高通量测定个体酒精镇静时间的方法 黑腹果蝇

摘要

目前测量黑腹果蝇（Drosophila）酒精敏感性的方法主要用于检测果蝇群体。本文介绍一种简单、低成本、高通量的检测方法，可用于评估大量单只果蝇的酒精镇静敏感性。该方法无需特殊设备，仅使用常规实验材料，可在任何实验室中实施。

摘要

Drosophila melanogaster 是研究酒精敏感性遗传基础的优良模型。与人类群体研究相比，Drosophila 模型能够严格控制遗传背景，并可在良好控制的环境条件下快速培育出数量几乎不受限制的同基因型个体，且无需遵守伦理监管限制，成本相对较低。果蝇在接触乙醇后会出现生理和行为上的改变，类似于人类的酒精中毒表现，包括姿势控制能力丧失、镇静以及耐受性的形成。本文介绍一种简单、低成本、高通量的检测方法，可用于评估大量单只果蝇对酒精镇静的敏感性。该方法基于视频记录，将未麻醉的单只果蝇放入24孔细胞培养板中，在可同步启动酒精暴露的装置内进行观察。该系统使单人在8小时工作时间内可获得多达2,000只果蝇的个体乙醇镇静数据。原则上，该检测方法可扩展用于评估任何挥发性物质暴露的影响，并可用于测量挥发性物质对其他昆虫（包括其他蝇类物种）的急性毒性效应。

引言

美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所报告称，2015年，约有1600万美国人受到过量饮酒的影响，这种情况被定义为"酒精使用障碍"。酗酒会导致广泛的不良生理效应，是美国主要的死亡原因之一。在人类中，对酒精的敏感性降低，即对酒精的低反应水平，具有显著的遗传成分，并与发生酒精使用障碍的风险升高相关^1,2,3,4。由于人群混合、不同的发育历史和环境暴露，以及依赖自我报告的问卷来量化酒精相关表型（这些表型常与其他神经精神疾病相互混淆），在人类群体中开展遗传风险研究具有挑战性。

Drosophila melanogaster 是研究酒精敏感性遗传基础的优良模型^5,6,7,8。利用 Drosophila 模型可严格控制遗传背景，并能在严格控制的环境条件下，以相对较低的成本快速培育出数量几乎不受限制的同基因型个体，且无需受到伦理监管限制。除了公共数据库中已有的大量基因突变体和靶向基因组中大多数基因的RNAi品系外，Drosophila melanogaster 遗传参考面板（DGRP）——由205个具有完整基因组序列的近交野生来源品系组成的群体——的建立，使得全基因组关联研究成为可能^9,10。此类研究已鉴定出与发育期乙醇暴露所导致的发育时间和存活力变化相关的遗传网络^11,12。由于基本生物学过程在进化上的保守性，可通过将人类直系同源基因映射到果蝇中的对应基因，从而进行跨物种的推论。

暴露于乙醇的果蝇会经历生理和行为上的变化，这些变化类似于人类的酒精中毒，包括姿势控制能力丧失⁸、镇静以及耐受性的形成^13,14,15。在黑腹果蝇（Drosophila）中，酒精诱导的镇静效应可通过醉酒计（inebriometer）进行定量分析。醉酒计是一种长122 cm的垂直玻璃柱，内部设有倾斜的网状隔板，果蝇可附着其上^16,17,18。将至少50只果蝇（可分别分析不同性别）从柱顶引入，并使其暴露于乙醇蒸气中。失去姿势控制的果蝇会沿柱下落，并以每分钟为间隔被收集。平均洗脱时间可作为酒精中毒敏感性的衡量指标。当果蝇在首次暴露后恢复，再次接触酒精时，可表现出耐受性的形成，表现为平均洗脱时间发生改变^13,15,19,20。尽管醉酒计检测已帮助识别出与酒精镇静敏感性及耐受性形成相关的基因、基因调控网络和细胞通路^12,13,14,21，但该检测方法耗时较长、通量低，且无法有效测量单只果蝇的酒精敏感性。

