × 106 个饲养细胞用于辐照：将人同种异体 PBMC 重悬于不含 IL-2 的 TCM 中，置于 50 mL 聚丙烯管内，细胞浓度约为 10 × 106 PBMC/mL。盖紧管盖，使用 γ 辐照仪或基于 X 射线的辐照装置进行 35 Gy 的辐照。
    注意：辐照可诱导饲养细胞大量分泌细胞因子，从而促进效应 T 细胞（Teff）增殖，但可能对调节性 T 细胞（Treg）的扩增产生不利影响。这些因子将在后续洗涤步骤中被去除。
  5. 辐照后，在室温下以 450 × g 离心 5 分钟，吸除上清液。使用至少为沉淀饲养细胞体积 10 倍的 TCM 或 PBS 重悬细胞进行洗涤，洗涤液中不含 IL-2。
    注意：建议对拟克隆的供体细胞进行人类白细胞抗原（HLA）表达谱分析。可通过简单染色检测供体来源人群中常见的一个或多个 HLA 类型（如 HLA-A2 或 HLA-A24）来实现。作为饲养细胞使用的 PBMC 不应表达该 HLA 类型，以便在饲养细胞发生辐照诱导的凋亡前，能够重新识别和分离扩增培养物中的目标细胞。
  6. 将经辐照并洗涤后的饲养细胞重悬于含 300 IU/mL IL-2 的 TCM 中，调整浓度至 1 × 106 个细胞/mL。
  7. 加入植物血凝素-L（PHA-L）（材料表），终浓度为 4 µg/mL（为培养所需浓度的 2 倍），并立即进入步骤 2.8。
  8. 向已铺板的 Treg 富集细胞中加入 100 µL 含 100,000 个辐照饲养细胞的 TCM，其中含 4 µg/mL PHA-L 和 300 IU/mL IL-2，使每孔总体积达 200 µL，PHA-L 浓度为 2 µg/mL。用移液器轻轻吹打混匀 5 次。应尽量缩短饲养细胞在加入 Treg 前与 PHA-L 的接触时间，并在加样前始终保持其处于悬浮状态。
    注意：初始接种时应确保培养体系中 PHA-L 浓度为 2 µg/mL，但在后续 Treg 克隆扩增过程中应使用较低浓度（1 µg/mL）。全程使用 300 IU/mL 的 IL-2。
  9. 在 37 °C 条件下培养。于第 5–7 天更换 50% 培养基，使用含 300 IU/mL IL-2 但不含 PHA-L 的 TCM。

3. Treg 的扩增及克隆在培养中的维持

  1. 从第12天开始，检查培养物中是否存在增殖细胞形成的细胞团块。
    注意：会有由饲养细胞形成的团块，但在显微镜下观察时，这些团块表现为体积较小、圆形、正在死亡或已死亡的细胞；而增殖的T细胞则体积较大，对比度明亮，形态健康，常聚集成相邻细胞簇，在肉眼观察下呈棕色。
  2. 每隔1−2天持续观察培养物。通过将初步克隆转移至单独孔中来分离增殖中的初步克隆。将每个初步克隆单独放置于一个96孔板中，以避免因意外的细胞转移导致任何初步或已建立的克隆之间发生交叉污染。
  3. 每2−3天进行50%的培养基更换，并根据需要进行传代。密切监测细胞状态。
    注意：延迟更换培养基或传代可能损害细胞，而过度传代可能导致细胞增殖停滞并引发细胞死亡。
  4. 使用经辐照的同种异体饲养细胞重新刺激细胞，操作如步骤2.3−2.9所述，但采用较低浓度的PHA-L（即在含300 IU/mL IL-2的TCM中使用1 µg/mL）。当细胞体积减小、形态由细长椭圆形变为圆形时进行重新刺激，通常发生在2−3周后。
    注意：原始克隆培养物应至少维持6−8周。许多在2周左右或稍后即出现的“早期”克隆往往并非真正的调节性T细胞（Treg），而是快速增殖的非Treg/效应T细胞（Teff），相较于“晚期”出现的克隆（其中部分可能需超过1个月才在培养中明显可见），前者更易在筛选过程中被淘汰。

