Method Article

同步加速器微CT高通量皮质骨样品采购和分析的剖面、科林和图像处理指南

DOI:

10.3791/61081

⸱

June 12th, 2020

 ,  , 
1Department of Biology, The University of Akron, 2Department of Geosciences, The University of Akron

In This Article

Summary

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我们采用了地质（科灵）采样方案，从人类粪便的前部获取均匀大小的皮质骨标本，用于SRμCT实验。这种方法具有极小的破坏性、有效性，可产生圆柱形标本，最大限度地减少不规则样本形状的成像伪影物，并改进微结构可视化和分析。

Abstract

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骨骼是一种动态和机械活性组织，在人的寿命中改变结构。骨骼重塑工艺的产品已经使用传统的二维技术进行了大量研究。通过桌面微计算断层扫描 （μCT） 和同步加速器辐射微计算断层扫描 （SRμCT） 的 X 射线成像技术的最新进展，使得获得比其他 3D 成像技术（例如 SEM） 更大的视野 （FOV） 高分辨率三维 （FOV） 扫描能够更完整地了解人类皮质骨骼内的微观结构。但是，标本应准确以 FOV 为中心，以限制已知影响数据分析的条纹伪影的外观。先前的研究已经报告采购了不规则形状的直线骨块，这些骨块由于边缘不均匀或图像截断而导致成像。我们应用了地质采样协议（科林），从人类粪便的前部获取一致大小的皮质骨芯标本，用于SRμCT实验。这种腐蚀方法效率高，对组织的破坏力极小。它创建均匀的圆柱形样品，可减少在旋转过程中的等轴测量性质的成像伪影物，并在整个扫描过程中为 X 射线束提供均匀的路径长度。对核心和不规则形状样品的X射线断层图像数据的图像处理证实了该技术改进皮质骨微构造的可视化和分析的潜力。该协议的目标是提供一种可靠且可重复的方法，用于提取皮质骨芯，该方法可适应各种类型的高分辨率骨成像实验。这项工作的首要目标是为 SRμCT 创建一个经济实惠、一致且简单明了的标准化皮质骨骼采购。相关领域的研究人员可以进一步调整这一程序，他们通常评估硬复合材料，如生物人类学、地球科学或材料科学。

Introduction

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随着成像技术的最新发展，现在以极高的分辨率获取X射线成像数据是可行的。桌面微CT（μCT）系统是目前成像取消骨骼的标准，由于其无损性质1.然而，当皮质骨的显微结构特征成像时，μCT的使用更加有限。由于分辨率限制，桌面系统无法达到比皮质孔隙小的显微结构特征（如骨细胞孔）所需的分辨率。对于此应用，SRμCT 是理想的，因为这些系统的分辨率更高1。例如，加拿大光源 （CLS） 生物医学成像和治疗 （BMIT） 光束线2上的实验产生了体积小至 0.9 μm 的图像。先前的研究1，3，4，5已经利用这个分辨率从人类长骨皮质骨标本（图1）获得投影和随后的三维（3D）渲染，以量化骨细胞拉库纳尔密度4，6，7，8，9和变化的拉库纳尔形状和大小3在整个人类寿命和性别之间。

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Protocol

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所有标本均来自托莱多大学、医学和生命科学学院以及东北俄亥俄医科大学（NEOMED）的防腐尸体捐赠者，并征得捐赠者本人或捐赠者近亲的知情同意。阿克伦大学保护人类主体机构审查委员会（IRB）认为，这些标本不受IRB的全面审查，因为它们不是从活体个体中获取的。所有捐助者均可获得人口信息，包括年龄、性别和死因。选定的个人没有记录影响骨骼的情况，也没有接触可能影响死亡时骨重塑的治疗方案。皮质骨骼样本取自19至101岁（平均=73.9岁）的现代男性和女性尸体的粪便。股骨中轴已被广泛研究，包括检查皮质孔隙20、21、22、23、24和骨组织25、26、27的物质密度的变化，因此成为微结构分析的常用场所。

1. 组织采购和捣碎

  1. 使用装有暴跌切割硬质合金刀片（用于复合材料）的振荡锯，从左股骨的中度诊断中获取约 7.5 厘米的骨块。
  2. 在45°C的孵化....