无需复杂醉酒测定仪装置的替代性乙醇镇静检测方法虽可实现更便捷的测量，但在通量方面仍有限制，通常仍需对果蝇群体而非个体进行分析^{21,22,23,24,25}。对单只果蝇进行评估可最大限度地减少因群体间相互作用（例如源于社会行为的影响）带来的混杂效应。本文介绍一种简单、低成本、高通量的检测方法，可用于大规模评估单只果蝇对酒精镇静的敏感性。

方案

1. 测试装置的构建

1. 使用硬纸板和24孔细胞培养板，通过将培养板轮廓描在硬纸板上并裁剪出相应区域，制作一个与24孔细胞培养板尺寸相同的硬纸板模板。
2. 利用步骤1.1中制作的硬纸板模板，裁剪一块与细胞培养板尺寸相同的小型昆虫筛网。
3. 使用热熔胶枪，在24孔细胞培养板顶部边缘周围涂上一圈热熔胶，并将筛网固定在敞口孔的上方，以完成培养板的制备。
4. 使用热熔胶枪，将木制冰棒棍分别固定在步骤1.3中同一细胞培养板的三个侧边上。改造后的细胞培养板应与图1A所示的板示意图以及图2所示的实验装置相似。
   注意：准备的细胞培养板数量应至少等于摄像室中可容纳的数量（见下文）。

图1：测试装置与拍摄腔室示意图。（A）上图。分别为测试装置的俯视图、侧视图和正视图。一层筛网平铺于24孔细胞培养板上方。箭头所示的木制压舌板固定在相邻的三个边上，以提供稳定性和对齐辅助：在具有六个孔的一侧放置两根，在具有四个孔的一侧放置一根。所有部件均使用热熔胶粘接固定。（B）下图。分别为检测装置设置的俯视图、侧视图和正视图。盒子右侧切有一条狭缝，从盖子开口处延伸至开口后缘，狭缝底部与内表面齐平。盒子顶部（与地面平行的表面）中央开有一个孔，以实现最佳视频拍摄视野。阴影框表示视频摄像机。请点击此处查看该图的放大版本。

图2： 检测系统的照片。 视频相机放置在聚苯乙烯腔室顶部，镜头插入腔室顶部的切口孔中，如图1B示意图所示。两套改造后的24孔细胞培养板放置在照明垫上，照明垫从腔室侧面的狭缝中插入。请点击此处查看该图的放大版本。

2. 成像室的构建

1. 通过在聚苯乙烯盒的一侧切割出与摄像机镜头大小相同的孔来制作拍摄室。在聚苯乙烯盒的另一侧切割出一条宽度与照明垫相匹配的狭缝。拍摄室应类似于图1B和图2中所示的拍摄室。
2. 将照明垫插入狭缝中，并将摄像机放置在照明垫上方的镜头孔中，以准备使用拍摄室。
3. 将所有材料放置于受控环境中，并在此环境中进行后续所有测试，理想条件为行为学实验箱，相对湿度约30%，温度25 °C，气流均匀，噪声水平低于65 dB。

3. 实验装置和果蝇的准备

1. 用移液器将 1 mL 100% 乙醇通过筛网移入每个孔中。
2. 用一块纱布将筛网擦干。
3. 使用步骤 1.1 中制作的纸板模板，裁剪两块与细胞培养板尺寸相同的纱布。将其放置在已改装的细胞培养板的干燥筛网上方，该培养板中已含有步骤 3.2 中的乙醇。
4. 以步骤 1.1 中制作的纸板模板为大致参考，在薄而柔韧的塑料砧板上描出轮廓，并在一侧短边方向将轮廓扩大 1–2 cm。从塑料砧板上裁下扩大后的区域。裁剪后，确保该塑料片仍能插入检测装置的三根木棒之间，但有一端应悬出 1–2 cm。
5. （可选）若需自制吸液装置，可先将一个 P1000 移液器吸头切成两半，取直径较大的一端插入一段长约 30 cm 的软管一端作为吹嘴，组装成如图 3所示的吸液装置。

