本文介绍了一种用于发现维持结直肠HT29细胞来源的已建立癌干细胞样细胞的过表达驱动基因的实验方案。通过RNA测序结合现有的生物信息学分析，研究并筛选基因表达网络，以阐明与靶向肿瘤细胞存活相关的潜在机制。
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本文内容
摘要
摘要
癌症干细胞在抵抗临床治疗中起着关键作用，并导致肿瘤复发。许多癌基因参与了肿瘤发生及癌症干性特性的启动。由于结直肠癌来源的肿瘤球形成过程中基因表达尚不明确，逐个研究单个基因的机制耗时较长。本研究展示了一种方法，可快速发现体外维持结直肠癌干细胞样细胞存活的关键驱动基因。本研究选用HT29结直肠癌细胞，该细胞在以球状体形式培养时表达LGR5，并伴随CD133干性标志物的增加。文中所述方案结合现有的生物信息学手段进行RNA测序，以快速揭示由HT29结直肠癌细胞衍生的干细胞样肿瘤球形成过程中高表达的驱动基因。该方法也可用于其他疾病模型中潜在驱动基因的快速筛选与发现。
引言
结直肠癌（CRC）是全球范围内发病率和死亡率均较高的主要致死原因之一1,2。由于基因突变和扩增，癌细胞失去增殖控制而持续生长，从而促进细胞存活3、抗凋亡4以及肿瘤干性特征的维持5,6,7。在肿瘤组织内部，肿瘤异质性使肿瘤细胞能够在治疗过程中适应并存活8。相较于其他类型的癌细胞，具有更强自我更新能力和多能性的肿瘤干细胞（CSCs）是导致肿瘤复发9,10和转移性结直肠癌11的主要原因。CSCs表现出更强的耐药性12,13,14和抗凋亡特性15,
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方案
1. 细胞培养与肿瘤球形成
- 在含有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素抗生素（P/S）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中，于10 cm培养皿中培养HT29细胞。
- 将细胞置于37 °C、5% CO2、95%湿度的无菌条件下培养箱中培养，直至细胞融合度达到80%。
- 用1 mL 0.25%胰蛋白酶在37 °C下消化HT29细胞5分钟，随后加入2 mL含10% FBS和1% P/S的DMEM中和胰蛋白酶。
- 使用血细胞计数板对HT29细胞进行计数。
- 将2,000个细胞/孔接种至低吸附6孔板中，每孔加入2 mL无血清DMEM，其中含1% P/S，并添加0.2% B27、20 ng/mL表皮生长因子（EGF）、20 ng/mL成纤维细胞生长因子（bFGF）、20 ng/mL肝细胞生长因子（HGF）和20 ng/mL白细胞介素6（IL6）。
- 将细胞置于37 °C、5% CO2、95%湿度的无菌条件下培养。
- 每隔2天添加0.5 mL肿瘤干细胞培养基，持续培养至少7天，直至肿瘤球直径达到>100 μm。
- 使用配备数字细胞成像系统的倒置显微镜观察并测量肿瘤球的直径。
- 当肿瘤球直径达到>100 μm时，用0.25%胰蛋白酶在37 °C下消化5分钟，并加入两倍体积的生长培养基中和胰蛋白酶。使用血细胞计数....
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结果
为建立用于研究癌症干细胞机制的模型，采用结直肠癌HT29细胞在含B27、EGF、bFGF、HGF和IL6的低吸附培养板中体外培养类癌症干细胞的肿瘤球。该肿瘤球 >100 µm 7天内形成了直径为……的（结构）图1A）。将肿瘤球用胰蛋白酶消化为单细胞，然后通过流式细胞术检测LGR5和CD133的表达。在HT29来源的肿瘤球中，LGR5阳性细胞比例从1.1%上升至11.4%，并通过流式细胞术对细胞进行检测（图1B）。另一种干性标记物CD133在培养的HT29来源肿瘤球中也从亲代HT29细胞的61.8%上升至81.1%（图1C然后，肿瘤球即可用于RNA测序分析。
采用RNA测序技术分析HT29来源的肿瘤球与亲本HT29细胞之间的基因表达谱。两个样本的核苷酸读取错误率均为0.03%。HT29细胞的总基因比对率为87.87%，HT29来源的肿瘤球为87.25%。用于标准化检测读数以指示转录本（mRNA）表达水.......
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讨论
本研究采用培养的类癌干细胞肿瘤球作为模型，结合现有的生物信息学方法分析RNA测序数据。在疾病模型中，使用HT29细胞来源的肿瘤球。由于肿瘤球对肿瘤治疗具有耐药性，该已建立的模型可用于通过分析基因表达差异，深入研究耐药机制。此外，结合现有生物信息学的RNA测序基因组技术，能够快速理解研究模型，从而更高置信度地验证可能参与的相关基因。同时，还可鉴定出参与肿瘤球形成的基因类型。
RNA质量对于RNA测序分析至关重要32。应确保样本的RIN值>7，因为这有助于提高测序读段比对、基因比对及FPKM值之间的可靠性。在分析RNA测序数据时，可使用IPA29和NetworkAnalyst30来识别潜在的基因和信号通路。然而，必须根据以下参数排除无关基因：实验组中log2倍数变化>1且读段数>100的基因，以及对照组中log2倍数变化<-1且读段数>100的基因。较高的读段数更有利于后续通过qPCR或Western印迹.......
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披露
作者无相关财务披露。
致谢
作者感谢长庚纪念医院放射医学研究所辐射生物核心实验室提供的技术支持。本研究获得了长庚纪念医院（CMRPD1J0321）、 振兴医院（CHGH 106-06）以及马偕纪念医院（MMH-CT-10605 和 MMH-106-61）资助项目的经费支持。资助机构对本研究的设计、数据收集、数据分析与解释以及论文撰写均未产生任何影响。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| iRiS 数字细胞成像系统 | Logos Biosystems, Inc | I10999 | 用于观察肿瘤球的形成 |
| 流式细胞术 | BD biosciences | FACSCalibur | 用于检测肿瘤球中的 LGR5 和 CD133 |
| 抗-LGR5-PE | Biolegend | 373803 | LGR5 检测试剂 |
| 抗-CD133-PE | Biolegend | 372803 | CD133 检测试剂 |
| EGF | GenScript | Z00333 | 用于肿瘤球的培养 |
| bFGF | GenScript | Z03116 | 用于肿瘤球的培养 |
| HGF | GenScript | Z03229 | 用于肿瘤球的培养 |
| IL6 | GenScript | Z03034 | 用于肿瘤球的培养 |
| PureLink RNA 提取试剂盒 | Invitrogen | 12183025 | 用于分离总 RNA 以进行 RNAseq 分析 |
| RNAseq 检测 | Biotools, 中国台湾 | RNAseq 分析由位于中国台湾的 Biotools 公司商业完成 | |
| NetworkAnalyst | 加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学寄生虫学研究所 | http://www.networkanalyst.ca/ | |
| Prism | GraphPad Software | 一种统计分析软件 |
参考文献
- Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors. Przegląd Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).
- Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. Prevalence....
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