本文介绍了一种利用延时荧光显微镜结合琼脂糖垫和细胞成像培养皿，对捕食性细菌Bdellovibrio bacteriovorus的完整生命周期进行监测的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
Bdellovibrio bacteriovorus 是一种小型革兰氏阴性专性捕食性细菌，能够杀死其他革兰氏阴性细菌，包括有害病原体，因此被视为一种活体抗生素。为了将 B. bacteriovorus 作为活体抗生素加以应用，首先需要了解其复杂生命周期的主要阶段，特别是其在猎物内部的增殖过程。迄今为止，实时监测其捕食性生命周期各个连续阶段仍具挑战性。本文介绍了一种全面的实验方案，用于实时成像 B. bacteriovorus 的完整生命周期，尤其是在宿主细胞内生长阶段的成像。为此，采用由琼脂糖垫与细胞成像培养皿组成的系统，使捕食性细菌可在琼脂糖垫下方自由移动，同时固定化的猎物细胞能够形成蛭弧体。此外，利用表达荧光标记的DNA聚合酶III β亚基的菌株，可进一步在 B. bacteriovorus 生命周期的繁殖阶段实时监测染色体复制过程。
引言
Bdellovibrio bacteriovorus 是小型的（0.3–0.5 µm 0.5–1.4 µm革兰氏阴性细菌，可捕食其他革兰氏阴性细菌，包括诸如 肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌 和 志贺氏菌 福氏1,2,3。由于 B. bacteriovorus 可杀灭病原体，因此被认为是一种潜在的活体抗生素，可用于对抗细菌感染，特别是由多重耐药菌株引起的感染。
B. bacteriovorus 具有一种独特的生活周期，包括两个阶段：自由生活的非复制性攻击阶段和细胞内繁殖阶段（图1）。在自由生活阶段，这种高度运动的细菌以高达160 µm/s的速度移动，寻找其猎物。在附着到猎物的外膜后，它进入周质空间4,5。在周质内繁殖阶段，B. bacteriovorus 利用大量水解酶降解宿主的大分子，并将其重新用于自身的生长。入侵周质后不久，宿主细胞死亡并膨胀形成一种称为蛭弧体（bdelloplast）的球形结构，在此结构内，捕食性细菌细胞伸长并复制其染色体。复制过程从复制起点（oriC）开始6，持续进行直至合成出多个完整的染色体拷贝7。有趣的是，每条染色体的复制并不伴随细胞分裂。相反，捕食者细胞伸长，形成一条长的、多核区且呈丝状的细胞。当营养耗尽时，该丝状细胞同步发生隔膜形成，子代细胞从蛭弧体中释放出来8。
之前 B. bacteriovorus 可作为对抗细菌感染的活体抗生素，因此了解其生命周期的关键阶段（特别是其在宿主细胞内增殖的相关过程）至关重要。对活细胞进行成像观察 B. bacteriovorus 由于捕食者及其猎物在复杂生命周期中存在多种形态，这一研究一直具有挑战性。迄今为止，关于两者之间的相互作用 B. bacteriovorus 及其宿主细胞的相互作用主要通过电子显微镜和瞬时快照分析进行研究2,9,10，这两种方法均存在局限性，尤其是在用于监测捕食性生命周期的连续阶段时。这些方法可提供高分辨率的图像 B. bacteriovorus 细胞，并能在捕食者攻击或生长阶段观察小型捕食者。然而，它们无法实现对单个 B. bacteriovorus 细胞在生活周期的两个阶段中均存在。
本文介绍了一种利用延时荧光显微镜（TLFM）监测B. bacteriovorus完整生命周期的全面实验方案。该系统采用琼脂糖垫与细胞成像培养皿相结合的方式，使捕食性细胞可在琼脂糖垫下方自由移动，而被固定的猎物细胞则能够形成蛭弧体（图2）。该实验装置基于特定的E. coli和B. bacteriovorus菌株设计，但本方案可轻松调整以适应用户自有的不同菌株（例如携带不同的筛选标记、与不同荧光蛋白融合的蛋白等）。
在此情况下，为了在攻击阶段观察 B. bacteriovorus，构建了一种特定菌株（HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry），该菌株表达带有荧光标记的细胞质蛋白PilZ（可应要求向本实验室索取）7。该菌株还产生与荧光蛋白融合的DnaN（即DNA聚合酶III全酶的β滑动夹结构）。这使得能够在捕食性细胞于蛭弧菌体（bdelloplasts）内生长时，实时监测其内部正在进行的DNA复制过程。
