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方法文章

利用磁力测量法监测化学合成氧化铁纳米颗粒的细胞摄取及后续生物降解

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DOI：

10.3791/61106

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2021年2月27日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratoire Matière et Systèmes, Complexes MSC, UMR 7057, CNRS & University Paris Diderot, 2Université Sorbonne Paris Nord, Laboratory for Vascular Translational Science, LVTS, INSERM, UMR 1148, 3Services de Biochimie et Médecine Nucléaire, Hôpital Avicenne Assistance Publique-Hôpitaux de Paris

本文内容

摘要

通过非水溶胶-凝胶法制备氧化铁纳米颗粒，并用阴离子短链分子或聚合物进行包覆。利用振动样品磁强计（VSM），展示了磁强测量技术在监测磁性纳米颗粒被人类干细胞摄取及发生生物转化过程中的应用。

摘要

由氧化铁制成的磁性纳米颗粒因其在多种生物医学应用中的独特优势而备受关注，这些应用中磁性纳米颗粒常被细胞内化并长期留存。一个关键挑战在于如何利用可靠且精确的方法评估这些颗粒在细胞内的命运。本文介绍了使用振动样品磁强计（VSM）通过测量磁矩来精确定量细胞内磁性纳米颗粒完整性的方法。首先，利用两种类型的磁性纳米颗粒对干细胞进行标记；这些纳米颗粒通过一种快速高效的基于微波的非水溶胶-凝胶法合成，具有相同的内核，但在表面涂层上有所不同：一种采用常用的柠檬酸分子涂层，另一种则采用聚丙烯酸涂层。随后通过离心法形成三维细胞球体，并在不同时间点使用VSM测量这些球体的磁矩。所获得的磁矩可直接反映纳米颗粒的完整性，磁矩值的降低表明纳米颗粒发生了降解。实验结果显示，两种纳米颗粒的磁矩均随培养时间延长而下降，表明其发生了生物降解；同时发现，与柠檬酸涂层相比，聚丙烯酸涂层具有更好的保护作用。

引言

人们对氧化铁纳米颗粒在多种生物医学应用中的磁学特性日益关注。由于其对磁共振的响应性，氧化铁纳米颗粒可作为磁共振成像（MRI）中可靠的对比剂，这一优势在再生医学中尤为突出，因为标记了磁性纳米颗粒的细胞在植入后可实现体内追踪1。利用磁场还可实现对细胞的远程操控；通过这种方法，可磁性地构建细胞球体2,3、环状结构4或片层结构5，并对其进行远程刺激6，这在无支架组织工程的发展中具有重要意义。这些纳米颗粒的应用范围还包括药物递送系统7,8以及用于杀伤癌细胞的磁感应和光诱导热疗9,10,11。在所有这些应用中，纳米颗粒通常通过静脉注射或直接被细胞内化的方式进入生物环境，并长期存留于其中，因而引发了对其细胞内命运的关注。

体内分析提供了对纳米颗粒在生物体内命运的总体认识：注射进入血液后，它们首先主要被肝脏（库普弗细胞）、脾脏和骨髓中的巨噬细胞捕获，随后逐渐降解，并进入生物体的铁池12,13,14,15,16,17,18,19。只有当纳米颗粒在生物体内循环时，才可能进行定性观察。通常，可利用透射电子显微镜（TEM）直接观察纳米颗粒，而器官中铁的存在则可通过含量测定来确定。近年来，已能在封闭体系中对细胞群体直接评估其命运，即在无铁流失的条件下，实现对细胞水平上纳米颗粒生物转化的定量测量20,21,22。此类测量可通过分析纳米颗粒的磁学性质实现，因其磁性与结构完整性密切相关。振动样品磁强计（VSM）是一种通过周期性振动样品，使检测线圈测量感应磁通量，从而获得样品在外加磁场下的磁矩的技术。这种同步检测方法可实现快速测量，有利于对大量样品的磁矩进行测定20,21,22,23。VSM获得的宏观磁信号可定量反映整个生物样品的情况，并直接关联于纳米颗粒的尺寸与结构。特别是，它可提供样品在饱和状态下的磁矩（以 emu 表示），这是对样品中磁性纳米颗粒数量及其特有磁学性质的直接量化指标。

