使用硫代巴比妥酸反应物质测定法评估生物样品中的氧化应激

摘要

硫代巴比妥酸反应物质测定的目的是通过使用可见光波长分光光度法在532nm处测量脂质过氧化产物（主要是丙二醛）的产生来评估生物样品中的氧化应激。这里描述的方法可应用于人血清、细胞裂解物和低密度脂蛋白。

摘要

尽管硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）测定的分析特异性和坚固性有限，但已被广泛用作生物体液中脂质过氧化的通用指标。它通常被认为是生物样品中氧化应激水平的良好指标，前提是样品已得到妥善处理和储存。该测定涉及脂质过氧化产物（主要是丙二醛（MDA））与硫代巴比妥酸（TBA）的反应，这导致形成称为TBARS的MDA-TBA2加合物。TBARS产生红粉红色，可以在532nm处进行分光光度法测量。TBARS测定在酸性条件（pH = 4）和95°C下进行。 纯MDA是不稳定的，但这些条件允许MDA双（二甲缩醛）释放MDA，MDA在该方法中用作分析标准。TBARS测定是一种简单的方法，可以在大约2小时内完成。此处详细介绍了测定试剂的制备。注重预算的研究人员可以低成本将这些试剂用于多个实验，而不是购买昂贵的TBARS检测试剂盒，该试剂盒仅允许构建单个标准曲线（因此只能用于一个实验）。该TBARS测定的适用性在人血清，低密度脂蛋白和细胞裂解物中显示。该测定结果一致且可重复，检测限可达到 1.1 μM。提供了分光光度法TBARS测定的使用和解释的建议。

引言

脂质过氧化是自由基（如活性氧和活性氮）攻击脂质中的碳 - 碳双键的过程，该过程涉及从碳中抽取氢并插入氧分子。该过程导致复杂产物的混合物，包括脂质过氧自由基和氢过氧化物作为主要产物，以及丙二醛（MDA）和4-羟基壬烯醛作为主要的二次产物¹。

MDA因其与硫代巴比妥酸（TBA）的易反应而被广泛用于生物医学研究中，作为脂质过氧化的标志物。该反应导致MDA-TBA2的形成，MDA-TBA2是一种共轭物，在532nm处的可见光谱中吸收并产生红粉红色²。除MDA外，来自脂质过氧化的其他分子也可以与TBA反应并在532nm处吸收光，从而有助于测量的整体吸收信号。同样，MDA可以与大多数其他主要类别的生物分子反应，可能限制其与^TBA3，4反应的可及性。因此，这种传统的测定方法仅被认为可以测量"硫代巴比妥酸反应物质"或^TBARS5。

当正确应用和解释时，TBARS测定通常被认为是生物样品中氧化应激总体水平的良好指标⁶。不幸的是，正如Khoubnasabjafari和其他人所记录的那样，TBARS测定的进行和解释方式往往有助于得出可疑的结论^{3，4，7，8，9，10，11}。造成这种情况的原因主要在于与样品相关的预分析变量，以及缺乏检测坚固性，从而禁止在检测方案中发生看似微小的变化，而不会对测定结果进行实质性更改^{1，7，12，13}。

与生物标本处理和储存相关的预分析变量（例如，暂时保持在-20°C的血浆）^14，15 可对TBARS测定结果产生重大影响^16，17;如此之多，以至于TBARS测定结果不应在不同实验室之间进行比较，除非有明确的实验室间分析验证数据保证。此建议类似于蛋白质印迹的常用和解释方式。条带密度的比较对于印迹和实验室内研究是有效的，但比较实验室之间的条带密度通常被认为是一种无效的做法。

一些研究人员认为，通过TBARS测定法测量的MDA根本不符合可接受的生物标志物所需的分析或临床标准^{3，9，10，18，19}。事实上，如果该测定法不是在50多年前开发的，它可能不会获得今天的广泛使用和默认接受。尽管还有其他具有更高分析灵敏度、特异性和坚固性的测定方法用于测定氧化应激，但基于532 nm吸光度的 TBARS 测定仍然是迄今为止最常用的测定脂质过氧化的测定方法之一²⁰，从而评估氧化应激。

TBARS测定只能作为昂贵的试剂盒（超过400美元）找到，其中说明书没有提供有关所用试剂的大多数浓度的详细信息。此外，所提供的试剂只能用于一个实验，因为每个试剂盒只能做一个比色标准曲线。对于打算在不同时间点确定几个样品中的氧化水平的研究人员来说，这可能是个问题，因为相同的标准曲线不能多次使用。因此，需要购买多个试剂盒进行多个实验。目前，除非购买昂贵的试剂盒，否则没有有关如何进行TBARS测定的详细方案。过去的一些研究人员模糊地描述了如何进行TBARS测定^21，22，但文献中既没有关于如何在没有昂贵试剂盒的情况下进行TBARS测定的完全详细的实验方案或全面的视频。