尽管所述的图像采集方案和软件针对的是特定厂商提供的倒置显微镜（见材料表），但该技术可调整适用于任何配备环境培养室或其他外部加热载物台并具备延时成像功能的倒置显微镜。在数据分析方面，用户可选择任何与各自输出格式兼容的可用软件。
图1： B. bacteriovorus 生命周期在 E. coli 作为宿主细胞。 在攻击阶段，自由游动的 B. bacteriovorus 细胞寻找并附着于宿主 E. coli 细胞。入侵后，捕食性细胞定位于猎物的周质空间，改变宿主细胞的形态，形成蛭弧体。生殖阶段始于蛭弧体的形成。捕食性细胞消化猎物细胞，并利用分解产生的简单化合物重建自身结构。 B. bacteriovorus 在宿主的周质空间内以长单丝状生长。当被捕食细胞的资源耗尽后， B. bacteriovorus 丝状体同步形成隔膜并产生子细胞。子细胞长出鞭毛后，裂解蛭弧体。 请点击此处以查看此图的放大版本。
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方案
1. 用于显微分析的B. bacteriovorus裂解液制备
- 在250 mL的锥形瓶中，将1 mL新鲜的24小时B. bacteriovorus培养物（例如HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry）与3 mL过夜培养的猎物菌液（例如E. coli S17-1 pZMR100），加入50 mL Ca-HEPES缓冲液（25 mM HEPES，2 mM CaCl2 [pH = 7.6]），必要时添加抗生素（此处为50 µg/mL卡那霉素），混合建立共培养体系。
- 将共培养体系在30 °C、200 rpm振荡条件下孵育24小时。
- 通过湿片相差显微镜观察，确认猎物细胞已完全裂解。此时应可见大量运动性的攻击期B. bacteriovorus细胞，无E. coli细胞或蛭弧体（bdelloplast）残留。
- 将B. bacteriovorus培养物经0.45 µm孔径滤膜过滤，以去除残留的宿主细胞。捕食性细胞（0.3–0.5 µm × 0.5–1.4 µm）可自由通过0.45 µm孔径，而宿主细胞则被截留在滤膜表面。
- 将滤液在50 mL锥形管中，于30 °C、2469 × g离心20分钟，收集捕食性细胞。将B. bacteriovorus沉淀重悬于3 mL Ca-HEPES缓冲液中（终浓度OD600约为0.2），在30 °C、200 rpm条件下孵育30分钟。
2. 准备宿主细胞以供 B. bacteriovorus 侵入
- 使用宿主菌株的单个菌落（推荐使用 E. coli S17-1 pZMR100，因为不同细胞大小会导致形成大小不均的蛭弧体）接种 10 mL 添加了抗生素（如需要，此处为 50 µg/mL 卡那霉素）的 YT 培养基（0.8% Bacto 胰蛋白胨，0.5% 酵母提取物，0.5% NaCl [pH = 7.5]）。在 37 °C、180 rpm 条件下过夜培养。
- 取 2 mL 过夜培养的 E. coli 菌液（OD600 约为 3.0）转移至 2 mL 离心管中，在室温（RT）下以 2469 × g 离心 5 分钟。用 200 µL Ca-HEPES 缓冲液重悬沉淀。
3. 显微镜的设置（参见材料表）
- 使用前至少1小时，将配备100倍油浸物镜的显微镜载物台预热至30 °C。此步骤可防止实验过程中因温度变化导致的聚焦误差。
- 打开显微镜和显微成像自动化系统。启动控制软件，并根据需要选择合适的滤光片以获取明场/DIC/相差和荧光图像（本实验中：明场图像、GFP/mCherry多色滤光片，以及mCherry和GFP的激发/发射滤光片）。
4. 时间序列荧光显微镜成像布局的组装
- 将200 mg低荧光分子级琼脂糖与20 mL Ca-HEPES缓冲液（最终琼脂糖浓度为1%）混合，并在微波炉中溶解琼脂糖。该混合物在凝固后可多次重复使用，只需重复加热步骤即可。
- 将3 mL熔化的琼脂糖倒入35 mm玻璃底培养皿中（材料表）。让琼脂糖自然凝固。