研究表明，磁性纳米颗粒的细胞内加工过程与其结构特征密切相关20。这些特征可通过优化的合成方案进行调控。每种方案均有其优势与局限性。氧化铁纳米颗粒通常通过铁离子在水溶液中的共沉淀法合成24。为克服纳米颗粒尺寸多分散性的局限，已发展出多元醇介导的溶胶-凝胶法等其他合成方法25。非水相热分解法可制备出尺寸高度均一的氧化铁纳米颗粒26。然而，该方法需使用大量表面活性剂（如油胺或油酸），使得其在生物医学应用中的功能化及水相转移过程变得复杂。因此，我们采用一种非水相溶胶-凝胶路线合成此类磁性纳米颗粒，以获得高结晶度、高纯度和良好可重复性27。该方案可制备出尺寸高度可控的纳米颗粒，并可通过调节温度实现尺寸调节28。然而，微波辅助的非水相溶胶-凝胶法所制得的纳米颗粒尺寸上限约为12 nm，因此该方法不适用于室温下使用铁磁性颗粒的应用场景。除核结构的合成外，另一个需要考虑的关键因素是表面涂层。涂层位于纳米颗粒表面，可作为锚定分子促进纳米颗粒的靶向内化，或保护纳米颗粒免于降解。由于苯甲醇同时充当氧源和配体，因此无需额外添加表面活性剂或配体即可获得裸纳米颗粒。合成后，纳米颗粒可直接进行表面功能化，无需经历表面活性剂置换过程。

本文评估了两种具有相同核心但涂层不同的纳米颗粒。核心采用一种快速且高效的微波辅助技术合成。所比较的两种涂层分别为柠檬酸——在生物医学应用中使用最广泛的涂层试剂之一29,30——和聚丙烯酸（PAA），后者是一种具有大量螯合功能的聚合物涂层。随后采用振动样品磁强计（VSM）测量，首先定量纳米颗粒被细胞摄取的程度，进而直接评估纳米颗粒在干细胞内化后结构的完整性。结果表明，孵育浓度影响纳米颗粒的摄取量，而涂层则影响其降解行为，其中PAA所含大量锚定分子可保护核心免受降解。

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方案

1. 磁性纳米颗粒的合成

  1. 核合成——微波辅助
    1. 将400 mg的乙酰丙酮铁(III)（>99.9%）溶解于30 mL单模微波玻璃小瓶中的10 mL苯甲醇（BA, 99.8%）内。
    2. 使用微波反应器在20分钟内将悬浮液温度从25 °C升至250 °C（升温速率为11.25 °C/min），并在250 °C下维持30分钟。
    3. 将所得悬浮于苯甲醇中的纳米颗粒转移至玻璃小瓶中，并使用钕磁铁分离30分钟。
    4. 在前述100 mL玻璃小瓶中，用10 mL二氯甲烷、1 M氢氧化钠、乙醇和pH 7的水（各三次）洗涤沉淀；每次使用钕磁铁分离5分钟以沉淀纳米颗粒，并移除上清液。
    5. 用1 M盐酸调节纳米颗粒水悬浮液的pH至2，然后在100 kDa超滤离心滤膜中以2,200 × g离心10分钟。
    6. 弃去滤液，向纳米颗粒溶液中加入12 mL 10-2 M盐酸，再在100 kDa超滤离心滤膜中以2,200 × g离心10分钟（重复三次）。随后在包覆前将纳米颗粒溶液稀释于10 mL 10-2 M盐酸中。
  2. 包覆
    1. 在100 mL玻璃小瓶中将175 mg柠檬酸和聚丙烯酸溶于pH 2的水中，并用1 M盐酸溶液调节pH至2。
    2. 将10 mL纳米颗粒水分散液加入包覆分子溶液中，使包覆分子与纳米颗粒的质量比为5。在室温下磁力搅拌反应2小时。
    3. 反应结束后，用1 M氢氧化钠调节pH至7。
    4. 将纳米颗粒溶液在100 kDa超滤离心滤膜中用去离子 (DI)水洗涤离心三次，每次2,200 × g离心10分钟；弃去滤液后将纳米颗粒溶液稀释于12 mL DI水中。

2. 干细胞的培养与磁性标记

  1. 在 37 °C 和 5% CO2 条件下，使用完全型间充质干细胞生长培养基（MSCGM）培养人源间充质干细胞（MSC）。当细胞融合度达到 90% 时，每 150 cm² 培养瓶中加入 10 mL 预热至 37 °C 的胰蛋白酶-EDTA 溶液，孵育 2–3 分钟以使细胞脱落。
    1. 判断细胞是否脱落时，可用明场显微镜观察。将脱落的细胞重新悬浮于 MSCGM 中，并按 1:4 传代至四个 150 cm² 培养瓶中。以此方式扩增细胞，直至第 4 至第 5 代。
  2. 准备用于细胞标记的磁性纳米颗粒溶液：将选定浓度的氧化铁纳米颗粒分散于无血清、无谷氨酰胺的 RPMI-1640 培养基（Roswell Park Memorial Institute medium）中。由于 RPMI 的离子强度低于 DMEM，有助于减少纳米颗粒聚集，因此用于纳米颗粒孵育及相关洗涤步骤。
  3. 当细胞处于第 4 或第 5 代且融合度达 90% 时，移除 MSCGM 培养基，用无血清、无谷氨酰胺的 RPMI 洗涤细胞一次，然后每 150 cm2 培养瓶中加入 10 mL 氧化铁纳米颗粒溶液，此为覆盖全部细胞所需的最小体积。
  4. 在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 30 分钟后弃去纳米颗粒溶液。用无血清 RPMI-1640（不含谷氨酰胺）洗涤一次，随后加入含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（每 150 cm2 培养瓶加 25 mL），在 37 °C 和 5% CO2 条件下过夜孵育，以促进纳米颗粒的完全内化。

