本文介绍了一种从三维空间中分布的每一个活细胞中光学提取并编目其固有细胞荧光特征（即细胞自发荧光）的实验方案。该方法适用于在单细胞分辨率下研究多种生物系统的固有荧光特征，包括来自细菌、真菌、酵母、植物和动物的细胞。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种基于共聚焦反射显微镜的单细胞本征荧光分析方法（CRIF），该方法可对三维（3D）空间中分布的活细胞群体中每一个单个活细胞的本征细胞荧光特征进行低侵入性重建。细胞的本征荧光特征是指细胞内多种生物分子发射的荧光信号的集合。先前的研究已证实，本征荧光特征能够反映细胞的多种特性以及生理状态的差异，是细胞表征与识别的重要信息来源。传统上，本征荧光特征多在细胞群体水平上进行分析，因而需要克隆培养，而无法实现单细胞水平的分析。CRIF方法特别适用于需要三维分辨率和/或从单个细胞中选择性提取荧光信号的研究。由于荧光特征是细胞的固有属性，CRIF也适用于无需标记的完整单细胞类型和/或生理状态的预测。该方法可能成为简化细胞分析的有力工具，可在显微镜下直接通过自体荧光特征对异质性细胞群体中每个单细胞的表型进行评估，而无需细胞标记。
引言
细胞内的多种生物分子1会发出自发荧光信号，而细胞的固有荧光特征即由这些信号组合而成。这种特征性荧光反映了细胞的各种属性以及生理状态的差异。对固有荧光的分析具有最小侵入性，可作为传统微生物学探针技术的补充，后者可能留下从轻微代谢改变到细胞完全破坏等一系列影响。尽管传统技术如DNA或细胞内容物提取2,3、荧光原位杂交4以及将荧光报告基因导入基因组等方法在确定细胞类型或生理状态方面有效，但这些方法通常需要对细胞进行操作或施加侵入性标记。
对各种活体完整微生物菌落的内在荧光研究，包括大量微生物培养悬浮液5,6、活性污泥7、哺乳动物组织8,9以及哺乳动物细胞1,10，已表明内在荧光分析可实现无需标记的细胞类型及生理状态分析。传统的内在荧光特征分析通常在群体水平进行，而非单细胞水平，因此需要克隆培养。相比之下，本文所述的confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis（CRIF）技术11能够重建并归类每一个活体微生物单细胞的内在细胞荧光特征。此外，CRIF可在三维（3D）空间分布的细胞群体中，系统性地整合单个微生物细胞的内在荧光特征。
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方案
1. 样品制备
- 将带有孔的1 mm厚硅胶垫片放置在玻璃载片上。
- 将一块1 mm厚、0.8%（w/v）的琼脂糖凝胶置于硅胶垫片的孔中。
- 将任意微生物细胞培养物的细胞密度稀释至600 nm处的光密度（OD660）= 1.0。
- 取5 µL细胞悬液滴加在琼脂糖凝胶表面。
- 轻轻盖上玻璃盖玻片。
2. 显微镜的设置
注意：CRIF 技术结合了共聚焦反射显微术（CRM）和多通道共聚焦微光谱技术。CRM 提供与细胞固有荧光无关的细胞形态学和空间定位信息。多通道共聚焦微光谱技术则提供细胞固有荧光的光谱信息。在以下实验方案中，通过 CRM 或共聚焦荧光微光谱技术获取的任何图像分别称为 CRM 图像或多通道共聚焦微光谱图像。
- 将共聚焦显微镜的解扫描光谱通道连接至光电倍增管（PMT）或砷化镓磷（GaAsP）探测器。
注：这些装置可从多家制造商处获得。 - 使用具有足够放大倍数和高数值孔径（NA）的物镜装配显微镜。
注意：使用数值孔径（NA）为63倍的物镜 > 建议使用1.4来分析细菌细胞。 - 在显微镜上配备半反射镜（例如 NT 80/20），以适应共聚焦反射显微成像（CRM），该技术依赖入射光在细胞中的散射来观察细胞形态。
- 对于多通道共聚焦显微光谱分析，需为显微镜配备二向色镜。例如，分别使用 MBS InVis405、MBS458、MBS488、MBS458/514、MBS488/543 或 MBS 488/543/633 分束器，以实现 405、458、488、514、543 或 633 nm 的激发光。
- 使用激光功率计调节每个激发波长的照明强度。在不同激发波长下保持显微镜的输出恒定（例如，使用） 50 µW 使用63倍物镜时）。
3. 图像采集
- 使用显微镜软件将针孔尺寸设置为1 AU。
- 为每种激发波长设置像素驻留时间（即扫描速度）。
注意：过长的像素驻留时间可能损伤细胞。为尽量减少对细胞的光损伤，应避免过长的像素驻留时间。对于细菌样品，像素驻留时间 <55.6 µs/µm2 （当显微镜下的辐照度输出约为 ~17 µW/cm2通常适合避免生长抑制。该参数可能因生物体种类和实验设置的不同而有所变化。 - 设置扫描分辨率。对于细菌等小型细胞，应使用 1,024 × 1,024 的扫描面积。
- 设置Z轴扫描范围，以覆盖目标区域。
注意：对于分布在琼脂糖平板上的细菌和酵母细胞样品，Z轴扫描范围约为~15 µm 通常已足够。 - 将去扫描探测器设置为捕获可见光波长范围（例如，416−691 nm）。使用8−10 nm的光谱窗口。
- 按从最长到最短的激发波长顺序采集多通道共聚焦显微光谱图像，以生成荧光图像的Z轴层叠序列。
- 获取CRM图像。
- 将获取的图像以16位tiff文件格式保存到指定目录中。按照命名规范对文件进行命名 XXXcYYzZZ.tif 其中XXX为激发波长，YY为检测通道编号，ZZ为Z轴切片编号，“c”和“z”分别为检测通道编号和Z轴切片编号的前缀。
- 例如，如果使用405 nm激发波长采集多通道共聚焦微分光光度成像，1st 检测器阵列的检测器通道，且为5th Z-stack 的一个切片，将其命名为“405c01z05.tif. 对于CRM图像，请使用字符串“CRM” 代替 XXX（例如，“CRMc01z05.tif).