- 使用实验室微型刮铲，小心地将琼脂糖垫从35 mm培养皿中取出，注意不要破坏琼脂糖垫中心区域。将琼脂糖垫翻转，使底部朝上，放入培养皿盖中（图2）。
- 在翻转后的琼脂糖垫表面滴加5 µL浓缩的E. coli菌悬液，并用接种环将细胞均匀涂布于中心区域。随后，在涂有E. coli的表面滴加5 µL浓缩的B. bacteriovorus菌悬液（OD600约为0.2）。无需进一步涂布细胞。
- 迅速将琼脂糖凝胶放回35 mm玻璃底培养皿中（凝胶顶部朝下），然后盖上盖子。如有必要，可轻轻按压琼脂糖使其贴合皿底，以去除气泡。
图2：实验流程示意图。将琼脂糖垫从35 mm培养皿中取出并翻转，使原来朝下的底面朝上。将捕食性细胞的新鲜悬液和猎物细胞的过夜培养物接种至翻转后的琼脂糖垫表面，以包被其“底面”。随后将琼脂糖垫重新翻转至原始方向，并放回35 mm培养皿中，再将培养皿置于显微镜腔室内的倒置显微镜载物台上。请点击此处查看该图的放大版本。
5. 进行延时荧光显微镜观察
- 将35 mm培养皿放入培养皿 holder 中，确保其在实验过程中不会移动。在物镜和35 mm培养皿底部各滴加一滴浸油（折射率1.518）。
- 将支架安装到显微镜室中倒置显微镜的载物台上。
- 在显微镜控制软件中设置参数，以在多个时间点和多个载物台位置采集多幅图像。
- 设置放大倍数（100x）和多色镜头（GFP/mCherry）。使用目镜和明场（BF）找到焦平面，并打开点列表管理器。
- 通过移动载物台并在显微镜软件中点击以保存每个位置的坐标，选择至少10个感兴趣的位点 标记点 按钮。避免选择位置过于接近的点，以防止光漂白和光毒性。将相机阀从目镜转向显示器，并通过设置焦平面并点击每个点进行校准 替换位点 点列表管理器中的按钮。
- 打开实验设计界面，按照以下要求在每个选项卡中设置所有实验参数：
- 取消标记 Z轴层扫 盒
- 选择荧光通道并设置最佳照明参数。此处使用的设置如下：mCherry通道采用mCherry滤光片组（EX575/25；EM625/45），50%强度，200 ms曝光时间；GFP通道采用GFP滤光片组（EX475/28；EM525/48），50%强度，80 ms曝光时间；明场图像采用POL通道，5%强度，50 ms曝光时间。
- 选择图像采集的时间间隔以及实验的总时长。本实验中，图像采集间隔为5 min，总时长为10 h。
- 为选定位置启用焦点维持功能（对于此处使用的系统，通过标记实现） 使用 UltimateFocus 保持专注 复选框
- 选择图像文件应自动保存的数据文件夹。
- 重新检查显微镜软件控制中的所有设置，然后开始延时实验。
- 实验开始一小时后，检查所有视野位置是否仍处于焦距范围内。如有需要，在图像采集的间隔时间内调整焦距。
- 当延时实验结束后，取出培养皿，并根据生物安全规程使用带有琼脂糖垫的35 mm培养皿。
注意：第5.2步之后的所有子步骤仅适用于DeltaVision Elite用户。使用其他系统的研究人员需根据各自系统调整设置。
6. 使用 Fiji 软件处理延时图像并生成视频
- 将实验数据转移至安装有 Fiji 软件的计算机。启动 Fiji 程序，并通过 文件 | 打开 打开图像，或直接将图像文件拖拽到 Fiji 中。
- 在 Bio-Formats 导入选项 中，于图像堆栈显示选项中选择 以超堆栈形式查看堆栈，在颜色选项中点击 复合颜色模式，并勾选 自动缩放。
- 通过滚动浏览图像堆栈，评估细胞和蛭弧体在实验过程中是否保持在焦平面内。检查在生长阶段期间，蛭弧体内的 B. bacteriovorus 细胞中是否始终存在来自 DnaN-mNeonGreen 的绿色荧光斑点，并确保捕食性生命周期的所有阶段均可被观察到。
- 要分析特定的 B. bacteriovorus 细胞/蛭弧体，可使用 Fiji 菜单中的选择工具（矩形、椭圆、多边形 或 自由手绘）进行标记。通过 图像 | 复制 或使用快捷键 Ctrl + Shift + D 复制所选区域。
- 按以下步骤调整每个荧光通道的亮度和对比度：
- 若要选择单个通道，请点击 图像 | 颜色 | 通道工具 或使用快捷键 Ctrl + Shift + Z 打开 通道工具，然后选择目标通道（通道 1：mCherry，通道 2：mNeonGreen，通道 3：明场）。
