本文介绍了一种利用延时荧光显微镜结合琼脂糖垫和细胞成像培养皿，对捕食性细菌Bdellovibrio bacteriovorus的完整生命周期进行监测的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
Bdellovibrio bacteriovorus 是一种小型革兰氏阴性专性捕食性细菌，能够杀死其他革兰氏阴性细菌，包括有害病原体，因此被视为一种活体抗生素。为了将 B. bacteriovorus 作为活体抗生素加以应用，首先需要了解其复杂生命周期的主要阶段，特别是其在猎物内部的增殖过程。迄今为止，实时监测其捕食性生命周期各个连续阶段仍具挑战性。本文介绍了一种全面的实验方案，用于实时成像 B. bacteriovorus 的完整生命周期，尤其是在宿主细胞内生长阶段的成像。为此，采用由琼脂糖垫与细胞成像培养皿组成的系统，使捕食性细菌可在琼脂糖垫下方自由移动，同时固定化的猎物细胞能够形成蛭弧体。此外，利用表达荧光标记的DNA聚合酶III β亚基的菌株，可进一步在 B. bacteriovorus 生命周期的繁殖阶段实时监测染色体复制过程。
引言
Bdellovibrio bacteriovorus 是小型的（0.3–0.5 µm 0.5–1.4 µm革兰氏阴性细菌，可捕食其他革兰氏阴性细菌，包括诸如 肺炎克雷伯菌，铜绿假单胞菌 和 志贺氏菌 福氏1,2,3。由于 B. bacteriovorus 可杀灭病原体，因此被认为是一种潜在的活体抗生素，可用于对抗细菌感染，特别是由多重耐药菌株引起的感染。
B. bacteriovorus 具有一种独特的生活周期，包括两个阶段：自由生活的非复制性攻击阶段和细胞内繁殖阶段（图1）。在自由生活阶段，这种高度运动的细菌以高达160 µm/s的速度移动，寻找其猎物。在附着到猎物的外膜后，它进入周质空间4,5。在周质内繁殖阶段，B. bacteriovorus 利用大量水解酶降解宿主的大分子，并将其重新用于自身的生长。入侵周质后不久，宿主细胞死亡并膨胀形成一种称为蛭弧体（bdelloplast）的球形结构，在此结构内，捕食....
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方案
1. 用于显微分析的B. bacteriovorus裂解液制备
- 在250 mL的锥形瓶中，将1 mL新鲜的24小时B. bacteriovorus培养物（例如HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry）与3 mL过夜培养的猎物菌液（例如E. coli S17-1 pZMR100），加入50 mL Ca-HEPES缓冲液（25 mM HEPES，2 mM CaCl2 [pH = 7.6]），必要时添加抗生素（此处为50 µg/mL卡那霉素），混合建立共培养体系。
- 将共培养体系在30 °C、200 rpm振荡条件下孵育24小时。
- 通过湿片相差显微镜观察，确认猎物细胞已完全裂解。此时应可见大量运动性的攻击期B. bacteriovorus细胞，无E. coli细胞或蛭弧体（bdelloplast）残留。
- 将B. bacteriovorus培养物经0.45 µm孔径滤膜过滤，以去除残留的宿主细胞。捕食性细胞（0.3–0.5 µm × 0.5–1.4 µm）可自由通过0.45 µm孔径，而宿主细胞则被截留在滤膜表面。
- 将滤液在50 mL锥形管中，于30 °C、2469 × g离心20分钟，收集捕食性细胞。将B. bacteriovorus沉淀重悬于3....
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结果
所述基于TLFM的系统可实现对B细胞的单细胞分析. bacteriovorus 随时间追踪图3, 视频 1）并提供了关于其复杂捕食生命周期各个阶段的宝贵信息。PilZ-mCherry 融合蛋白可在攻击阶段以及生长阶段早期标记整个捕食细胞图3）。通过宿主形成蛭弧体以及复制体（复制机制）的出现，可观察到从攻击期向复制期的转变，其中复制体以标记有DnaN-mNeonGreen荧光焦点的形式显现图3).
如先前研究所证实，复制体组装于入侵细胞的一极（菌毛极）7，随着繁殖阶段的推进，在生长中的B. bacteriovorus丝状体内可观察到多个复制体（图3）。在染色体完成多次复制后，DNA复制终止（表现为DnaN-mNeonGreen荧光焦.......
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讨论
由于人们对利用 B. bacteriovorus 作为活体抗生素的兴趣日益增加，迫切需要开发新的工具来观察其捕食性生命周期，特别是捕食者与病原体之间的相互作用。本方案用于实时追踪 B. bacteriovorus 的整个生命周期，尤其是在其宿主内生长阶段的动态过程。此外，通过使用表达荧光标记的DNA聚合酶III全酶β夹子菌株，可实现对 B. bacteriovorus 繁殖阶段染色体复制进程的实时监测。
该方法中的一个关键步骤是在35 mm培养皿中正确制备布局。观察生命周期过程中面临的一个挑战是 B. bacteriovorus 在显微镜下观察的目的是建立支持捕食性生长（以其他革兰氏阴性细菌细胞作为宿主细胞）并维持捕食细胞运动性的条件。有效显微观察的关键之一是琼脂糖垫上猎物细胞需均匀分布，这可通过接种环涂布细胞实现。宿主细胞密度不可过高，所选观察位点应包含足够数量的独立宿主细胞。同时， 蛭弧菌 细胞应具有足够的运动能力，以主动寻找其猎物。因此，在将琼脂糖垫翻转并放回培养皿之前，细胞不应被铺展或.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由国家科学中心资助，项目编号为 Opus 2018/29/B/NZ6/00539，授予 J.Z.C.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 离心机 | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | 转子编号 12183 |
| 认证分子生物学级琼脂糖 | BIO-RAD | 161-3100 | 用于琼脂糖垫的低荧光琼脂糖 |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | 开源图像处理软件包 |
| 35 mm 玻璃底培养皿 | ibidi | 81218-200 | 未包被玻璃 |
| 显微镜 | GE | DeltaVision Elite | 微孔板载物台，终极聚焦激光模块，DV Elite CoolSnap HQ2 相机，SSI 组装 FP DV，Oly 100x 油镜 1.4 NA 物镜套件，棱镜 Nomarski 100x 长工作距离 DIC，ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart 滤器 0.45 µm | Sartorius | 16555----------K | 醋酸纤维素，无菌，鲁尔锁扣出口 |
| 启动 SoftWoRx | GE | 制造商提供的成像软件 |
参考文献
- Shatzkes, K., et al. Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs. mBio. 7 (6), (2016).
- Iebba, V., et al. Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Stap....
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重印与许可
