通过非水溶胶-凝胶法制备氧化铁纳米颗粒,并用阴离子短链分子或聚合物进行包覆。利用振动样品磁强计(VSM),展示了磁强测量技术在监测磁性纳米颗粒被人类干细胞摄取及发生生物转化过程中的应用。
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通过非水溶胶-凝胶法制备氧化铁纳米颗粒,并用阴离子短链分子或聚合物进行包覆。利用振动样品磁强计(VSM),展示了磁强测量技术在监测磁性纳米颗粒被人类干细胞摄取及发生生物转化过程中的应用。
由氧化铁制成的磁性纳米颗粒因其在多种生物医学应用中的独特优势而备受关注,这些应用中磁性纳米颗粒常被细胞内化并长期留存。一个关键挑战在于如何利用可靠且精确的方法评估这些颗粒在细胞内的命运。本文介绍了使用振动样品磁强计(VSM)通过测量磁矩来精确定量细胞内磁性纳米颗粒完整性的方法。首先,利用两种类型的磁性纳米颗粒对干细胞进行标记;这些纳米颗粒通过一种快速高效的基于微波的非水溶胶-凝胶法合成,具有相同的内核,但在表面涂层上有所不同:一种采用常用的柠檬酸分子涂层,另一种则采用聚丙烯酸涂层。随后通过离心法形成三维细胞球体,并在不同时间点使用VSM测量这些球体的磁矩。所获得的磁矩可直接反映纳米颗粒的完整性,磁矩值的降低表明纳米颗粒发生了降解。实验结果显示,两种纳米颗粒的磁矩均随培养时间延长而下降,表明其发生了生物降解;同时发现,与柠檬酸涂层相比,聚丙烯酸涂层具有更好的保护作用。
人们对氧化铁纳米颗粒在多种生物医学应用中的磁学特性日益关注。由于其对磁共振的响应性,氧化铁纳米颗粒可作为磁共振成像(MRI)中可靠的对比剂,这一优势在再生医学中尤为突出,因为标记了磁性纳米颗粒的细胞在植入后可实现体内追踪1。利用磁场还可实现对细胞的远程操控;通过这种方法,可磁性地构建细胞球体2,3、环状结构4或片层结构5,并对其进行远程刺激6,这在无支架组织工程的发展中具有重要意义。这些纳米颗粒的应用范围还包括药物递送系统7,8以及用于杀伤癌细胞的磁感应和光诱导热疗9,10,11。在所有这些应用中,纳米颗粒通常通过静脉注射或直接被细胞内化的方式进入生物环境,并长期存留于其中,因而引发了对其细胞内命运的关注。
体内分析提供了对纳米颗粒在生物体内命运的总体认识:注射进入血液后,它们首先主要被肝脏(库普弗细胞)、脾脏和骨髓中的巨噬细胞捕获,随后逐渐降解,并进入生物体的铁池12,13,14,15,16,17,18,19。只有当纳米颗粒在生物体内循环时,才可能进行定性观察。通常,可利用透射电子显微镜(TEM)直接观察纳米颗粒,而器官中铁的存在则可通过含量测定来确定。近年来,已能在封闭体系中对细胞群体直接评估其命运,即在无铁流失的条件下,实现对细胞水平上纳米颗粒生物转化的定量测量20,21,22。此类测量可通过分析纳米颗粒的磁学性质实现,因其磁性与结构完整性密切相关。振动样品磁强计(VSM)是一种通过周期性振动样品,使检测线圈测量感应磁通量,从而获得样品在外加磁场下的磁矩的技术。这种同步检测方法可实现快速测量,有利于对大量样品的磁矩进行测定20,21,22,23。VSM获得的宏观磁信号可定量反映整个生物样品的情况,并直接关联于纳米颗粒的尺寸与结构。特别是,它可提供样品在饱和状态下的磁矩(以 emu 表示),这是对样品中磁性纳米颗粒数量及其特有磁学性质的直接量化指标。
研究表明,磁性纳米颗粒的细胞内加工过程与其结构特征密切相关20。这些特征可通过优化的合成方案进行调控。每种方案均有其优势与局限性。氧化铁纳米颗粒通常通过铁离子在水溶液中的共沉淀法合成24。为克服纳米颗粒尺寸多分散性的局限,已发展出多元醇介导的溶胶-凝胶法等其他合成方法25。非水相热分解法可制备出尺寸高度均一的氧化铁纳米颗粒26。然而,该方法需使用大量表面活性剂(如油胺或油酸),使得其在生物医学应用中的功能化及水相转移过程变得复杂。因此,我们采用一种非水相溶胶-凝胶路线合成此类磁性纳米颗粒,以获得高结晶度、高纯度和良好可重复性27。该方案可制备出尺寸高度可控的纳米颗粒,并可通过调节温度实现尺寸调节28。然而,微波辅助的非水相溶胶-凝胶法所制得的纳米颗粒尺寸上限约为12 nm,因此该方法不适用于室温下使用铁磁性颗粒的应用场景。除核结构的合成外,另一个需要考虑的关键因素是表面涂层。涂层位于纳米颗粒表面,可作为锚定分子促进纳米颗粒的靶向内化,或保护纳米颗粒免于降解。由于苯甲醇同时充当氧源和配体,因此无需额外添加表面活性剂或配体即可获得裸纳米颗粒。合成后,纳米颗粒可直接进行表面功能化,无需经历表面活性剂置换过程。
本文评估了两种具有相同核心但涂层不同的纳米颗粒。核心采用一种快速且高效的微波辅助技术合成。所比较的两种涂层分别为柠檬酸——在生物医学应用中使用最广泛的涂层试剂之一29,30——和聚丙烯酸(PAA),后者是一种具有大量螯合功能的聚合物涂层。随后采用振动样品磁强计(VSM)测量,首先定量纳米颗粒被细胞摄取的程度,进而直接评估纳米颗粒在干细胞内化后结构的完整性。结果表明,孵育浓度影响纳米颗粒的摄取量,而涂层则影响其降解行为,其中PAA所含大量锚定分子可保护核心免受降解。
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1. 磁性纳米颗粒的合成
2. 干细胞的培养与磁性标记
3. 干细胞球体的形成
4. 使用振动样品磁强计(VSM)在溶液和细胞内定量磁性纳米颗粒
5. 透射电子显微镜(TEM)分析
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采用微波辅助合成法,制备出具有单分散性的磁性纳米颗粒,其核芯尺寸为8.8 ± 2.5 nm,并以柠檬酸盐或聚丙烯酸(PAA)进行包覆(图1A)。随后,将干细胞与分散在培养基中特定浓度的上述纳米颗粒共孵育30分钟,使其通过内吞作用进入细胞并被限制在细胞内体中(图1B)。磁性标记的干细胞经悬浮于培养基中,离心后形成细胞沉淀,将该沉淀继续培养至多21天(图1C)。所获得的细胞球体经固定以终止生物过程后,保存于磷酸盐缓冲液(PBS)中,直至通过振动样品磁强计(VSM)进行测量。
