利用磁力测量法监测化学合成氧化铁纳米颗粒的细胞摄取及后续生物降解

摘要

通过非水溶胶-凝胶法制备氧化铁纳米颗粒，并用阴离子短链分子或聚合物进行包覆。利用振动样品磁强计（VSM），展示了磁强测量技术在监测磁性纳米颗粒被人类干细胞摄取及发生生物转化过程中的应用。

摘要

由氧化铁制成的磁性纳米颗粒因其在多种生物医学应用中的独特优势而备受关注，这些应用中磁性纳米颗粒常被细胞内化并长期留存。一个关键挑战在于如何利用可靠且精确的方法评估这些颗粒在细胞内的命运。本文介绍了使用振动样品磁强计（VSM）通过测量磁矩来精确定量细胞内磁性纳米颗粒完整性的方法。首先，利用两种类型的磁性纳米颗粒对干细胞进行标记；这些纳米颗粒通过一种快速高效的基于微波的非水溶胶-凝胶法合成，具有相同的内核，但在表面涂层上有所不同：一种采用常用的柠檬酸分子涂层，另一种则采用聚丙烯酸涂层。随后通过离心法形成三维细胞球体，并在不同时间点使用VSM测量这些球体的磁矩。所获得的磁矩可直接反映纳米颗粒的完整性，磁矩值的降低表明纳米颗粒发生了降解。实验结果显示，两种纳米颗粒的磁矩均随培养时间延长而下降，表明其发生了生物降解；同时发现，与柠檬酸涂层相比，聚丙烯酸涂层具有更好的保护作用。

引言

人们对氧化铁纳米颗粒在多种生物医学应用中的磁学特性日益关注。由于其对磁共振的响应性，氧化铁纳米颗粒可作为磁共振成像（MRI）中可靠的对比剂，这一优势在再生医学中尤为突出，因为标记了磁性纳米颗粒的细胞在植入后可实现体内追踪¹。利用磁场还可实现对细胞的远程操控；通过这种方法，可磁性地构建细胞球体^2,3、环状结构⁴或片层结构⁵，并对其进行远程刺激⁶，这在无支架组织工程的发展中具有重要意义。这些纳米颗粒的应用范围还包括药物递送系统^7,8以及用于杀伤癌细胞的磁感应和光诱导热疗^9,10,11。在所有这些应用中，纳米颗粒通常通过静脉注射或直接被细胞内化的方式进入生物环境，并长期存留于其中，因而引发了对其细胞内命运的关注。

体内分析提供了对纳米颗粒在生物体内命运的总体认识：注射进入血液后....

方案

1. 磁性纳米颗粒的合成

1. 核合成——微波辅助
   1. 将400 mg的乙酰丙酮铁(III)（>99.9%）溶解于30 mL单模微波玻璃小瓶中的10 mL苯甲醇（BA, 99.8%）内。
   2. 使用微波反应器在20分钟内将悬浮液温度从25 °C升至250 °C（升温速率为11.25 °C/min），并在250 °C下维持30分钟。
   3. 将所得悬浮于苯甲醇中的纳米颗粒转移至玻璃小瓶中，并使用钕磁铁分离30分钟。
   4. 在前述100 mL玻璃小瓶中，用10 mL二氯甲烷、1 M氢氧化钠、乙醇和pH 7的水（各三次）洗涤沉淀；每次使用钕磁铁分离5分钟以沉淀纳米颗粒，并移除上清液。
   5. 用1 M盐酸调节纳米颗粒水悬浮液的pH至2，然后在100 kDa超滤离心滤膜中以2,200 × g离心10分钟。
   6. 弃去滤液，向纳米颗粒溶液中加入12 mL 10^-2 M盐酸，再在100 kDa超滤离心滤膜中以2,200 × g离心10分钟（重复三次）。随后在包覆前将纳米颗粒溶液稀释于10 mL 10^-2 M盐酸中。
2. 包覆
   1. 在100 mL玻璃小瓶中将175 mg柠檬酸和聚丙烯酸溶于pH 2的水中，并用1 M盐酸溶液调节pH至2。
   2. 将10 mL纳米颗粒水分....