3. 干细胞球体的形成

  1. 新鲜配制细胞球体培养基，该培养基由含L-谷氨酰胺的高糖DMEM组成，并添加50 µM L-抗坏血酸-2-磷酸、0.1 µM 地塞米松、1 mM 丙酮酸钠、0.35 mM L-脯氨酸，以及1%含胰岛素、人转铁蛋白和亚硒酸（ITS-Premix）的通用培养添加剂。
  2. 向每瓶150 cm2培养瓶中加入10 mL预热至37 °C的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，作用2–3分钟，使磁性MSCs细胞脱落。细胞脱落后，立即加入相当于胰蛋白酶体积1/3的、预热至37 °C的含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，以中和胰蛋白酶活性。
  3. 将消化后的细胞在260 × g条件下离心5分钟，吸除上清液，用少量（每150 cm²培养瓶少于1 mL）细胞球体培养基重悬细胞，例如将200,000个细胞重悬于约50 µL培养基中。使用血细胞计数板计数细胞数量，并根据需要调整体积。
  4. 在15 mL无菌圆锥形离心管中加入1 mL新配制的细胞球体培养基，然后加入相当于200,000个细胞的重悬液。
  5. 将上述磁标记细胞在180 × g条件下离心3分钟，使细胞在管底形成细胞沉淀，并保留上清液（即细胞培养基）。
  6. 将离心管略微打开以允许气体交换，在37 °C、5% CO2条件下培养最多21天。在此培养期间，细胞形成结构紧密的三维结构，最终形成完整的球体。每周更换培养基两次。
  7. 在指定时间点，用由0.2 M 卡卡基酸盐溶于去离子水配制的卡卡基酸盐缓冲液洗涤球体两次，然后在室温下用0.1 M 卡卡基酸盐缓冲液（用蒸馏水稀释）中含2%戊二醛的固定液固定30分钟。固定后的球体保存于PBS中，待用于VSM测量或透射电镜（TEM）成像。此固定步骤可终止所有生物过程，实现长期保存。

4. 使用振动样品磁强计（VSM）在溶液和细胞内定量磁性纳米颗粒

  1. 将特定体积的磁性纳米颗粒溶液（最大10 µL）或单个细胞球状体放入专为VSM设计的样品 holder 中。
  2. 将样品插入VSM，并扫描样品偏移量。将样品置于对应磁化强度最大值的位置。
  3. 在低磁场（-1500 Oe 至 +1500 Oe 之间）下以 20 Oe/s 的速率进行第一次测量。
  4. 在高磁场（-30 000 Oe 至 +30 000 Oe 之间）下以 200 Oe/s 的速率进行第二次测量。

5. 透射电子显微镜（TEM）分析

  1. 对于纳米颗粒溶液，取10 μL水溶液滴加到碳支持铜网上，在室温下自然干燥。
  2. 对于细胞内化的纳米颗粒，使用0.5%的乌龙茶提取物（OTE）溶于0.1 M卡考基缓冲液中对固定后的细胞球体进行染色，随后用含有1.5%铁氰化钾的1%四氧化锇进行后固定，再经梯度乙醇脱水，包埋于Epon树脂中。切取70 nm的超薄切片，并将其转移至铜网上。
  3. 使用电子显微镜在80 kV电压下成像，放大倍数从1k（用于观察完整细胞）至40k（用于观察内体结构）。

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结果

采用微波辅助合成法，制备出具有单分散性的磁性纳米颗粒，其核芯尺寸为8.8 ± 2.5 nm，并以柠檬酸盐或聚丙烯酸（PAA）进行包覆（图1A）。随后，将干细胞与分散在培养基中特定浓度的上述纳米颗粒共孵育30分钟，使其通过内吞作用进入细胞并被限制在细胞内体中（图1B）。磁性标记的干细胞经悬浮于培养基中，离心后形成细胞沉淀，将该沉淀继续培养至多21天（图1C）。所获得的细胞球体经固定以终止生物过程后，保存于磷酸盐缓冲液（PBS）中，直至通过振动样品磁强计（VSM）进行测量。

首先，使用振动样品磁强计（VSM）测量纳米颗粒溶液的磁矩：取含有7 µg铁的10 µL纳米颗粒水分散液进行测量，所得曲线如图2A所示。由于该溶液中含有水以及样品 holder 的存在，除纳米颗粒的超顺磁信号外，还会检测到抗磁信号。可通过测量曲线第二部分斜率得到相应的抗磁常数（M<...

