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方法文章

HT29 来源的结直肠癌干细胞样肿瘤球体中驱动基因的发现

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DOI：

10.3791/61077

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2020年7月22日

 ,  ,  , 
1Radiation Biology Research Center, Institute for Radiological Research, Chang Gung University, Chang Gung Memorial Hospital at Linkou, 2Department of Medical Imaging and Radiological Sciences, Chang Gung University, 3Department of Radiation Oncology, Chang Gung Memorial Hospital, 4Department of Laboratory Medicine, Mackay Memorial Hospital

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于发现维持结直肠HT29细胞来源的已建立癌干细胞样细胞的过表达驱动基因的实验方案。通过RNA测序结合现有的生物信息学分析，研究并筛选基因表达网络，以阐明与靶向肿瘤细胞存活相关的潜在机制。

摘要

癌症干细胞在抵抗临床治疗中起着关键作用，并导致肿瘤复发。许多癌基因参与了肿瘤发生及癌症干性特性的启动。由于结直肠癌来源的肿瘤球形成过程中基因表达尚不明确，逐个研究单个基因的机制耗时较长。本研究展示了一种方法，可快速发现体外维持结直肠癌干细胞样细胞存活的关键驱动基因。本研究选用HT29结直肠癌细胞，该细胞在以球状体形式培养时表达LGR5，并伴随CD133干性标志物的增加。文中所述方案结合现有的生物信息学手段进行RNA测序，以快速揭示由HT29结直肠癌细胞衍生的干细胞样肿瘤球形成过程中高表达的驱动基因。该方法也可用于其他疾病模型中潜在驱动基因的快速筛选与发现。

引言

结直肠癌（CRC）是全球范围内发病率和死亡率均较高的主要致死原因之一1,2。由于基因突变和扩增，癌细胞失去增殖控制而持续生长，从而促进细胞存活3、抗凋亡4以及肿瘤干性特征的维持5,6,7。在肿瘤组织内部，肿瘤异质性使肿瘤细胞能够在治疗过程中适应并存活8。相较于其他类型的癌细胞，具有更强自我更新能力和多能性的肿瘤干细胞（CSCs）是导致肿瘤复发9,10和转移性结直肠癌11的主要原因。CSCs表现出更强的耐药性12,13,14和抗凋亡特性15,16，因而能够在化疗过程中存活下来。

在此，为了研究所选结直肠癌（CRC）干细胞中干性特征的潜在机制，我们通过RNA测序（RNAseq）对肿瘤球状体中的差异表达基因进行筛选。当癌细胞在低黏附条件下培养，并在培养基中添加表皮生长因子（EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、肝细胞生长因子（HGF）和白细胞介素6（IL6）等生长因子刺激时，可形成球状结构（也称为肿瘤球）。因此，我们选用了一种对化疗具有耐受性的CRC HT29肿瘤细胞模型，该细胞在经奥沙利铂和伊立替康处理后，磷酸化STAT3水平升高17。此外，HT29细胞在上述培养条件下表现出更高的干性标志物表达水平。由HT29细胞建立的肿瘤干细胞（CSC）模型表达了更高水平的富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（LGR5）18，这是结直肠癌干细胞的特异性标志物19,20。此外，CD133作为癌症干细胞的通用生物标志物，在HT29细胞系中也呈高表达21。本实验方案旨在基于生物信息学数据集，在已建立的类肿瘤干细胞球中发现驱动基因群组，而非单独研究个别癌基因22。该方法通过RNAseq分析结合现有的生物信息学分析手段，探究潜在的分子机制。

