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缺血性心脏病模型及利用人诱导多能干细胞来源心肌细胞进行心肌细胞收缩的视频比较

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DOI：

10.3791/61104

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2020年5月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular Physiology, Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences, Okayama University, 2Institute of Laboratory Animals, Graduate School of Medicine, Kyoto University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们介绍一种利用人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞建立的缺血性心脏病模型，以及一种用于定量评估缺血所致组织损伤的方法。该模型可为缺血性心脏病的药物筛选及深入研究提供一个有用的平台。

摘要

缺血性心脏病是全球范围内导致死亡的重要原因。因此，该疾病一直是大量研究的焦点，研究中常使用啮齿类等小动物模型。然而，人类心脏的生理特性与啮齿类动物心脏存在显著差异，凸显了建立具有临床相关性的心脏病研究模型的必要性。本文介绍一种利用人诱导多能干细胞分化而来的心肌细胞（hiPS-CMs）建立缺血性心脏病模型的实验方案，并对缺血心肌细胞的损伤程度和功能障碍进行定量分析。在无葡萄糖和血清的条件下暴露于2%氧气环境中，可增加细胞损伤比例（通过碘化丙啶对细胞核染色来指示），并降低细胞活力。这些条件还会降低hiPS-CMs的收缩能力，这一点已通过显微视频图像的位移矢量场分析得到证实。此外，该方案可能通过促进使用来自个体患者的hiPS细胞，为个性化药物筛选提供一种便捷的方法。因此，这种基于人源iPS-CMs的缺血性心脏病模型可为药物筛选及缺血性心脏病的深入研究提供一个有用的平台。

引言

缺血性心脏病（IHD）被公认为全球首要死因，据估计仅2016年就导致了九百多万人死亡1。心血管疾病的患病率持续上升，而全球化似乎加剧了发展中国家心脏病危险因素的流行。因此，对IHD的研究正变得愈发紧迫2。

心血管疾病的实验模型对于研究疾病机制、诊断准确性和新疗法的开发至关重要。许多实验室已提出了多种实验模型。选择具有显著优势的模型极为重要；可行性、可重复性以及与人类疾病的相似性是选择心血管疾病模型的关键因素3。携带特定心肌病相关突变的人诱导多能干细胞（hiPSCs）是动物模型的一种有前景的替代方案4。尽管已有多种利用iPSCs诱导心肌细胞的策略被报道5,6,7,8,9，本文提供了一种简单的方法，通过hiPSCs分化的心肌细胞构建缺血性心脏病（IHD）模型，且无需使用标记物进行繁琐的心肌细胞筛选。在本方法中，通过分析细胞的自发性收缩功能来实现心肌细胞的功能性筛选。

利用人诱导性多能干细胞（hiPSCs）诱导心肌细胞可避免动物牺牲及技术难度较高的手术操作。建立缺血性心脏病（IHD）的动物模型需要复杂的外科技术10。从啮齿类动物的生理特性出发，几乎无法完美模拟人类心脏病的各种病理生理特征，如心率和动作电位。结合使用动物模型所涉及的伦理与道德问题，开发非动物实验模型势在必行。由人iPS细胞分化而来的心肌细胞能够更真实地模拟人类心脏的生理状态。在本实验方案中，我们建立了基于hiPSC来源心肌细胞（hiPS-CMs）的IHD模型。在该模型中，通过剥夺氧气和葡萄糖，导致hiPS-CMs的收缩力和细胞活力下降。本方法为构建IHD模型提供了新途径，并为该疾病的研究建立了一个全新的平台。

