方法文章

高通量皮质骨样本制备与同步辐射显微CT分析的切片、取芯及图像处理指南

DOI：

10.3791/61081

⸱

2020年6月12日

 ,  , 
1Department of Biology, The University of Akron, 2Department of Geosciences, The University of Akron

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们采用地质学（钻孔）取样方法，从人类股骨前侧获取用于同步辐射显微计算机断层扫描（SRµCT）实验的、尺寸均一的皮质骨样本。该方法具有破坏性小、效率高的特点，所获得的圆柱形样本可最大限度减少因样本形状不规则导致的成像伪影，从而改善骨微结构的可视化效果与分析质量。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

骨是一种动态且具有机械活性的组织，其结构会随着人类生命周期而发生变化。以往，骨重建过程的产物主要通过传统的二维技术进行研究。近年来，X射线成像技术的进步，特别是台式显微计算机断层扫描（µCT）和同步辐射显微计算机断层扫描（SRµCT），使得能够在比其他三维成像技术（例如SEM）更大的视场（FOV）范围内获取高分辨率的三维（3D）扫描图像，从而更全面地揭示人皮质骨内部的微观结构。然而，为减少可能影响数据分析的条纹伪影的出现，样本必须被精确地置于视场中心。先前的研究报道，获取的不规则矩形骨块常因边缘不均或图像截断而导致成像伪影。我们采用了一种地质采样方法（钻取法），从人股骨前侧获取尺寸一致的皮质骨芯样本，用于SRµCT实验。该钻取法高效且对组织损伤极小，可制备出均匀的圆柱形样品，因其在旋转过程中具有等距特性，并在整个扫描过程中为X射线束提供一致的路径长度，从而减少成像伪影。对钻取样品与不规则形状样品的X射线断层扫描数据进行图像处理后，证实该技术在改善皮质骨微结构可视化与分析方面的潜力。本方案的目标是提供一种可靠、可重复的皮质骨芯提取方法，适用于多种高分辨率骨成像实验。本研究的总体目标是建立一种经济、一致且简便的SRµCT用皮质骨样本标准化获取流程。该方法还可被相关领域的研究人员进一步调整应用，例如在生物人类学、地球科学或材料科学中常需评估硬质复合材料的研究领域。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

随着成像技术的最新进展，如今已能够以极高的分辨率获取X射线成像数据。由于其非破坏性特点，台式微计算机断层扫描（µCT）系统目前已成为成像松质骨的标准方法1。然而，在成像皮质骨的微结构特征时，µCT的应用则较为有限。由于分辨率的限制，台式系统无法达到成像小于皮质骨孔隙的微结构特征（如骨细胞陷窝）所需的分辨率。对于此类应用，同步辐射微计算机断层扫描（SRµCT）因其更高的分辨率而成为理想选择1。例如，在加拿大光源（CLS）的生物医学成像与治疗（BMIT）光束线上进行的实验2，已获得体素小至0.9 µm的图像。以往的研究1,3,4,5 利用该分辨率，对人类长骨皮质骨样本（图1）获取投影图像并重建三维（3D）图像，用于量化骨细胞陷窝密度4,6,7,

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有标本均来自托莱多大学医学院与生命科学学院以及东北俄亥俄医学院（NEOMED）的经防腐处理的遗体捐赠者，捐赠均获得捐赠者本人或其法定亲属的知情同意。阿克伦大学保护人类受试者机构审查委员会（IRB）认定，由于这些标本并非取自活体个体，因此无需接受完整的IRB审查。所有捐赠者的年龄、性别及死亡原因等人口统计学信息均可获取。所选个体在死亡时均无已知影响骨骼的疾病史，也未接受可能影响骨重建的治疗方案。皮质骨样本取自现代男性和女性遗体的股骨，其年龄范围为19至101岁（平均年龄=73.9岁）。股骨中段已被广泛研究，包括皮质骨孔隙率20,21,22,23,24和骨组织材料密度25,26,27的变异分析，因此已成为微结构分析中常用的部位。

1. 组织获取与研磨

  1. 使用配备有用于复合材料的浸入式切割碳化钨锯片的往复锯，从左侧股骨的骨干中段切取约7.5 cm的骨块....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所描述的核心取样方法被证明具有高度的有效性和效率。采用本方案进行取样，可成功获取 >300 个尺寸一致的样品，用于 CLS BMIT-BM 光束线上的实验2，视野范围约为2 mm（体素大小为1.49 µm）。为验证核心直径的一致性，对部分人类股骨前侧骨核心样本沿其长度方向（上、中、下）进行了三次测量（n=69）。核心的平均直径为1.96 ± 0.11 mm，沿核心长度方向的平均变细程度为0.06 ± 0.06 mm/mm。为了强调该方法对其他硬质复合材料的适用性，我们尝试将该方法应用于白云岩样品n=32），平均直径为1.06 ± 0.02 mm。沿岩心样品长度方向记录到的变薄程度为0.01 ± 0.005 mm/mm。在步骤4.2.3中所述，使用旋转工具（例如Dremel）获取的样品与岩心样品图像处理流程的代表性对比图示可参见 图7使用普通旋转工具切割的样本相较于钻取样本，显示出更多的管道数量（Ca.N）和陷窝数量（Lc.N），以及更小的平均管道直径（Ca.Dm）、管道体积（Ca.V）和皮.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