下一代测序是一种高通量、易于获取且可靠的DNA测序方法，依赖于计算辅助，用于全面筛选驱动基因以指导肿瘤治疗23。该技术还可用于检测从分离的RNA样本经逆转录获得的基因表达24。然而，在使用RNA测序进行筛选时，最适合作为治疗靶点的基因在实验组与对照组样本之间的表达差异可能并非最高。因此，已开发出一些生物信息学方法，基于当前的数据集（如KEGG25、GO26,27或PANTHER28）对基因进行分类和鉴定，其中包括Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29和NetworkAnalyst30。本方案展示了将RNA测序与NetworkAnalyst相结合，快速发现选定的HT29来源类球体与亲本HT29细胞之间的一组差异基因。建议将该方法应用于其他疾病模型，以发现重要基因的差异。

与单个基因表达的研究相比，高通量技术有助于更便捷地发现肿瘤精准医学中的潜在驱动基因。借助KEGG、GO或PANTHER等有用的数据库，可根据疾病模型、信号通路或特定功能识别出特定基因，从而快速聚焦于关键的重要基因，节省时间和研究成本。此前的研究已采用过类似的应用14,18,31。特别是肿瘤更为复杂，因为不同类型的肿瘤在存活与增殖过程中会表达不同的基因和通路。因此，本实验方案可在不同条件下筛选出能够区分各类肿瘤类型的基因。通过理解特定基因表达的机制，有望找到有效的癌症治疗策略。

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方案

1. 细胞培养与肿瘤球形成

  1. 在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素抗生素（P/S）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于10 cm培养皿中培养HT29细胞。
  2. 将细胞置于37 °C、5% CO2、95%湿度的无菌条件下培养箱中培养，直至细胞融合度达到80%。
  3. 用1 mL 0.25%胰蛋白酶在37 °C下消化HT29细胞5分钟，随后加入2 mL含10% FBS和1% P/S的DMEM中和胰蛋白酶。
  4. 使用血细胞计数板对HT29细胞进行计数。
  5. 将2,000个细胞/孔接种至低吸附6孔板中，每孔加入2 mL无血清DMEM，其中含1% P/S，并添加0.2% B27、20 ng/mL表皮生长因子（EGF）、20 ng/mL成纤维细胞生长因子（bFGF）、20 ng/mL肝细胞生长因子（HGF）和20 ng/mL白细胞介素6（IL6）。
  6. 将细胞置于37 °C、5% CO2、95%湿度的无菌条件下培养。
  7. 每隔2天添加0.5 mL肿瘤干细胞培养基，持续培养至少7天，直至肿瘤球直径达到>100 μm。
  8. 使用配备数字细胞成像系统的倒置显微镜观察并测量肿瘤球的直径。
  9. 当肿瘤球直径达到>100 μm时，用0.25%胰蛋白酶在37 °C下消化5分钟，并加入两倍体积的生长培养基中和胰蛋白酶。使用血细胞计数板对细胞进行计数。
  10. 以1,200 rpm离心10分钟，弃去上清液。
  11. 将5 × 104个细胞分别与2 µL抗LGR5-PE抗体和2 µL抗CD133-PE抗体加入100 µL DMEM中，在室温下振荡（200 rpm）孵育30分钟。
    注：CD133是HT29细胞中高表达的一种通用肿瘤干细胞生物标志物。
  12. 加入900 µL磷酸盐缓冲液（PBS），通过流式细胞术分析LGR5和CD133的表达水平。FL2-H通道荧光信号的变化表明基因表达情况。