结果

采用微波辅助合成法，制备出具有单分散性的磁性纳米颗粒，其核芯尺寸为8.8 ± 2.5 nm，并以柠檬酸盐或聚丙烯酸（PAA）进行包覆（图1A）。随后，将干细胞与分散在培养基中特定浓度的上述纳米颗粒共孵育30分钟，使其通过内吞作用进入细胞并被限制在细胞内体中（图1B）。磁性标记的干细胞经悬浮于培养基中，离心后形成细胞沉淀，将该沉淀继续培养至多21天（图1C）。所获得的细胞球体经固定以终止生物过程后，保存于磷酸盐缓冲液（PBS）中，直至通过振动样品磁强计（VSM）进行测量。

首先，使用振动样品磁强计（VSM）测量纳米颗粒溶液的磁矩：取含有7 µg铁的10 µL纳米颗粒水分散液进行测量，所得曲线如图2A所示。由于该溶液中含有水以及样品 holder 的存在，除纳米颗粒的超顺磁信号外，还会检测到抗磁信号。可通过测量曲线第二部分斜率得到相应的抗磁常数（M<.......

讨论

通过快速高效的微波辅助合成方法，可轻松制备出尺寸可控的磁性纳米颗粒，并可进一步用特定分子进行包覆。关键步骤是将铁盐和苯甲醇在真空条件下储存，以确保颗粒尺寸分布较窄。苯甲醇同时作为溶剂和配体，使得无需额外添加配体即可直接获得尺寸均一的裸铁氧化物纳米颗粒。在将纳米颗粒转移至水中后，裸磁性纳米颗粒可被多种不同配体轻松包覆。该包覆层赋予纳米颗粒间以及纳米颗粒与细胞间的相互作用特性，从而影响其细胞内化程度；这一参数需要严格控制，因为生物医学应用通常要求最低限度的内化，而过高的内化可能对细胞造成损伤，并潜在引发细胞毒性事件³¹。磁学测量是一种强大的工具，可用于评估纳米颗粒的细胞内化程度及其在细胞内的命运。将磁性纳米颗粒引入干细胞后，可通过简单的离心操作形成类球体，随后在抑制细胞增殖并促进细胞外基质生成的培养基中进行培养。细胞间黏附性显著增强，并开始构建组织结构。这些类球体易于操作，且可长期培养（数月），从而实现对磁性纳米颗粒在生物环境中长期命运的追踪。通过抑制细胞分裂，可避免纳米颗粒从母细胞向子细胞的稀释；此外，已有研究证实，在该细胞类球体模型中，培养一个月期间未发生铁元素的流失

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
用于合成的苯甲醇	Sigma Aldrich	8.22259
地塞米松	Sigma	D4902	用100%乙醇配制1 mM的储备液，并于-20°C保存
二氯甲烷 ≥99%，稳定化，GPR RECTAPUR	VWR Chemicals	23367
含Glutamax I的DMEM培养基	Life Technologies	31966-021	不含丙酮酸钠，不含HEPES
无水乙醇	VWR	20821.310
胎牛血清	Life Technologies	10270-106
10%中性缓冲福尔马林溶液	Sigma	HT5012
盐酸，1.0N 标准溶液	Alfa Aesar	35640
乙酰丙酮铁(III)（> 99.9%）	Sigma Aldrich	517003
ITS预混通用培养补充剂 (20x)	Corning	354352
L-抗坏血酸-2-磷酸	Sigma	A8960	用蒸馏水新鲜配制浓缩溶液（25 mM）
L-脯氨酸	Sigma	P5607	用蒸馏水配制175 mM的储备液，并于4°C保存
间充质干细胞（MSC）	Lonza	PT-2501
Monowave玻璃小瓶	Anton Paar	82723_us
微波反应仪	Anton Paar	Monowave 300
MSCGM BulletKit培养基	Lonza	PT-3001	配制完全培养基时，将提供的BulletKit（含血清、谷氨酰胺和抗生素）加入MSCGM培养基中
不含CaCl₂和MgCl₂的PBS	Life Technologies	14190-094
青霉素（10,000 U/mL）/链霉素（10,000µg/mL）	Life Technologies	15140-122
聚丙烯酸钠盐	Sigma Aldrich	416010	分子量 = 1200 g/mol
RPMI 1640培养基，不含谷氨酰胺	Life Technologies	31870-025	不含丙酮酸钠，不含HEPES
氢氧化钠，1.0N 标准溶液	Alfa Aesar	35629
丙酮酸钠溶液 100 mM	Sigma	S8636
无菌锥形离心管	Falcon	352097	15 mL离心管
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)，含酚红	Thermo Fisher Scientific	25300054
三水合柠檬酸钠	VWR	33615.268	用蒸馏水配制1 M的储备液，并于4°C保存
二水合柠檬酸三钠，分析纯认证试剂	Sigma Aldrich	10396430
超滤离心管	Amicon	AC S510024