4. 初步调节性T细胞克隆的筛选

  1. 一旦暂定克隆增殖至约 1 × 106 个细胞，即开始对其进行单克隆性和 TSDR 甲基化状态的验证。
  2. 可选步骤：通过 CD3、CD4、CD127 和 CD25 染色对扩增的细胞进行预筛选，以鉴定目标细胞群（即 CD3+CD4+CD127loCD25hi），用于进一步评估（图 2）。
  3. 通过使用市售抗体组合对 Vβ 链进行染色，检测细胞产物中是否存在单一 Vβ 链，从而确认单克隆性（材料表；图 3），操作遵循制造商说明。在流式细胞仪上检测样本时，务必至少采集 1 × 106 个事件，以确保分析的可靠性，从而能够检测到微量的污染细胞群。使用活细胞染料。
  4. 将细胞中 FOXP3 基因座的 TSDR 甲基化状态送交商业服务机构或自行检测11,12。需提供至少 1 × 105 个细胞以获得充分的检测结果。
  5. 一旦在步骤 4.3 和 4.4 中确认了调节性 T 细胞（Treg）的身份和克隆性，即可将细胞冻存或用于后续实验。
    注意：其他替代性但可靠性显著较低的验证方法包括通过流式细胞术（FACS）染色确定 Treg 表型1,10，以及体外或体内抑制实验13,14。应避免过度依赖 Treg 抑制实验13。这些实验通常（但不仅限于）将不同数量的 Treg 与反应性 T 细胞（如外周血单个核细胞 PBMC 或纯化的 T 细胞，有时为去除 Treg 的细胞）共培养，并加入第三方抗原呈递细胞或 CD3/CD28 刺激，以染料稀释程度反映细胞增殖作为读出指标。许多此类实验存在严重局限性，可能高估或低估 Treg 介导的实际抑制程度。TSDR 甲基化状态仍是判断 Treg 表型或“身份”最明确且可靠的指标3,15,16。需注意，FOXP3 位于 X 染色体上，在女性中一条 X 染色体会通过 DNA 甲基化而失活，这会影响 TSDR 甲基化分析的结果。

5. Treg 的冷冻保存

注意：Treg 细胞在使用 DMSO 和 PHS-AB 成功冻存后可长期保存。

  1. 确定用于冷冻保存细胞所需的冻存管数量。该数量等于待冻存细胞悬液的总体积（以 mL 计），因为每支冻存管冻存 1 mL。为弥补移液或表面张力造成的损耗，需在此体积基础上增加 10% 的安全余量。
    注意：细胞可在较宽的浓度范围内进行冷冻保存，通常为 0.1−100 x 106 cells/mL
  2. 标记冻存管。
  3. 配制溶液A（SA）：将50% RPMI与50% PHS-AB或人血浆混合。若使用血浆，于2,000 x g离心 g 4 °C 下孵育 20 分钟。
    注意：SA 的体积应为步骤 5.1 中确定的待冻存细胞悬液总体积的 75%。
  4. 配制溶液B（SB）：混合60%（v/v）PBS或RPMI与40%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）。
    注意：SB 的体积应为待冻存细胞悬液总体积的 25%，该比例由步骤 5.1 确定。
  5. 将两种溶液均冷却至 4 °C。
  6. 将SB与等体积的SA混合配制冻存液，并置于冰上保存。
  7. 将第4.5步的Treg细胞在450 x g下离心 g 4 °C下孵育5分钟。吸除并弃去培养基，将细胞重悬于剩余的预冷SA中，并置于冰上保存。
  8. 在冰上将重悬于SA中的细胞加入大管中，边振荡试管边缓慢加入预冷的冻存液，冻存液与细胞悬液以1:1比例混合。
  9. 迅速分装至冻存管中，每管1 mL。立即将冻存管放入室温下的冻存盒中，并立即转移至-80 °C超低温冰箱。随后转移至液氮中保存。2 24 小时后。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