2. RNA 提取

注意：使用商用试剂盒（参见材料表），配合快速柱法提取RNA，并遵循制造商提供的说明书操作。

  1. 向收获的细胞（2 × 105 个细胞）中加入 50 µL PBS，用移液器重悬细胞。
  2. 加入含有 2 µL 巯基乙醇（β-ME）的裂解缓冲液 200 µL，迅速涡旋混匀，室温静置 5 分钟。
  3. 在 16,000 × g 条件下离心 10 分钟，收集上清液，并与 200 µL 70% 乙醇混合。
  4. 使用附带的离心柱，在 14,000 × g 条件下离心 1 分钟，以去除溶剂。
  5. 依次使用洗涤液 1 和洗涤液 2 进行洗涤，在 14,000 × g 条件下各离心 1 分钟，彻底去除非 RNA 杂质。
  6. 再次在 14,000 × g 条件下离心 2 分钟，以去除残留的乙醇。
  7. 加入 50 µL 去离子水，于 14,000 × g 离心 1 分钟，收集洗脱液。
  8. 使用分光光度计在 OD260 处测定 RNA 浓度。
    RNA 浓度（µg/mL）=（OD260）×（40 µg RNA/mL），且 OD260/OD280 > 2。RNA 样品的 RNA 完整性数 (RIN) > 7。

3. RNA测序分析与生物信息学分析

注意：RNA测序分析由商业公司完成（见材料表），用于研究HT29来源的肿瘤球与亲本HT29细胞之间的差异表达基因。

  1. 使用商业服务进行RNA测序步骤，包括文库构建、文库质量控制和DNA测序。
  2. 数据报告应包含重要信息，包括读段数、log2 倍数变化和 p 值。根据以下参数筛选差异表达基因：满足以下条件的基因 > 1 log2 倍数变化并带有读段计数 >100 在 HT29 肿瘤球体组中，以及基因 <-1 log2 倍数变化，对应读段数 >100，在HT29亲本组中。在此情况下，p值 < 0.05 被视为可接受范围，数据予以采用（表1).
    注意：此处为基因计数 >100 被用作继续研究特定基因并验证其表达的阈值。
  3. 使用统计分析软件（参见 材料表），以显示热图并鉴定过表达基因 >1 和下调基因 < 1 倍 log2 变化
  4. 使用 R 软件绘制火山图，x 轴为 log2 倍数变化，y 轴为 -log10(p 值)，以展示差异表达基因。
    1. 安装 R 程序包
      install.packages(library(calibrate)) 
    2. 在 RStudio 中使用以下程序读取数据：
      res <读取.csv文件"/Users/xxx.csv", header=T)
      head(res)
      with(res, plot(log2FoldChange, -log10(pvalue), pch=19, main="HT29CSC 与 HT29 对比"，xlim=c(-6,6)，col="#C0C0C0"))
      with(subset(res, pvalue<.05 & log2倍数变化>1)，绘制(log2FoldChange, -log10(pvalue)，点型=pch=19，颜色=col="红色"))
      with(subset(res, pvalue<.05 & log2倍数变化<(-1))，绘制点图(log2FoldChange, -log10(pvalue)，点符号=pch=19，颜色=col="蓝色"))
      with(subset(res, pvalue>.05)，绘制点（log2FoldChange，-log10(pvalue)，pch=19，col="#444444"))
      abline(h=1.3, lty=2)
      abline(v=1, lty=2)
      abline(v=(-1), lty=2)
    3. 运行以生成火山图。

4. 驱动基因筛选

  1. 在 NetworkAnalyst 中选择单基因输入。
  2. 从表1中复制并粘贴所选的过表达基因，物种指定为“人”，ID 类型选择官方基因符号。
    注意：也可使用Ensembl 基因 ID进行复制粘贴。
  3. 点击上传并点击继续，以基于遗传学蛋白-蛋白相互作用（PPI）方法分析数据。
  4. 使用 STRING 相互作用组数据库，设定置信度评分阈值为 900，以显示连接已上传基因的种子基因。选择与更多独立基因相关联的种子基因作为驱动基因，这些基因可能参与维持 HT29 来源肿瘤球的形成。
    注意：可选用的三种相互作用组数据集为 IMEx、STRING 和 Rolland。STRING 包含更高置信度的实验证据。当上传的基因数量较少时，可选择 IMEx 以预测并筛选相互作用网络中的驱动基因。
  5. 在映射概览页面中选择继续。
  6. 在背景中选择白色，在布局控件中选择力导向布局（Force Atlas）。
  7. 选择PANTHER 生物过程（BP）以分析上调基因组。
    注意：本研究结果表明，HSPA5 在 HT29 来源肿瘤球中参与抗凋亡功能（图3A）。为进一步缩小至特定功能领域，可交替使用 KEGG、GO 或 PANTHER 分类方法来筛选特定的驱动基因。