首先,使用振动样品磁强计(VSM)测量纳米颗粒溶液的磁矩:取含有7 µg铁的10 µL纳米颗粒水分散液进行测量,所得曲线如图2A所示。由于该溶液中含有水以及样品 holder 的存在,除纳米颗粒的超顺磁信号外,还会检测到抗磁信号。可通过测量曲线第二部分斜率得到相应的抗磁常数(M<...
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通过快速高效的微波辅助合成方法,可轻松制备出尺寸可控的磁性纳米颗粒,并可进一步用特定分子进行包覆。关键步骤是将铁盐和苯甲醇在真空条件下储存,以确保颗粒尺寸分布较窄。苯甲醇同时作为溶剂和配体,使得无需额外添加配体即可直接获得尺寸均一的裸铁氧化物纳米颗粒。在将纳米颗粒转移至水中后,裸磁性纳米颗粒可被多种不同配体轻松包覆。该包覆层赋予纳米颗粒间以及纳米颗粒与细胞间的相互作用特性,从而影响其细胞内化程度;这一参数需要严格控制,因为生物医学应用通常要求最低限度的内化,而过高的内化可能对细胞造成损伤,并潜在引发细胞毒性事件31。磁学测量是一种强大的工具,可用于评估纳米颗粒的细胞内化程度及其在细胞内的命运。将磁性纳米颗粒引入干细胞后,可通过简单的离心操作形成类球体,随后在抑制细胞增殖并促进细胞外基质生成的培养基中进行培养。细胞间黏附性显著增强,并开始构建组织结构。这些类球体易于操作,且可长期培养(数月),从而实现对磁性纳米颗粒在生物环境中长期命运的追踪。通过抑制细胞分裂,可避免纳米颗粒从母细胞向子细胞的稀释;此外,已有研究证实,在该细胞类球体模型中,培养一个月期间未发生铁元素的流失
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作者无任何利益冲突需要披露。
本工作由欧洲联盟(ERC-2014-CoG 项目 MaTissE #648779)资助。作者谨此致谢 巴黎第十三大学 CNanoMat 物理化学表征平台。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| 用于合成的苯甲醇 | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| 地塞米松 | Sigma | D4902 | 用100%乙醇配制1 mM的储备液,并于-20°C保存 |
| 二氯甲烷 ≥99%,稳定化,GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| 含Glutamax I的DMEM培养基 | Life Technologies | 31966-021 | 不含丙酮酸钠,不含HEPES |
| 无水乙醇 | VWR | 20821.310 | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 10270-106 | |
| 10%中性缓冲福尔马林溶液 | Sigma | HT5012 | |
| 盐酸,1.0N 标准溶液 | Alfa Aesar | 35640 | |
| 乙酰丙酮铁(III)(> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS预混通用培养补充剂 (20x) | Corning | 354352 | |
| L-抗坏血酸-2-磷酸 | Sigma | A8960 | 用蒸馏水新鲜配制浓缩溶液(25 mM) |
| L-脯氨酸 | Sigma | P5607 | 用蒸馏水配制175 mM的储备液,并于4°C保存 |
| 间充质干细胞(MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave玻璃小瓶 | Anton Paar | 82723_us | |
| 微波反应仪 | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit培养基 | Lonza | PT-3001 | 配制完全培养基时,将提供的BulletKit(含血清、谷氨酰胺和抗生素)加入MSCGM培养基中 |
| 不含CaCl₂和MgCl₂的PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| 青霉素(10,000 U/mL)/链霉素(10,000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| 聚丙烯酸钠盐 | Sigma Aldrich | 416010 | 分子量 = 1200 g/mol |
| RPMI 1640培养基,不含谷氨酰胺 | Life Technologies | 31870-025 | 不含丙酮酸钠,不含HEPES |
| 氢氧化钠,1.0N 标准溶液 | Alfa Aesar | 35629 | |
| 丙酮酸钠溶液 100 mM | Sigma | S8636 | |
| 无菌锥形离心管 | Falcon | 352097 | 15 mL离心管 |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.05%),含酚红 | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| 三水合柠檬酸钠 | VWR | 33615.268 | 用蒸馏水配制1 M的储备液,并于4°C保存 |
| 二水合柠檬酸三钠,分析纯认证试剂 | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| 超滤离心管 | Amicon | AC S510024 |
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