注意：根据图像数据选择最适合的二维或三维分割方法。当细胞较小且局限于二维平面时（例如附着在玻璃表面的细菌群体），应采用二维分割方法。当细胞群体分布在三维空间中（例如生物膜和组织样本），或细胞尺寸大于光学切片厚度时（例如酵母细胞、哺乳动物细胞），应采用三维分割方法。二维分割请参考第4节；三维分割请参考第5节。
- 例如，如果使用405 nm激发波长采集多通道共聚焦微分光光度成像，1st 检测器阵列的检测器通道，且为5th Z-stack 的一个切片，将其命名为“405c01z05.tif. 对于CRM图像，请使用字符串“CRM” 代替 XXX（例如，“CRMc01z05.tif).
4. 二维图像分析
- 配备带有图像分析软件的工作站（例如，MATLAB）。
- 进行细胞分割并重建单个细胞的固有荧光特征。
- 打开图像分析软件。
- 双击并打开所提供的脚本之一“Script2D.m”。
- 转到编辑器选项卡，然后单击运行。此时应出现一个文件夹选择窗口。
- 选择步骤 3.8 中创建的目录，然后单击打开继续。系统将自动弹出一个提示输入分割参数的对话框。
注意：为测试目的，请选择提供的数据集（“Sample_2D”）。该样本数据集以压缩文件形式提供，应提前解压。 - 输入分割参数：图像二值化阈值（0−1）设为0.45，细胞区域上阈值（以像素计） = 200，细胞区域下阈值（以像素计） = 10，以及检测器数量 = 32。单击确定继续。
注意：这些参数可能需要根据图像质量进行调整。 - 应出现一个显示 CRM 图像的新图像窗口。选择一个任意的背景区域（即无细胞区域）用于背景扣除。通过鼠标拖动在 CRM 图像中绘制一个矩形。在所选区域内双击以确认选择。
- 在步骤 4.2.4 中选择的同一目录下，查找一个名为Signature的新目录。
注意：所提供的代码将自动创建此目录。“Signature”目录以 .png 文件形式存储群体中每个微生物细胞的固有荧光特征，文件按共同前缀“Signature”依次编号。
5. 三维图像分析
- 在工作台上配置图像分析软件（材料表）。
- 进行细胞分割并重建单个细胞的固有荧光信号。
- 打开图像分析软件。
- 双击并打开提供的脚本“Script3D.m”。
- 转到 编辑器 选项卡，然后单击 运行。此时应出现一个文件夹选择窗口。
- 选择步骤 3.8 中创建的目录，然后单击 打开 继续。系统将自动弹出一个提示输入分割参数的对话框。
注意：为测试目的，请选择提供的数据集（“Sample_3D”）。该样本数据集以压缩文件形式提供，应提前解压。 - 输入分割参数：图像二值化阈值（0–1）= 0.01，细胞体积上限（像素） = 1,000，细胞区域下限（像素） = 20，X 像素尺寸 [μm/像素] = 0.26，Y 像素尺寸 [μm/像素] = 0.26，Z 像素尺寸 [μm/像素] = 0.42，以及检测器数量 = 32。单击 确定 继续；随后将弹出提示输入激发波长数量的对话框。
注意：这些参数可能需要根据图像质量进行调整。 - 输入用于图像采集的波长数量（例如，若使用 405、488、561、630 nm，则在对话框中输入 4）。单击 确定。
- 按照从最短到最长的顺序，在对话框中依次输入激发波长（即框名称为 激发波长 1 起始）。单击 确定 继续；此时应弹出一个显示共聚焦拉曼显微图像（CRM）的新图像窗口。
- 选择一个任意的背景区域（即无细胞区域）用于背景扣除。在 CRM 图像中通过鼠标拖拽绘制一个矩形区域，并在选定区域内双击以确认选择。
- 在步骤 5.2.4 中选定的目录中查找名为 Signature 的文件夹。
注意：所提供的代码会自动创建此目录。“Signature”文件夹以序列编号的 .png 文件形式存储群体中每个单微生物细胞的固有荧光信号，文件名前缀均为“Signature”。
6. 统计分析
注意：执行降维技术（例如，主成分分析 [PCA]）以可视化细胞群体高光谱的分布情况。所提供的脚本（PCA.py）针对两个细胞群体（即，两个类别）执行 PCA 分析。
- 在工作站上配置编程语言及相应的库和模块（材料表）。
- 在C盘（或等效位置）创建一个空目录，并将该目录命名为“Parent_directory”（例如：C:/Parent_directory）。
- 将两个细胞群体各自的荧光特征（例如步骤4.2.7中生成的.png文件）分别存储到两个独立的目录中。
注：这两个目录均应位于“Parent_directory”内。
C:/Parent_directory/
putidaKT2440/
Signature01.png
Signature02.png
:
putidaKT2442/
Signature01.png
Signature02.png
: - 将PCA.py下载至“Parent_directory”目录中。
- 打开工作站的命令行界面。
- 在命令行界面中输入“python C:/Parent_directory/PCA.py”。
- 当显示消息“Select target directory”时，选择“Parent_directory”目录。
- 在“C:/Parent_directory”目录中查找名为“PCA.png”的文件，其中包含生成的PCA图。
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结果