图3：一种果蝇吸虫器，通过可更换的吹嘴连接柔性软管和带有棉纱塞的宽口径血清移液管来收集果蝇。操作者可在无需麻醉的情况下，将单只果蝇吸入移液管中进行转移。请点击此处查看该图的放大版本。

6. （可选）为完成吸虫器的组装，用纱布覆盖一段10 cm移液管的宽口端，以防止果蝇进入导管，然后将移液管（纱布端朝前）插入导管的开口端，作为果蝇容纳室。吸虫器的结构应如图3所示。
7. 使用吸虫器（图3，步骤3.5和3.6），将每只果蝇分别吸入一个独立的24孔细胞培养板中。使用柔性塑料膜覆盖已吸入果蝇的孔位。记录每个果蝇所在的孔位及其相关的基因型或表型信息。
8. 将柔性塑料膜紧贴盛有果蝇的细胞培养板顶部，防止果蝇逃逸，然后将该培养板倒置在装有乙醇的改造后细胞培养板上。柔性塑料膜应位于纱布片的上方。使用冰棒棍调整倒置的细胞培养板的位置，确保每个含乙醇的孔与每个含果蝇的孔准确对齐。
9. 实验装置应如图2所示。

4. 果蝇测试

1. 确保照明垫以最大亮度点亮，以获得最佳视觉对比度。启动摄像机开始录像。
2. 为使果蝇接触乙醇，小心移除孔板与测试装置之间的塑料隔层，注意不要松动纱布。
3. 当所有果蝇均失去姿势控制时，终止视频录制。一旦怀疑所有果蝇均已失去姿势控制，应用力轻敲孔板中心，确认所有果蝇完全丧失姿势控制能力。若观察到任何运动，则继续录制视频。此后每隔1–2分钟定期轻敲一次，直至无任何运动反应为止。
4. （可选）为快速回收果蝇，仅移除测试装置的上层平板，露出静卧在纱布上的麻醉果蝇。用吸管将单个果蝇吸入选定容器中进行恢复。
5. 在改良的细胞培养板中，至少每小时更换一次1 mL新鲜的100%乙醇，以补偿乙醇挥发和湿度变化，确保整个实验过程中乙醇暴露条件一致。用纱布擦干筛网。
6. 根据需要重复上述步骤。
   注意：为提高通量，可在视频录制过程中将下一批果蝇用吸管转移至新的细胞培养板中。此步骤可暂停，视频可在后续时间进行回看分析。

5. 果蝇麻醉时间的测定

1. 通过观看视频记录每只果蝇的镇静时间。镇静时间定义为果蝇完全丧失姿势控制能力和运动能力的时刻。建议倒放视频，记录果蝇开始移动的时间，以确保准确性。

结果

两个24孔微孔板可在短短10分钟内同时获取48只果蝇的个体数据。 表1 列出两个DGRP品系果蝇在酒精暴露下对发育时间和存活力具有不同敏感性的48只个体果蝇的乙醇镇静时间测量值，雌雄分别记录¹³. RAL_555品系果蝇比RAL_177品系果蝇敏感性更低（图4, 表2；p < 0.0001，ANOVA）。RAL_177 的雄性和雌性未表现出性别二态性效应（图4, 表 2；p > 0.1，ANOVA），而RAL_555品系的雌性对乙醇暴露的敏感性低于雄性（图4, 表2；p < 0.006，ANOVA）。可同时测量大量果蝇，并能同步测量不同性别和不同品系，从而减少环境变异带来的误差，提高实验准确性。