成功实施本方案将获得稳定的人调节性T细胞克隆和细胞系。

通过预选/预富集CD4+CD127loCD25hi细胞是一种简便的方法，可获得包含大多数人调节性T细胞（Treg）的起始细胞群体（图1A–C）。并非所有克隆均表现出Treg表型。通过检测CD25hiCD127lo表达对克隆进行预筛选，是识别目标克隆的合理策略，并可通过预选提高获得目标克隆的效率（图2A，B）。克隆性的评估可通过TCR Vβ染色轻松实现，要求在细胞产物中仅检测到单一的Vβ链（图3A，B）。然而，仅依赖流式细胞术对克隆进行表征可能因效应T细胞（Teff）与Treg细胞之间分离不完全而导致结果误判，尤其是在FOXP3、CD25和CD...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案描述了通过有限稀释法和基于饲养细胞的扩增方法，从含有调节性T细胞的起始群体中分离、扩增并严格筛选细胞，从而实现高纯度人调节性T细胞的扩增。

该方法的关键步骤包括：1）选择合适的起始细胞群体。通常，CD127loCD25你好 CD4 的区室+ 人外周血单个核细胞中的T细胞含有多种适用于此目的的调节性T细胞10,172）准确的细胞计数对于成功克隆至关重要，因为接种细胞过多可能导致产生寡克隆细胞系，而接种过少则会降低克隆效率。本方案采用标准血细胞计数板进行细胞计数。如果经过适当优化设置并验证计数准确性，也可使用自动细胞计数仪替代。3）接种初始细胞后需对培养板进行长期观察与维护。调节性T细胞（Treg）增殖缓慢，因此克隆通常需在培养数周后才以肉眼可见的细胞团块形式出现。需要注意的是，该时间范围与常用于快速增殖效应T细胞（如细胞毒性CD8⁺ T细胞）克隆制备的方法相比存在显著差异。+...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目由美国国立卫生研究院国家眼科研究所资助，资助编号为K08EY025324（Nowatzky），并获得朱迪思和斯图尔特·科尔顿自身免疫研究中心授予的科尔顿学者奖（Nowatzky）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.22 µm Stericup，500 mLMillipore5500培养基储存与制备
100x 非必需氨基酸Gibco11140-050培养基组分
15 mL 圆锥形离心管（每袋50个，每箱500个）ThermoFisher Scientific339650
1M HEPESGibco15630-080培养基组分
25 mL 单口移液管架Fischer Scientific13-681-508
50 mL 圆锥形离心管（每包25个）ThermoFisher Scientific339652
50x 青霉素-链霉素溶液CorningCorning, 30-001-Cl培养基组分
CryoTube 冻存管，内螺纹，圆底，星足，聚丙烯螺旋盖，无菌，1.8 mLNalge Nunc377267
DMSOCorning25-950-CQC
EasySep 人 CD25 阳性选择试剂盒Stemcell Technologies18231替代方法为 FACS 或基于 MACS 柱的分选
EasySep 人 CD4+CD127low T 细胞预富集试剂盒Stemcell Technologies19231替代方法为 FACS 或基于 MACS 柱的分选
EasySep 人 CD4+CD127lowCD25+ 调节性 T 细胞分离试剂盒（替代第12项）Stemcell Technologies18063替代方法为 FACS 或基于 MACS 柱的分选
FicollGE Healthcare17-5442-03用于外周血或白细胞分离产物中 PBMC 的纯化；密度梯度介质
人 AB 血清（PHS-AB）Valley Biomedical IncHP1022培养基组分
LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒（适用于紫外激发）Thermo FischerL-34962细胞活力染料
植物血凝素-L（PHA-L）Millipore/Sigma11249738001T 细胞刺激
重组 IL-2（例如，PROLEUKINâ）PrometheusT 细胞刺激与维持/培养基组分
RPMI 1640Gibco21870-076培养基组分
流式细胞术染色抗体（Treg 表型分析）参见 "备注"参见 "备注"染色抗体列于：Nowatzky 等（2019），PubMed PMID: 30584695；PubMed Central PMCID: PMC6497402。若使用 EasySep 人 CD25 阳性选择试剂盒，则使用 2A3 或 BC96 抗 CD25 抗体进行染色，例如：Brilliant Violet 421 抗人 CD25 抗体（Biolegend；302629）
TCR Vβ Repertoire 试剂盒；IOTest Beta MarkBeckman CoulterPN IM3497扩增克隆性的验证
组织培养板，96 孔，U 型底，带低蒸发盖Corning353077