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结果

为建立用于研究癌症干细胞机制的模型，采用结直肠癌HT29细胞在含B27、EGF、bFGF、HGF和IL6的低吸附培养板中体外培养类癌症干细胞的肿瘤球。该肿瘤球 >100 µm 7天内形成了直径为……的（结构）图1A）。将肿瘤球用胰蛋白酶消化为单细胞，然后通过流式细胞术检测LGR5和CD133的表达。在HT29来源的肿瘤球中，LGR5阳性细胞比例从1.1%上升至11.4%，并通过流式细胞术对细胞进行检测（图1B）。另一种干性标记物CD133在培养的HT29来源肿瘤球中也从亲代HT29细胞的61.8%上升至81.1%（图1C然后，肿瘤球即可用于RNA测序分析。

采用RNA测序技术分析HT29来源的肿瘤球与亲本HT29细胞之间的基因表达谱。两个样本的核苷酸读取错误率均为0.03%。HT29细胞的总基因比对率为87.87%，HT29来源的肿瘤球为87.25%。用于标准化检测读数以指示转录本（mRNA）表达水...

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讨论

本研究采用培养的类癌干细胞肿瘤球作为模型，结合现有的生物信息学方法分析RNA测序数据。在疾病模型中，使用HT29细胞来源的肿瘤球。由于肿瘤球对肿瘤治疗具有耐药性，该已建立的模型可用于通过分析基因表达差异，深入研究耐药机制。此外，结合现有生物信息学的RNA测序基因组技术，能够快速理解研究模型，从而更高置信度地验证可能参与的相关基因。同时，还可鉴定出参与肿瘤球形成的基因类型。

RNA质量对于RNA测序分析至关重要32。应确保样本的RIN值>7，因为这有助于提高测序读段比对、基因比对及FPKM值之间的可靠性。在分析RNA测序数据时，可使用IPA29和NetworkAnalyst30来识别潜在的基因和信号通路。然而，必须根据以下参数排除无关基因：实验组中log2倍数变化>1且读段数>100的基因，以及对照组中log2倍数变化<-1且读段数>100的基因。较高的读段数更有利于后续通过qPCR或Western印迹...

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披露

作者无相关财务披露。

致谢

作者感谢长庚纪念医院放射医学研究所辐射生物核心实验室提供的技术支持。本研究获得了长庚纪念医院（CMRPD1J0321）、 振兴医院（CHGH 106-06）以及马偕纪念医院（MMH-CT-10605 和 MMH-106-61）资助项目的经费支持。资助机构对本研究的设计、数据收集、数据分析与解释以及论文撰写均未产生任何影响。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
iRiS 数字细胞成像系统Logos Biosystems, IncI10999用于观察肿瘤球的形成
流式细胞术BD biosciencesFACSCalibur用于检测肿瘤球中的 LGR5 和 CD133
抗-LGR5-PEBiolegend373803LGR5 检测试剂
抗-CD133-PEBiolegend372803CD133 检测试剂
EGFGenScriptZ00333用于肿瘤球的培养
bFGFGenScriptZ03116用于肿瘤球的培养
HGFGenScriptZ03229用于肿瘤球的培养
IL6GenScriptZ03034用于肿瘤球的培养
PureLink RNA 提取试剂盒Invitrogen12183025用于分离总 RNA 以进行 RNAseq 分析
RNAseq 检测Biotools, 中国台湾RNAseq 分析由位于中国台湾的 Biotools 公司商业完成
NetworkAnalyst加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学寄生虫学研究所http://www.networkanalyst.ca/
PrismGraphPad Software一种统计分析软件

参考文献

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