A.	乙醇镇静时间 (s)						B.	乙醇镇静时间 (s)
	雌性			雄性				雌性			雄性
	414	365	477	423	568	309		937	742	622	460	331	498
	201	384	498	411	523	626		791	619	197	467	455	562
	228	364	333	440	403	267		504	744	513	570	582	506
	440	416	404	408	422	384		970	540	369	865	533	492
	888	283	285	322	369	287		595	550	606	392	544	345
	1079	519	315	393	376	284		418	709	553	308	477	388
	718	287	432	275	206	411		366	564	558	385	576	377
	598	337	398	279	631	372		437	692	578	460	511	412
	241	398	364	347	374	808		665	729	484	532	425	354
	229	423	534	386	396	628		312	576	305	334	531	506
	388	488	451	523	322	533		682	638	420	560	548	379
	252	529	375	427	330	540		1045	741	708	832	509	472
	674	401	303	401	307	311		394	675	381	477	449	784
	303	453	351	429	525	262		540	690	520	556	495	226
	258	483	302	389	562	319		356	615	336	454	524	590
	346	426	385	416	596	287		626	678	840	634	677	509

表1：乙醇镇静时间的测量结果 (s) 果蝇个体的 (A) DGRP品系RAL_177和 (B) RAL_555 用于性别分离 (n = 48). 参见 表 2, 图4.

图4：DGRP品系RAL_177和RAL_555果蝇的酒精镇静时间。 柱状图表示均值，误差线表示标准误（SEM，n = 48）。RAL_177果蝇的镇静时间短于RAL_55果蝇（p < 0.0001，ANOVA）。个体数据点见表1。性别与品系之间的其他具有统计学显著性的差异在正文及表2中注明。请点击此处查看此图的放大版本。

分析	变异来源	df	SS	F值	P值
全模型合并	品系	1	769627	34.869	<0.0001
	性别	1	105001	4.757	0.0304
	品系 × 性别	1	86021	3.897	0.0498
	误差	188	4149491
简化模型（雌性）	品系	1	685126	23.58	<0.0001
	误差	94	2730718
简化模型（雄性）	品系	1	170522	11.3	0.0011
	误差	94	1418774
简化模型 RAL_177	性别	1	473	0.023	0.8800
	误差	94	1943741
简化模型 RAL_555	性别	1	190549	8.12	0.0054
	误差	94	2205751

表2：不同性别和DGRP品系间镇静时间的方差分析。 采用的模型为 Y = µ + L + S + LxS + ε，其中µ为总体均值，L为DGRP品系（RAL_177、RAL_555）的固定效应，S为性别（雄性、雌性）的固定效应，LxS为交互作用项（固定效应），ε为误差项。简化模型采用Y = µ + L + ε和Y = µ + S + ε。在完整模型中，品系、性别以及品系×性别的交互作用项在α < 0.05水平均具有显著性。按性别和DGRP品系RAL_555划分的简化模型在α < 0.01水平也具有显著性。另见表1、图4。df = 自由度，SS = I型平方和。

讨论

本文介绍一种简单、低成本且高通量的方法，用于评估乙醇暴露下黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的镇静时间。与许多需要群体分析的现有方法不同，该检测方法可在8小时工作时间内由单人完成约2000只果蝇的个体镇静时间数据采集。我们发现，单人约5分钟内可记录48只果蝇的镇静时间。以此速度，2000只果蝇的记录耗时约4小时，尽管数据记录也可在后续进行。在本检测中，大多数果蝇暴露于1 mL 100%乙醇时，记录到的镇静时间范围为5–15分钟。若使用较低浓度的乙醇或较小的给药体积，则会导致更长的镇静时间。

目前评估镇静时间的方法需要测试大量果蝇，难以对单个个体进行测量^{15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26}。许多现有的镇静和敏感性检测依赖于ST50^22,23,24，即50%的果蝇因乙醇暴露而进入镇静状态的时间点。尽管获得群体果蝇的ST50值并非本检测方法开发的主要目的，但视频记录相比现有方法具有更高的应用价值，因为这些记录可用于确定经 individually tested 果蝇群体的ST50值，并可测量在任意时间点满足特定标准（例如姿势控制丧失）的果蝇百分比。需要注意的是，此类视频分析将需要额外的时间。