方案

1. hiPSC 维持培养

  1. 用层粘连蛋白（材料表）包被六孔培养板。
    1. 将层粘连蛋白用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至0.5 μg/mL。
    2. 每孔加入2.0 mL稀释后的层粘连蛋白，加入六孔板中。
    3. 将培养板在37 °C孵育30 min。
  2. 从孔中移除层粘连蛋白溶液。
  3. 在包被好的孔中，每孔加入2 mL人诱导多能干细胞（hiPSC）维持培养基（材料表），以3 × 104 个细胞/孔的密度接种hiPSCs，注意不要使表面干燥。
  4. 对hiPSCs进行传代培养。
    1. 制备0.5×细胞解离酶（材料表）溶液。
      1. 将10 μL 0.5 M乙二胺四乙酸（EDTA）与10 mL PBS混合，配制成0.5 mM EDTA/PBS。
      2. 取10 mL 1×细胞解离酶，加入10 mL 0.5 mM EDTA/PBS，稀释为0.5×细胞解离酶溶液。
    2. 吸除孔中的废弃培养基。
    3. 每孔加入2 mL PBS洗涤细胞，然后弃去PBS。
    4. 每孔加入800 μL 0.5×细胞解离酶溶液，在含5% CO2的湿润培养箱中37 °C孵育7 min。
      注：可使用0.05%胰蛋白酶-EDTA解离细胞。
    5. 轻柔地移除0.5×细胞解离酶溶液。
    6. 用2 mL PBS洗涤细胞，然后弃去PBS。
      注：操作需轻柔，因加入细胞解离酶溶液后细胞容易脱落。
    7. 加入含10 μM Y-27632的1 mL iPS维持培养基（材料表）。
      注：添加Y-27632可提高hiPSCs的存活率。
    8. 使用细胞刮轻轻刮下细胞，并收集至15 mL离心管中。
    9. 计数细胞数量。加入含10 μM Y-27632的iPS维持培养基，将细胞密度调整至1.5 × 104 个细胞/mL。
      注：为避免细胞损伤，请勿使用离心步骤。
    10. 将2 mL细胞悬液接种至层粘连蛋白包被的六孔板中（最终密度：3 × 104 个细胞/孔）。
    11. 将细胞置于含5% CO2的湿润培养箱中，37 °C孵育。
    12. 在第1、4、5和6天，更换为不含Y-27632的iPS维持培养基。
  5. 在第7天进行细胞传代。
    注：为抑制hiPSCs的随机分化，应在第7天前完成传代。

2. 诱导 hiPSCs 心脏分化

  1. 用层粘连蛋白包被96孔培养板（材料表).
    1. 将层粘连蛋白稀释至 1.675 μg/mL 用 PBS 冲洗。
    2. 将稀释后的层粘连蛋白溶液以每孔0.1 mL的体积加入96孔板中。
    3. 将培养板置于培养箱中孵育 37 °C 30 分钟
  2. 将hiPSCs以3 × 10⁵个/孔的密度接种至96孔板中4 细胞/孔
  3. 增殖 hiPSCs 37 °C 在含5% CO₂的湿润培养箱中2.
    1. 一天后，将培养基更换为 200 μL/well iPS 细胞培养基（材料表).
    2. 每天更换培养基，持续额外2–3天，直至细胞达到70%–80%汇合度。
  4. 加入分化培养基。
    1. 吸除废弃培养基，并缓慢替换为 200 μL/well 预热的分化培养基A材料清单).
    2. 将培养皿置于 37 °C 在含有5% CO₂的湿润培养箱中2.
    3. 48 小时后，吸除培养基，并缓慢替换为 200 μL/well 预热的分化培养基B（材料表).
    4. 将培养皿置于 37 °C 在含5% CO₂的湿润化培养箱中2.
      注意：它是一种 极其重要 确保分化培养基保持新鲜。其分化效果会逐渐减弱，通常在两周内失效。如有必要，可将新鲜培养基分装后于 −20 °C.
  5. 加入心肌细胞维持培养基。
    1. 48 小时后，吸去培养基，并缓慢替换为 200 μL/well 预热的心肌细胞维持培养基（材料表).
    2. 将培养皿置于 37 °C 在含有5% CO₂的湿润培养箱中2.
    3. 每隔一天更换一次心肌细胞分化培养基，直至第30天。
      注意：为了确保分化所需基因的精确表达顺序，必须将分化培养基A和B的作用时间准确设定为48小时。