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讨论

通过快速高效的微波辅助合成方法，可轻松制备出尺寸可控的磁性纳米颗粒，并可进一步用特定分子进行包覆。关键步骤是将铁盐和苯甲醇在真空条件下储存，以确保颗粒尺寸分布较窄。苯甲醇同时作为溶剂和配体，使得无需额外添加配体即可直接获得尺寸均一的裸铁氧化物纳米颗粒。在将纳米颗粒转移至水中后，裸磁性纳米颗粒可被多种不同配体轻松包覆。该包覆层赋予纳米颗粒间以及纳米颗粒与细胞间的相互作用特性，从而影响其细胞内化程度；这一参数需要严格控制，因为生物医学应用通常要求最低限度的内化，而过高的内化可能对细胞造成损伤，并潜在引发细胞毒性事件31。磁学测量是一种强大的工具，可用于评估纳米颗粒的细胞内化程度及其在细胞内的命运。将磁性纳米颗粒引入干细胞后，可通过简单的离心操作形成类球体，随后在抑制细胞增殖并促进细胞外基质生成的培养基中进行培养。细胞间黏附性显著增强，并开始构建组织结构。这些类球体易于操作，且可长期培养（数月），从而实现对磁性纳米颗粒在生物环境中长期命运的追踪。通过抑制细胞分裂，可避免纳米颗粒从母细胞向子细胞的稀释；此外，已有研究证实，在该细胞类球体模型中，培养一个月期间未发生铁元素的流失

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由欧洲联盟（ERC-2014-CoG 项目 MaTissE #648779）资助。作者谨此致谢 巴黎第十三大学 CNanoMat 物理化学表征平台。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1x)Life Technologies25300-054
用于合成的苯甲醇Sigma Aldrich8.22259
地塞米松SigmaD4902用100%乙醇配制1 mM的储备液，并于-20°C保存
二氯甲烷 ≥99%，稳定化，GPR RECTAPURVWR Chemicals23367
含Glutamax I的DMEM培养基Life Technologies31966-021不含丙酮酸钠，不含HEPES
无水乙醇VWR20821.310
胎牛血清Life Technologies10270-106
10%中性缓冲福尔马林溶液SigmaHT5012
盐酸，1.0N 标准溶液Alfa Aesar35640
乙酰丙酮铁(III)（> 99.9%）Sigma Aldrich517003
ITS预混通用培养补充剂 (20x)Corning354352
L-抗坏血酸-2-磷酸SigmaA8960用蒸馏水新鲜配制浓缩溶液（25 mM）
L-脯氨酸SigmaP5607用蒸馏水配制175 mM的储备液，并于4°C保存
间充质干细胞（MSC）LonzaPT-2501
Monowave玻璃小瓶Anton Paar82723_us
微波反应仪Anton PaarMonowave 300
MSCGM BulletKit培养基LonzaPT-3001配制完全培养基时，将提供的BulletKit（含血清、谷氨酰胺和抗生素）加入MSCGM培养基中
不含CaCl₂和MgCl₂的PBSLife Technologies14190-094
青霉素（10,000 U/mL）/链霉素（10,000µg/mL）Life Technologies15140-122
聚丙烯酸钠盐Sigma Aldrich416010分子量 = 1200 g/mol
RPMI 1640培养基，不含谷氨酰胺Life Technologies31870-025不含丙酮酸钠，不含HEPES
氢氧化钠，1.0N 标准溶液Alfa Aesar35629
丙酮酸钠溶液 100 mMSigmaS8636
无菌锥形离心管Falcon35209715 mL离心管
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红Thermo Fisher Scientific25300054
三水合柠檬酸钠VWR33615.268用蒸馏水配制1 M的储备液，并于4°C保存
二水合柠檬酸三钠，分析纯认证试剂Sigma Aldrich10396430
超滤离心管AmiconAC S510024

参考文献

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磁性纳米颗粒振动样品磁强计细胞球体形成纳米颗粒生物降解干细胞标记微波合成柠檬酸包覆聚丙烯酸包覆磁矩测量
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