参考文献

  1. Miyara, M., et al. Functional delineation and differentiation dynamics of human CD4+ T cells expressing the FoxP3 transcription factor. Immunity. 30 (6), 899-911 (2009).
  2. Polansky, J. K., et al. DNA methylation controls Foxp3 gene expression. European Journal of Immunology. 38 (6), 1654-1663 (2008).
  3. Toker, A., et al. Active demethylation of the Foxp3 locus leads to the generation of stable regulatory T cells within the thymus. The Journal of Immunology. 190 (7), 3180-3188 (2013).
  4. Garg, G., et al. Blimp1 Prevents Methylation of Foxp3 and Loss of Regulatory T Cell Identity at Sites of Inflammation. Cell Reports. 26 (7), 1854-1868 (2019).
  5. Brunstein, C. G., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics. Blood. 117 (3), 1061-1070 (2011).
  6. Hippen, K. L., et al. Massive ex vivo expansion of human natural regulatory T cells (T(regs)) with minimal loss of in vivo functional activity. Science Translational Medicine. 3 (83), 41(2011).
  7. Bluestone, J. A., et al. Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Science Translational Medicine. 7 (315), 189(2015).
  8. Dromey, J. A., et al. Generation and expansion of regulatory human CD4(+) T-cell clones specific for pancreatic islet autoantigens. Journal of Autoimmunity. 36 (1), 47-55 (2011).
  9. Sabado, R. L., et al. Preparation of tumor antigen-loaded mature dendritic cells for immunotherapy. Journal of Visual Experiments. (78), e50085(2013).
  10. Nowatzky, J., Stagnar, C., Manches, O. OMIP-053: Identification, Classification, and Isolation of Major FoxP3 Expressing Human CD4(+) Treg Subsets. Cytometry A. 95 (3), 264-267 (2019).
  11. Zhang, Y., et al. Genome-wide DNA methylation analysis identifies hypomethylated genes regulated by FOXP3 in human regulatory T cells. Blood. 122 (16), 2823-2836 (2013).
  12. Spreafico, R., et al. A sensitive protocol for FOXP3 epigenetic analysis in scarce human samples. European Journal of Immunology. 44 (10), 3141-3143 (2014).
  13. Collison, L. W., Vignali, D. A. In vitro Treg suppression assays. Methods in Molecular Biology. 707, 21-37 (2011).
  14. Workman, C. J., et al. In vivo Treg suppression assays. Methods in Molecular Biology. 707, 119-156 (2011).
  15. Feng, Y., et al. Control of the inheritance of regulatory T cell identity by a cis element in the Foxp3 locus. Cell. 158 (4), 749-763 (2014).
  16. Toker, A., Huehn, J. To be or not to be a Treg cell: lineage decisions controlled by epigenetic mechanisms. Science Signaling. 4 (158), 4(2011).
  17. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  18. Fuhrman, C. A., et al. Divergent Phenotypes of Human Regulatory T Cells Expressing the Receptors TIGIT and CD226. The Journal of Immunology. 195 (1), 145-155 (2015).
  19. Gu, J., et al. Human CD39(hi) regulatory T cells present stronger stability and function under inflammatory conditions. Cellular & Molecular Immunology. 14 (6), 521-528 (2017).
  20. Genevee, C., et al. An experimentally validated panel of subfamily-specific oligonucleotide primers (V alpha 1-w29/V beta 1-w24) for the study of human T cell receptor variable V gene segment usage by polymerase chain reaction. European Journal of Immunology. 22 (5), 1261-1269 (1992).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

调节性T细胞Treg细胞分离Treg克隆细胞克隆单克隆细胞Treg扩增Treg表征Treg纯度Treg培养Treg筛选

本文已发表

视频即将推出

联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。