3. 缺血暴露

  1. 剥夺培养基中的营养物质和氧气。
    1. 配制不含葡萄糖和血清的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。
    2. 吸出含有 hiPS-CMs 的 96 孔板各孔中的培养基。
    3. 将营养缺乏的培养基以指定体积加入孔中 200 μL/well.
  2. 将培养皿置于低氧培养箱中（材料表).
  3. 通入氮气，并将内部氧气浓度维持在2%，二氧化碳浓度维持在2 5% 浓度处理 24 小时。
  4. 进行所需的分析： 例如活力检测、收缩力评估或细胞损伤评估。

4. 使用 MTT 法评估细胞活力

  1. 使用MTT检测试剂盒（材料表）定量评估细胞活力。
    注意：在DMEM中使用1 mM过氧化氢处理1小时可用于损伤细胞（阳性对照）。在DMEM中使用0 mM过氧化氢处理可作为阴性对照。
    1. 使用多通道移液器向细胞中加入10 μL MTT试剂。
    2. 在轨道摇床上轻柔混匀1分钟。
    3. 将细胞在37 °C、5% CO2培养箱中孵育3–4小时。孵育后，细胞内生成的甲臜会以深色晶体形式沉积于孔底。
    4. 移除上清液后，加入100 μL二甲基亚砜溶液（DMSO）溶解不溶性甲臜晶体。该溶液将溶解甲臜晶体，形成紫色溶液。
      警告：DMSO可能刺激眼睛、呼吸系统和皮肤。操作时应佩戴合适的手套及眼/面部防护装备。
    5. 使用酶标仪在570 nm波长下测定各样品的吸光度。

5. iPS-CMs 收缩功能的评估

  1. 若尚未安装，请在 https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv 获取粒子图像测速法 ImageJ 插件11 并进行安装。
  2. 使用相差显微镜，以 4× 物镜以每秒约 20 帧的速度记录 hiPS-CMs 的视频图像，持续约 10 秒，并保存为“analyze.avi”。为比较缺血前后收缩力的变化，请确认已记录目标区域。
    注意：配备自动载物台的显微镜有助于精确定位目标区域。视频文件应保存为 .avi 格式以便后续分析。若非此格式，请将视频转换为 .avi 格式。
  3. 按照 图 1 所示创建文件夹结构。“joblist.txt”的示例见补充文件。
  4. 分析细胞位移的离散二维矢量场。
    1. 启动 Fiji（ImageJ）软件12，进入 Plugins > Macros > Edit，打开“vector_analysis.ijm”（补充代码文件）。
    2. 点击 Run，分析将自动执行。
      注意：参考帧（第一帧）与所有后续帧（第 1 帧与第 2 帧、第 1 帧与第 3 帧、第 1 帧与第 4 帧等）之间，每 16 × 16 像素区域的位移矢量 D(x,y) 将被计算。结果将逐帧计算，并保存为“vec_x.txt”（x 为帧编号）。每个 (x, y) 点的最大位移矢量 M(x, y) 定义如下：
      图像处理方法中的数学公式 M(x,y)=Dₖ(x,y)。
      其中 k 表示满足 |Dk (x,y)| = max [|D2 (x,y)|, |D3 (x,y)|, …, |Dn (x,y)|] 的帧编号，n 表示最后一帧。该结果保存为“Max_vector.txt”。|M(x, y)| 表示在分析点 (x, y) 处由心肌细胞收缩引起的最大位移。任意单位下的收缩力值 C 按以下公式计算：
      静态平衡方程 Σxy |M(x,y)|，数学公式，用于教学。
      该值保存在“Max_vector.txt”的第 7 列第 1 行。C 表示所有 (x, y) 点位移的总和。心肌收缩引起较大位移的区域所占比例越大，C 值越大。最大位移矢量场 M(x, y) 将与第一帧的相差图像（“Phase_contrast.png”）叠加，并保存为“Overlaid.png”。由于位移矢量的大小是基于视频第一帧计算的，因此建议第一帧中 hiPS-CMs 处于静息舒张期。