- 通过打开 图像 | 调整 | 亮度/对比度 中的 B&C 菜单，或点击 Ctrl + Shift + C，调整荧光通道图像的亮度和对比度。
- 使用 分析 | 工具 | 比例尺 添加比例尺。点击 图像 | 堆栈 | 时间戳 为图像添加时间标记。
- 要保存修改后的图像，请进入 文件 | 另存为，选择 TIFF 格式以保存为图像序列，选择 AVI 格式以生成视频，或选择 PNG 格式以保存当前帧的单张图像。
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结果
所述基于TLFM的系统可实现对B细胞的单细胞分析. bacteriovorus 随时间追踪图3, 视频 1）并提供了关于其复杂捕食生命周期各个阶段的宝贵信息。PilZ-mCherry 融合蛋白可在攻击阶段以及生长阶段早期标记整个捕食细胞图3）。通过宿主形成蛭弧体以及复制体（复制机制）的出现，可观察到从攻击期向复制期的转变，其中复制体以标记有DnaN-mNeonGreen荧光焦点的形式显现图3).
如先前研究所证实，复制体组装于入侵细胞的一极（菌毛极）7，随着繁殖阶段的推进，在生长中的B. bacteriovorus丝状体内可观察到多个复制体（图3）。在染色体完成多次复制后，DNA复制终止（表现为DnaN-mNeonGreen荧光焦...
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讨论
由于人们对利用 B. bacteriovorus 作为活体抗生素的兴趣日益增加，迫切需要开发新的工具来观察其捕食性生命周期，特别是捕食者与病原体之间的相互作用。本方案用于实时追踪 B. bacteriovorus 的整个生命周期，尤其是在其宿主内生长阶段的动态过程。此外，通过使用表达荧光标记的DNA聚合酶III全酶β夹子菌株，可实现对 B. bacteriovorus 繁殖阶段染色体复制进程的实时监测。
该方法中的一个关键步骤是在35 mm培养皿中正确制备布局。观察生命周期过程中面临的一个挑战是 B. bacteriovorus 在显微镜下观察的目的是建立支持捕食性生长（以其他革兰氏阴性细菌细胞作为宿主细胞）并维持捕食细胞运动性的条件。有效显微观察的关键之一是琼脂糖垫上猎物细胞需均匀分布，这可通过接种环涂布细胞实现。宿主细胞密度不可过高，所选观察位点应包含足够数量的独立宿主细胞。同时， 蛭弧菌 细胞应具有足够的运动能力，以主动寻找其猎物。因此，在将琼脂糖垫翻转并放回培养皿之前，细胞不应被铺展或...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由国家科学中心资助，项目编号为 Opus 2018/29/B/NZ6/00539，授予 J.Z.C.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 离心机 | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | 转子编号 12183 |
| 认证分子生物学级琼脂糖 | BIO-RAD | 161-3100 | 用于琼脂糖垫的低荧光琼脂糖 |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | 开源图像处理软件包 |
| 35 mm 玻璃底培养皿 | ibidi | 81218-200 | 未包被玻璃 |
| 显微镜 | GE | DeltaVision Elite | 微孔板载物台，终极聚焦激光模块，DV Elite CoolSnap HQ2 相机，SSI 组装 FP DV，Oly 100x 油镜 1.4 NA 物镜套件，棱镜 Nomarski 100x 长工作距离 DIC，ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart 滤器 0.45 µm | Sartorius | 16555----------K | 醋酸纤维素，无菌，鲁尔锁扣出口 |
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参考文献
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