与现有的醉酒测定法不同，我们所描述的方法无需使用特殊设备，可利用常见材料在任何实验室中进行。采用该方法，我们已获得果蝇个体可靠的、一致的镇静时间数据。原则上，该检测方法可扩展用于评估暴露于任何挥发性物质的影响。该检测还可用于测量挥发性物质对其他昆虫（包括其他蝇类物种）的急性毒性效应。个体镇静时间数据可用于评估群体内表型变异的程度，例如DGRP群体中的变异情况。

我们使用小昆虫筛网来防止果蝇与乙醇溶液直接接触，同时允许足量的乙醇蒸气到达果蝇。筛网顶部覆盖的一层白色纱布可增强果蝇与下方表面之间的视觉对比度，并确保果蝇不会卡在筛网中，从而避免对姿势控制丧失的判断产生歧义。市面上可获得的对水和空气具有通透性的膜材料在实验中结果不一致，且对乙醇蒸气的通透性不足。我们特意选用小昆虫筛网，因为这是一种孔隙均匀的材料，能够最大限度减少果蝇在孔板中位置不同所导致的乙醇暴露差异。可根据可用材料对该方案进行修改，但我们建议使用可控的行为实验舱，使果蝇能够接触到浓度为90%–100%的乙醇，并确保乙醇暴露的均匀性。

在重复实验之间，应随机化果蝇在细胞培养板中的位置，以避免位置偏差。对于需要在多天内进行且因此可能受到可能影响实验结果的环境变化（例如大气压力变化）²⁷影响的较大规模实验，我们强烈建议每天在同一时间测试果蝇，并在每天内部及不同天之间均进行随机化处理，尤其是在需要相互比较不同品系和/或性别的果蝇时。

我们开发的方法最适合用于测量急性酒精暴露的影响，但不适用于获取饮酒数据或建立成瘾模型。然而，通过该实验获得的酒精镇静敏感性数据可以与其他酒精相关表型的测量指标相结合。该系统的局限性之一是，标准细胞培养板的垂直高度允许果蝇进行垂直移动，而这种移动无法通过视频追踪进行详细评估整体活动或运动能力。不过，这一局限性并不影响对镇静时间的准确评估。当使用不同基因型的果蝇（例如来自DGRP的异交群体²⁸）时，该实验还可实现对单个果蝇的回收，从而收集具有相反表型的果蝇群体，用于批量DNA测序和极端QTL定位^29,30。总体而言，该实验方法能够快速、低成本地获取大量单只果蝇的酒精镇静数据。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
24孔细胞培养板	Corning	3526	平底；用于在整个实验过程中饲养果蝇
吸虫器
纱布	Genesee Scientific	53-100	广泛可得
乙醇	Decon Labs	V1001	广泛可得
柔性塑料切菜板（板盖）	Walmart	550098612	任何可轻松滑动并完全覆盖24孔板的平底塑料板均可使用。柔性塑料切菜板效果良好
纱布（用于吸虫器）	Honeywell North	67622	广泛可得
照明垫	Amazon (AGPtek)	ASIN B00YA9GP0G	任何可提供对比度的光源垫均可使用
加大号手工冰棒棍	Michaels	10334892	任何长度不小于7 cm的手工冰棒棍均可使用
P1000移液器吸头（用于吸虫器）	Genesee Scientific	24-165RL	任何P1000移液器吸头均可使用
血清移液管（用于吸虫器）	Genesee Scientific	12-104
细孔昆虫筛网	Lowe's (Saint-Gobain ADFORS)	89322	任何细孔昆虫筛网均可使用
测试室			内部空间需足够大以容纳光源垫。可用聚苯乙烯盒构建
Tygon软管（用于吸虫器）	Grainger	9CUG7	广泛可得
摄像机	Canon	1959C001AA	任何摄像机均可使用