6. 使用流式细胞术评估细胞损伤

  1. 将1 mg/mL的碘化丙啶溶液用PBS稀释至1:1,000。
  2. 用碘化丙啶对悬浮细胞进行染色。
    1. 吸出培养基，并将其转移至适当大小的离心管中。
    2. 以1,000 × g 离心5分钟，小心弃去上清液，避免丢失沉淀的细胞。
    3. 将细胞与稀释后的碘化丙啶溶液在室温下避光孵育15分钟。
    4. 以1,000 × g 离心5分钟，小心弃去上清液，避免丢失沉淀的细胞。
    5. 用约1 mL PBS重悬细胞。
      注意：为准确量化细胞损伤，必须收集培养基中悬浮的脱落细胞。
  3. 用碘化丙啶对贴壁细胞进行染色。
    1. 用PBS轻轻洗涤贴壁细胞两次，然后弃去PBS。
    2. 将细胞与稀释后的碘化丙啶溶液避光孵育15分钟。
    3. 吸出碘化丙啶溶液。
    4. 使用0.25%胰蛋白酶消化细胞，将细胞悬液转移至离心管中。
    5. 以1,000 × g 离心5分钟，小心弃去上清液，避免丢失沉淀的细胞。
    6. 用约1 mL PBS重悬细胞。
  4. 混合悬浮细胞和贴壁细胞，用于荧光激活细胞分选（FACS）分析。
  5. 将细胞悬液通过30 μm滤膜过滤。
    注意：为获得准确的FACS检测结果，细胞过滤步骤至关重要。
  6. 使用FACS系统分析样品。

7. 免疫染色

  1. 固定细胞样品。
    1. 吸除培养基。
    2. 在室温下加入4%多聚甲醛PBS溶液，孵育10 min。
    3. 用PBS洗涤细胞三次。
      注意：建议使用新鲜配制的多聚甲醛溶液以获得最佳固定效果。
  2. 用0.2% Triton X-100处理细胞15 min进行透化，然后弃去试剂。
  3. 加入3%牛血清白蛋白（BSA），在37 °C下封闭细胞30 min。
  4. 加入一抗。
    1. 从培养板中弃去牛血清白蛋白溶液。
    2. 在4 °C下与一抗孵育过夜。
    3. 移除一抗溶液。
    4. 用PBS洗涤细胞三次。
  5. 加入二抗。
    1. 从培养板中弃去PBS溶液。
    2. 在室温避光条件下，与二抗孵育30 min。
      注意：一抗为抗人心肌肌钙蛋白T（TNNT2）小鼠单克隆抗体，使用浓度为1:750（溶于3% BSA）；二抗为Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG抗体，使用浓度为1:1,000（溶于3% BSA）。
  6. 对细胞核和肌动蛋白纤维进行额外染色。
    1. 移除抗体溶液。
    2. 在室温避光条件下，将细胞与核染色试剂（材料表）和肌动蛋白染色试剂（材料表）在PBS中共同孵育30 min。
      注意：可使用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）或Hoechst 33342进行细胞核染色。
    3. 用PBS洗涤细胞三次。
  7. 使用荧光显微镜采集荧光图像。

结果

成功分化的细胞在显微镜下表现出自发性收缩视频 1）。通常，50%的孔会出现自发性收缩 <20 天补充图1）。心脏标志物蛋白（例如，cTnT）可用于确认分化成功图2).

通常，缺血组细胞在MTT实验中的活力（图3A）以及收缩功能（图3E,F，补充图2）均低于常氧对照组。此外，缺血组中碘化丙啶阳性细胞的比例也高于对照组（图3B–D），表明细胞损伤程度更高。

矢量分析示意图；数据处理的输入-输出文件结构，包括电影文件。
图1：使用ImageJ进行位移矢量分析的文件夹结构。
“joblist.txt”文件的每一行描述一个电影文件的路径。如果有三个需要分析的文件，则应建立三个文件夹（movie1、movie2和movie3），每个文件夹中应包含名为“analyze.avi”的目标视频文件。运行“vector_analysis.ijm”代码完成分析后，将在每个电影文件夹中生成相应的输出文件（以蓝色标示）。各文件中存储的信息在正文中有详细说明。请点击此处查看该图的放大版本。