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Results

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所述的核心取样方法被证明是高效和高效的。使用此协议的科林标本允许在 CLS BMIT-BM 光束线2上采购 +300 一致大小的样品，FOV 为 +2 mm，尺寸为 1.49μm voxel。为了验证核心直径的一致性，沿人类前股骨核心子集（n=69）的长度（顶部、中间、底部）进行了三次测量。核心的平均直径为1.96±0.11毫米， 核心长度的平均变薄为0.06±0.06毫米/毫米为了强调其他硬复合材料的适用性，我们在多洛米特（n=32）样品上尝试了这种方法，结果平均直径为1.06±0.02毫米。沿核心样品长度的稀释记录为 0.01 ± 0.005 mm/mm。比较第 4.2.3 步中描述的使用旋转工具（例如 Dremel）采购的核心样本和使用旋转工具采购的图像处理工作流程的代表性数字，可在图 7中查看。与核心样品相比，使用普通旋转工具切割的样品显示运河 （Ca.N） 和漆 （Lc.N） 数量增加，平均运河直径 （Ca.Dm）、运河体积 （Ca.V） 和皮质孔隙度 （Ca.V/TV） 减少。虽然其.......

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Discussion

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对于采购具有有限 FOV 设置的高分辨率 SRμCT 成像的均匀和圆柱形皮质骨芯样品，尚未制定全面、标准化的协议。此处详细的协议通过提供有关如何为 SRμCT 成像采购一致大小的皮质骨芯样本以及随后精确可视化和提取微结构数据的全面教程来填补这一空白。我们已经表明，我们的协议提供了一个更标准化和可靠的方法来采购皮质骨芯比以前描述的截断直线骨块的任意尺寸。因此，依靠手持式旋转工具（例如Dremel）去除不规则大小的骨块的研究人员在成像过程中可能经历了更长的样本设置时间，在分析过程中在阈值和皮质孔隙提取方面出现了更大的错误。这种差异突出了这一标准化协议在骨样准备、后续可视化和分析以及解释结果方面的必要性和意义。

此处概述的程序可能由相关领域的研究人员进一步调整，他们通常评估骨组织，如生物人类学家和考古学家。然而，在描述的研究协议中，没有诊断或考古/历史骨骼标本。在地质学中，二次生成是指沉积后物质（例如骨骼）的改变，可以包括物理、化学或生物手段29、30引起的变化。地下水、.......

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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本论文中描述的研究在加拿大光源BMIT设施进行，该设施得到加拿大创新、自然科学和工程研究理事会、萨斯喀彻温大学、萨斯喀彻温省政府、加拿大西部经济多样化、加拿大国家研究理事会和加拿大卫生研究所的支持。作者要感谢加拿大光源公司的光束线科学家，特别是亚当·韦伯、丹尼斯·米勒、谢尔盖·加西洛夫和宁祖在SkyScan SRμCT和白光束显微镜系统的设置和故障排除方面给予的帮助。我们还要感谢托莱多大学医学和生命科学学院的贝丝·达尔泽尔和东北俄亥俄医科大学的杰弗里·温斯特鲁普博士为这项研究获取尸体样本。JM Andronowski通过阿克伦大学和刑事司法法医学国家司法研究与发展研究所提供的启动研究基金（2018-DU-BX-0188）得到支持。RA戴维斯由阿克伦大学提供的研究生助理支持。用于制芯和锯的设备和用品由阿克伦大学提供的启动资金购买，NSF向CW Holyoke提供EAR-1624242。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1-1/8" 用于复合材料的浸入式切割硬质合金Warrior6181228.6mm 浸入
式 70% 乙醇Fisher ScientificBP82015003.8 升
钝头镊子Fisher Scientific10-300
离心管ThermoFisher55398
Crystalbond 509-3 环氧树脂Ted Pella821-3
CTAnalyserBruker microCTv.1.15.4.0下载并安装 https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html
牙科工具套件Amazon787269885110
复合材料金刚石圆锥锯片Buehler#11-4247
钻床喷射铣/钻350017型号：JMD-15，台式钻床是合适的替代品，但通常缺少用于将样品定位在钻杆下方的可平移机床工作台
细尖镊子Fisher Scientific22-327379
用于 XY 铣床/钻头工作台的固定夹具MSC Industrial Supply#04804571
玻璃显微镜载玻片Ted Pella2600575x50mm 载玻片，1mm 厚
载玻片卡盘Buehler#112488足够大，可容纳 75x50mm 载玻片
热板能够达到 140 °CThermoScientificHP88850105
培养箱NAPCO型号 4200
Isocut FluidBuehler111193032润滑剂;30mL
珠宝商的金刚石取芯钻头Otto Frei#119.0502mm 内径空心杆取芯钻头
NReconBruker microCTv.1.6.10.2下载并安装 https://www.bruker.com/products/microtomography.html
摆动锯Harbor Freight62866
烤箱安全玻璃盘Pyrex1117715玻璃食品储存容器
精密慢速锯 （Isomet 1000）Buehler111280160
剃须刀片Amazon25181
浅铝罐亚马逊B01MRWLD0R~8cm 直径
标本杯亚马逊616784425436 885334344729
Tergazyme 洗涤剂Alconox1304-11.8kg 盒
超声波清洗机MTI CorporationKJ201508006
装

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
  2. Wysokinski, T. W., et al.

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