在这里，我们报告了一种详细的，经过分析验证的用于目的的方法，该方法涉及如何以简单，可重复且廉价的方式进行TBARS测定。用Cu（II）离子处理后人血清，HepG2裂解物和低密度脂蛋白的脂质过氧化变化被证明为TBARS测定的说明性应用。结果表明，这种TBARS测定在日常基础上是一致且可重复的。

方案

人类血清标本是在IRB批准下根据《赫尔辛基宣言》中表达的原则从同意的志愿者那里获得的。在转移到分析实验室之前，对标本进行编码和去鉴定。

1. 样品制备

1. 七氢呋喃二酮细胞裂解物
   1. 将每个烧瓶接种约10×10 ⁶ 个HepG2细胞放入16个T75烧瓶中，加入14mL EMEM培养基，补充10%胎牛血清（FBS），并培养细胞2天。
   2. 制备 RIPA 缓冲液:在 50 mL 管中，加入 1.5 mL 5 M NaCl、2.5 mL 1 M Tris-HCl （pH = 7）、500 μL NP-40 试剂，然后用 DI 水将最终体积增至 50 mL。
   3. 制备裂解缓冲液:将20mL RIPA缓冲液等分到50mL管中，并加入200μL100x蛋白酶抑制剂溶液以抑制蛋白质和脂质降解。储存在4°C。
      注意:裂解缓冲液与TBARS试剂兼容，不会干扰532nm处的吸光度。如果计划使用不同的裂解缓冲液或向裂解缓冲液中添加其他成分，则需要进行初步验证研究以验证裂解缓冲液组分是否与TBARS测定兼容。
   4. 取出含有10%FBS的培养基，用5 mL冷无菌1x PBS洗涤细胞2x。
   5. 向含有细胞的T75烧瓶中加入1mL裂解缓冲液，并在室温（RT）下孵育10分钟，并持续旋转以确保缓冲液分布良好。
   6. 将裂解物收集到适当标记的2 mL卡扣盖聚丙烯管中，并在冰上孵育10分钟。
   7. 在室温下以5，000×g旋转裂解物10分钟以收集细胞碎片，并将上清液吸入单个15 mL管中。
   8. 在50°C和3 mbar下使用Speed Vac将细胞裂解物上清液浓缩四倍，并将94μL的等分试样放入2 mL卡扣帽聚丙烯管中。将样品储存在-80°C，直到用于体外氧化和/或TBARS测定。
      注意:为避免浓缩细胞裂解物上清液，也可以使用3mL1x胰蛋白酶分离细胞，用6mL培养基中和，并用5mL冷PBS洗涤2x。然后可以在250μL裂解缓冲液中重构细胞沉淀，然后可以执行步骤1.1.6和1.1.7。
   9. 在乙酸中制备35mM _CuCl2 储备溶液（pH = 4）。
      1. 准备乙酸溶液（pH = 4）:将1μL冰醋酸稀释在100mL的DI水中（pH值应约为4，但用pH计确认）。加入更多的水或乙酸，将pH值调节到4。
      2. 取出约0.1936克氯化铜，溶于10毫升乙酸溶液（pH = 4）中，制成144 mM _CuCl2 储备液。从该溶液中等分490μL，并加入1，510μL乙酸（pH = 4）以制成35mM _CuCl2 溶液。
   10. 从35 mM _CuCl2 储备溶液中等分6μL，并将其加入含有94μL细胞裂解物的6个样品中，使最终_CuCl2 浓度约为2mM。将6μL不含_CuCl2 的乙酸溶液（pH = 4）加入含有94μL细胞裂解物的六个样品中作为对照。细胞裂解物的最终体积应为100μL，这是用于TBARS测定的体积。
       注意:在乙酸（pH = 4）中制造35 mM _CuCl2 储备溶液对于防止氢氧化铜沉淀是必要的。
   11. 将样品在37°C的烘箱中孵育24小时，并对含有100μL最终体积的每个样品进行TBARS测定。
   12. 在不同的日子里重复步骤1.1.9和1.1.11 2x，以检查HepG2细胞裂解物的TBARS测定的再现性。
2. 低密度脂蛋白
   注意:通常，预纯化的低密度脂蛋白（LDL）含有一定量的EDTA。这里使用的LDL样品含有0.01%的EDTA。EDTA可以抑制体外Cu（II）介导的LDL氧化。因此，在实验或分析之前，可能需要从LDL样品中除去EDTA。步骤 1.2.1–1.2.5 描述了此过程。
   注意:氢氧化钠具有腐蚀性，会刺激皮肤和眼睛。使用适当的个人防护装备。
   1. 将24μL从5.51mg / mL低密度脂蛋白储备液（使用BSA作为标准通过改良的Lowry方法测定蛋白质浓度）等分到适当标记的1 mL卡扣帽聚丙烯管中。根据需要制作尽可能多的等分试样，并储存在4°C，直到用于氧化和/或TBARS测定。
   2. 用NaOH微珠在0.15 M NaCl中制备10mM HEPES缓冲液，调节至pH = 7:将4.39gNaCl溶解在0.49L水中，然后加入1.19gHEPES。用搅拌棒充分溶解。加入氢氧化钠珠，直到pH值为7。用水稀释至0.5升。将缓冲液储存在4°C，并在3个月内使用。
   3. 将476μL的10mM HEPES缓冲液加入0.15M NaCl（pH = 7）到等分的LDL样品中，使最终体积达到500μL。将稀释的LDL样品加入具有100K分子量截止值的0.5mL离心离心过滤装置中。
   4. 在室温下以14，000×g离心样品10分钟，留下约30μL的最终截留物体积。将样品在480μL的10mM HEPES缓冲液中在0.15 M NaCl（pH = 7）中重构，并在室温下以14，000×g再次离心10分钟。
   5. 将过滤装置倒置到新的2mL卡扣盖聚丙烯管中，并以1000×g离心2分钟以收集LDL样品（最终体积= 约30μL）。
   6. 将样品等分到适当标记的1 mL管中，并向每个样品中加入20μL水，以达到50μL的最终体积。
   7. 在乙酸中制备200μM _CuCl2 储备溶液（pH = 4）
      1. 制备乙酸溶液（pH = 4）:参见步骤1.1.9.1。
      2. 准备144mM _CuCl2 储备溶液（见步骤1.1.9.2），然后从144mM _CuCl2 储备液中等分5.5μL，溶解在最终体积为4mL乙酸（pH = 4）中以制成200μM溶液。
   8. 从200μM _CuCl2储备溶液中等分2.7μL，并将其加入到含有50μLL的六个样品中，以达到〜10μM的最终_CuCl2浓度。将不含CuCl2的乙酸溶液（pH = 4）中的2.7μL加入到含有50μLLL的六个样品中用于对照。
   9. 将LDL样品在37°C的烘箱中孵育2小时。 2小时后，用10mM HEPES缓冲液在0.15M NaCl（pH = 7）中将每个样品的最终体积降至100μL。立即进行 TBARS 检测。
   10. 在两个不同的日期重复步骤1.2.3–1.2.9 2x，以测试TBARS测定的再现性。
3. 人血清
   1. 从人血清样品中，将94μL等分试样放入2mL卡扣盖聚丙烯管中，并将样品储存在-80°C。
   2. 在乙酸中制备35mM _CuCl2 储备溶液（pH = 4）:参见步骤1.1.9。
   3. 从_CuCl2 储备溶液中等分6μL，并将其加入含有94μL人血清的6个样品中，使最终_CuCl2 浓度约为2mM。将6μL不含_CuCl2 的乙酸溶液（pH = 4）加入含有94μL人血清的六个样品中作为对照使用。
   4. 将人血清样品在37°C的烘箱中孵育24小时，并用TBARS测定法测定氧化水平（第4节）。
   5. 在两天内重复步骤1.3.2–1.3.4 2x，以确定TBARS测定的再现性。