DAPI、肌动蛋白、cTnT的荧光显微镜图像；细胞结构分析，合并图像显示。
图2：心肌标志物染色的代表性图像。
心肌标志物蛋白心肌肌钙蛋白T（cTnT）的表达。蓝色：4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），红色：肌动蛋白，绿色：cTnT。插图：cTnT的条纹状表达，对应于肌节结构。比例尺，50 μm。该图改编自Wei等13。请点击此处查看此图的放大版本。

缺血研究结果，包括吸光度、流式细胞术、PI荧光和收缩力分析。
图3：细胞活力检测、细胞损伤评估及收缩功能的代表性图像。
(A) 细胞活力（MTT法）比较。吸光度越高，表明细胞活力越强。n = 5，每种条件。 (B, C 和 D) 碘化丙啶（PI）染色细胞的流式细胞术分析。与对照组相比，缺血细胞的前向散射光强度降低，PI荧光增强。(D) 流式细胞术分析中PI染色细胞的百分比。n = 3，每种条件。(E) 使用ImageJ软件分析iPS-CMs的收缩功能。红色和蓝色矢量分别表示最大和最小收缩幅度。比例尺：100 μm。(F) 使用代码对iPS-CMs收缩功能进行定量分析。对照组 n = 3，缺血组 n = 8。误差线表示均值的标准误。统计分析采用非配对双尾Student’s t检验。*：p < 0.05，**：p < 0.01，***：p < 0.0001。本图引自Wei等13 请点击此处查看该图的放大版本。

视频 1：在显微镜下观察到分化细胞出现自发性收缩。 请点击此处下载该视频。

补充图1：无自发性收缩样本比例的Kaplan-Meier分析。 50%的iPS-CM样本在第20天出现收缩；第30天时，64.4%的样本出现收缩。n = 83。请点击此处下载该图。

补充图2：心肌收缩力评估。 通过将收缩力C除以分析点数（x, y）得到归一化的收缩力，并绘制了缺血组和对照组在暴露于24小时低氧前后的心肌收缩力变化。n = 3（对照组），n = 8（缺血组）。请点击此处下载该图表。

补充图3：心肌细胞含量的评估。 在96孔板上进行心脏标志蛋白的免疫染色。绿色：cTnT，蓝色：DAPI。通过将cTnT染色区域面积除以DAPI染色区域面积，计算出分化细胞的比例为20.7 ± 9.6%。比例尺 = 1 mm。n = 4（对照条件）。请点击此处下载该图。

补充编码文件。 请点击此处下载该文件。

讨论

研究人员通常使用实验室小型动物模型进行缺血性心脏病（IHD）实验。在此，我们建立了一种人类缺血性心脏病的细胞培养模型，用于开展此类实验。

使用本方案可能面临的主要问题是分化的心肌细胞比例较低。为提高成功分化的效率，需特别注意以下几个步骤：（a）加样时操作应轻柔，因为加入细胞解离酶试剂后细胞容易脱落；（b）在细胞解离过程中添加Y-27632可提高iPS细胞的存活率；（c）分化初期培养基更换的时间间隔必须精确控制为48小时，以确保与分化相关的基因得到有序表达。

关于用于包被培养板表面的细胞外基质蛋白，除本方案中使用的层粘连蛋白外，还可使用其他材料。例如，Matrigel14,15 和明胶16,17 均可用于无饲养层条件下维持 hiPSCs 的培养。根据 Haraguchi 等人的研究，接种在 Matrigel 上的 hiPSCs 可成功分化为心肌细胞片层18。

已有大量先前研究报道了利用人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的心肌细胞构建疾病模型的培养体系。在模拟缺血-再灌注损伤方面，已有研究引入了对细胞微环境的调控，例如高钾血症、酸中毒和乳酸积聚19。其他方法包括通过细胞成团以阻碍氧气扩散20，以及使用氰化物进行代谢抑制21。在本实验方案中，细胞损伤通过一种相对简单的方法实现，即剥夺氧气和营养物质24小时。然而，在考虑缺血性心脏病的精确病理生理过程时应谨慎，因为体内疾病与本方案所建立的疾病模型之间确实存在差异，例如是否存在三维细胞环境和血液成分。