图1A展示了细菌细胞典型的单细胞荧光特征，以传统光谱图（顶部）和热图（中部）形式呈现。图1B展示了精确的二维细胞分割结果，叠加在土壤细菌群体（Pseudomonas putida KT2440）的原始共聚焦拉曼显微图像上12。该群体获得的固有荧光特征以热图形式显示在图1D中。请注意，在成功完成细胞分割后，群体内的变异性相对较小。图1C展示了一个细胞分割不准确的示例，其叠加在与图1B相同的P. putida群体图像上。细胞分割不准确对群体固有荧光特征的影响在大量离群值中明显可见（图1E，红色三角形）。与精确细胞分割后得到的紧密聚类相比，不准确的细胞分割在主成分分析（PCA）中导致了更为松散的聚类（
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讨论
该方法中有两个关键点需要严格遵循，以获得可重复的结果：1）在不同激发波长和实验中，保持显微镜物镜下的激光输出功率一致；2）进行精确的细胞分割。
在比较不同实验之间的固有荧光特征时，第一点尤为重要。应避免对激发波长简单地应用相同的“输出百分比”设置（例如，对405、488、514和530 nm的激光线均使用5%的输出功率），因为不同激光线的最大输出功率可能相差一个数量级。此外，物镜和内部光学元件通常具有不均匀的光吸收特性，这也需要加以考虑。因此，建议使用激光功率计（材料表）在物镜下方实际测量输出功率。建议每隔几次实验或定期进行此测量，因为激光线的输出功率可能在数年内显著衰减。
第二个要点是准确的细胞分割，在涉及种内或种间变异性的研究中，这一点尤为重要。不准确的细胞分割（图1D）会导致异常数据点的出现（图1E，以红色三角形标示），并增加表观上的种内变异性。在进行任何进一步分析或训...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分得到了日本文部科学省科学研究费补助金（18K04843）对 Y. Yawata 的资助，以及日本科学技术振兴机构（JST）ERATO 项目（JPMJER1502）对 N. Nomura 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂糖 | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| 分束器 | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405、MBS458、MBS488、MBS458/514、MBS488/543 或 MBS 488/543/633 分束器（Carl Zeiss） | |
| 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss, Nikon | 型号 LSM 880（Carl Zeiss），型号 A1R（Nikon） | |
| 盖玻片 | Matsunami Glass | C024601 | |
| 载玻片 | Matsunami Glass | S011120 | |
| 半反射镜 | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| 激光功率计 | Thorlabs | PM400（功率计主机）和 S175C（传感器） | |
| LB 培养基 | Nacalai tesque | 20066-95 | 用于细菌培养 |
| 图像分析软件 | The MathWorks | 需使用 MATLAB 版本 2019a 或更高版本，并安装图像处理工具箱（Image Processing Toolbox） | |
| 显微镜物镜 | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | 例如 63倍 平场复消色差物镜，数值孔径 NA = 1.4（Carl Zeiss） |
| 显微镜软件 | Carl Zeiss, Nikon | ZEN（Carl Zeiss）、NIS-elements（Nikon） | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| 编程语言 | 需使用 Python 及相关库和模块（numpy、scikit-learn、scikit-image、os、glob、matplotlib、tkinter）运行提供的 PCA 脚本。 | ||
| 硅胶垫圈 | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| 工作站 | 建议使用配备独立 GPU 的高性能工作站。 | ||
| 酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）琼脂培养基 | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | 用于酵母培养 |
| YPD 培养基 | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
参考文献
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289(2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453(2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , Springer. Germany. (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461(2014).
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