目前尚无获取均匀且呈圆柱形皮质骨核心样本的全面标准化方案，以用于视野受限的高分辨率同步辐射显微计算机断层扫描（SRµCT）成像。本文详述的方案填补了这一空白。 通过提供关于如何获取尺寸一致的皮质骨芯样本用于同步辐射显微计算机断层扫描（SRµCT）成像，以及后续准确可视化和提取微结构数据的全面教程，弥补了这一空白。我们已证明，与以往描述的切割任意尺寸矩形骨块的方法相比，本方案为获取皮质骨芯样本提供了更为标准化且可靠的方法。因此，依赖手持式旋转工具（例如 Dremel）切除不规则尺寸骨块的研究人员，在成像过程中可能面临更长的样本准备时间，并在分析过程中出现更高的阈值设定误差和皮质孔隙提取误差。这一差异凸显了本标准化方案在骨样本制备、后续可视化与分析以及结果解读方面的重要性和必要性。

本方案还可供相关领域的研究人员进一步调整使用，例如常需评估骨组织的生物人类学家和考古学家。然而，在本研究所描述的实验流程中，并未对任何成岩作用相关的或具有考古学/历史价值的骨样本进行取芯。在地质学中，成岩作用（diagenesis）是指材料（如骨骼）沉积后发生的改变，可能包括由物理、化学或生物因素.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文所述研究在加拿大光源中心（Canadian Light Source）的BMIT设施进行，该设施得到加拿大创新基金会、加拿大自然科学与工程研究委员会、萨斯喀彻温大学、萨斯喀彻温省政府、加拿大西部经济多元化署、加拿大国家研究委员会以及加拿大卫生研究院的支持。作者谨向加拿大光源中心光束线科学家表示感谢，特别是Adam Webb、Denise Miller、Sergey Gasilov和Ning Zu，在SkyScan SRµCT及白光显微镜系统的安装与故障排查过程中提供了协助。我们还感谢托莱多大学医学院与生命科学学院的Beth Dalzell，以及东北俄亥俄医学院的Jeffrey Wenstrup博士，为本研究提供尸体样本。JM Andronowski的研究得到了阿克伦大学提供的启动研究资金以及美国国家 司法研究与教育研究所 法医学领域的进展 用于刑事司法目的的资助（2018-DU-BX-0188）。 RA Davis 获得了阿克伦大学提供的研究生助研奖学金。用于取芯和切割的设备与耗材由阿克伦大学的启动资金以及美国国家科学基金会（NSF）资助项目 EAR-1624242（授予 CW Holyoke）购得。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-1/8" 复合材料用硬质合金下切刀Warrior6181228.6mm 下切深度
70% 乙醇Fisher ScientificBP82015003.8 升
钝头镊子Fisher Scientific10-300
离心管ThermoFisher55398
Crystalbond 509-3 环氧树脂Ted Pella821-3
CTAnalyserBruker microCTv.1.15.4.0在 https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html 下载并安装
牙科工具套装Amazon787269885110
复合材料用金刚石切片锯片Buehler#11-4247
台式钻床Jet Mill/Drill350017型号：JMD-15，台式钻床可作为合适替代设备，但通常缺乏可移动的机床工作台以精确定位钻头下方的样品
细头镊子Fisher Scientific22-327379
铣床/钻床用 XY 机床工作台夹具MSC Industrial Supply#04804571
玻璃显微镜载玻片Ted Pella2600575×50 mm 载玻片，厚度 1 mm
玻璃载玻片卡盘Buehler#112488尺寸需足以固定 75×50 mm 玻璃载玻片
可加热至 140 °C 的加热板ThermoScientificHP88850105
培养箱NAPCOModel 4200
Isocut 切割液Buehler111193032润滑剂；30 mL
珠宝商用金刚石空心钻头Otto Frei#119.050内径 2 mm 的空心杆取芯钻头
NReconBruker microCTv.1.6.10.2在 https://www.bruker.com/products/microtomography.html 下载并安装
往复锯Harbor Freight62866
耐高温玻璃器皿Pyrex1117715玻璃食品储存容器
精密低速切割机（Isomet 1000）Buehler111280160
剃须刀片Amazon25181
浅铝制盘AmazonB01MRWLD0R直径约 8 cm
样品杯Amazon616784425436 885334344729
Tergazyme 洗涤剂Alconox1304-11.8 kg 盒装
超声波清洗器MTI CorporationKJ201508006

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Andronowski, J. M., Crowder, C., Soto Martinez, M. Recent advancements in the analysis of bone microstructure: New dimensions in forensic anthropology. Forensic Sciences Research. 3 (4), 278-293 (2018).
  2. Wysokinski, T. W., et al.

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

CT

相关文章