在心肌细胞功能评估的技术方面，Toepfer 等人报道了一种基于 MatLab 的算法，用于测定 hiPS-CMs 中肌节的收缩与舒张过程22。Smith 等人报道了一种先进的高通量电生理分析方法，可用于分析由 hiPS-CMs 分化而来的可兴奋细胞，该方法采用复杂的纳米拓扑结构化多电极阵列23,24。本方案的优势在于仅需常规软件和耗材，例如 ImageJ 软件和 96 孔板。

关于心脏中的氧水平，到达心脏的静脉血氧分压被认为约为 40 mmHg25。根据 McDougal 等人的研究，在缺氧条件下，细胞外氧分压估计为 <12.8 mmHg26。采用 Rounds 等人提出的方法27，在当前实验方案处理下，37 °C、2% 氧气浓度的缺氧条件中，培养基（盐度：35‰）内的氧分压计算值为 14.9 mmHg，高于上述估计值。有趣的是，Al-Ani 等人报道，在培养基中存在氧分压梯度，且氧分压受细胞类型、接种密度和培养基体积的影响28。通常情况下，细胞所处的培养板底部氧浓度最低。因此，培养基深度将进一步降低 hiPS-CMs 周围的有效氧分压。为了在缺氧条件下对 hiPS-CMs 诱导产生足够的损伤，必须仔细控制培养基的深度和细胞的密度。

我们建立的hiPS-CM模型非常接近人心肌细胞的生理条件，能够优势性地模拟人类缺血性心脏病（IHD）。基于动物模型的方法存在伦理、技术和学术方面的诸多问题。特别是，体内模型需要采用先进的显微外科技术才能获得可重复的数据，例如在啮齿类动物中闭合左冠状动脉前降支3。本文所述的hiPS-CM模型克服了这些关键障碍，为心血管疾病研究提供了一个有用、相关且可重复的实验平台。

然而，应注意一些局限性。iPS诱导的心肌细胞与正常心肌细胞之间一个明显的差异是缺乏T管结构29，且本研究未包含白细胞引起的组织损伤及补体系统激活等体液因素。此外，本模型中分化心肌细胞的比例（20.7 ± 9.6%，补充图3）仍有待提高。Halloin等人最近发表的研究描述了一种可扩展的、化学成分明确的方法，通过化学性WNT通路调节剂可将hiPS-CM纯度提升至>95%，且无需依赖任何标记物进行筛选30。尽管如此，我们的人类IHD模型相对简单且具有临床适用性（例如，利用患者来源的iPS细胞进行药物筛选）。该模型也为进一步阐明IHD相关机制提供了一个独特的平台。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由日本学术振兴会（JSPS）科研费国际共同研究加速基金（促进国际共同研究：孵化）（编号：17KK0168）资助。作者衷心感谢冈山大学医学院中央研究实验室在FACS技术方面的协助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
肌动蛋白染色试剂（ActinRed 555 ReadyProbes 试剂）Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAR37112
抗心肌肌钙蛋白 T 抗体Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAMA5-12960
心肌细胞维持培养基（PSC 心肌细胞分化试剂盒）Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA2921201
细胞解离酶（TrypLE Select）Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA12563011
分化培养基 A（PSC 心肌细胞分化试剂盒）Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA2921201
分化培养基 B（PSC 心肌细胞分化试剂盒）Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA2921201
FACS Aria III 系统BD Biosciences, San Jose, CA, USA
荧光显微镜KEYENCE, Osaka, JapanBZ-X710
山羊抗小鼠 Alexa Fluor 488 二抗Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA28175
人诱导性多能干细胞RIKEN, Tsukuba, Japan201B7
低氧培养箱SANYO, Osaka, JapanMCO-175M
iPSC 生长培养基（Essential 8 培养基）Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAA1517001
iPSC 维持培养基（StemFit AK02N）Ajinomoto, Tokyo, JapanRCAK02N
层粘连蛋白（iMatrix-511）Nippi, Tokyo, JapaniMatrix-511
MTT 检测试剂盒（MTT 细胞增殖检测试剂盒）Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA10009365
细胞核染色试剂（NucBlue Fixed Cell ReadyProbes 试剂）Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAR37606
Triton X-100Nacalai Tesque, Kyoto, Japan35501-02

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