2. 试剂制备

注意:硫代巴比妥酸会引起皮肤和眼睛刺激，吸入或皮肤吸收可能有害。醋酸如果吸入会损害内脏器官。在通风橱中准备所有酸溶液。

1. 制备8.1%（w / v）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液
   1. 取出 32.4 g SDS 的重量，溶于烧杯中的 350 mL 去离子水。使用磁性搅拌棒轻轻溶解SDS并避免产生气泡。用去离子水将最终体积调至400 mL，并将SDS溶液储存在室温下。
      注意:在这里，准备了过量的8.1%SDS溶液;然而，对于96个样品，只需要约20 mL的8.1%SDS溶液。根据要分析的样品数量准备此溶液。
2. 制备3.5M乙酸钠缓冲液（pH = 4）
   1. 在烧杯中将 100 mL 冰醋酸稀释到 350 mL 去离子水中。使用磁性搅拌棒轻轻溶解。
   2. 在水中使用氢氧化钠珠制备6.5M NaOH溶液。将 13 g NaOH 微珠溶解在 40 mL 的 DI 水中，并用 DI 水使最终体积达到 50 mL。
   3. 在与搅拌棒混合时，缓慢地向乙酸溶液中加入约46mL的6.5M NaOH溶液（这应该将pH提高到4，但在使用pH计测量时缓慢加入NaOH溶液来确认）。
   4. 用去离子水将最终体积降至500 mL，并将乙酸钠缓冲液储存在室温下。
3. 制备0.8%硫代巴比妥酸水溶液（调节至pH = 4）
   注意:在此步骤中，硫代巴比妥酸的制备针对大体积进行了优化，因为将要分析大量样品（108个样品，不包括标准品）。根据计划用于分析的样品数量准备此解决方案。
   1. 使用氢氧化钠珠和水制备5M氢氧化钠溶液:将4g氢氧化钠珠溶于最终体积的20mL水中。存放在塑料容器中。该溶液应为每批新鲜制备。
   2. 重量4克硫代巴比妥酸，加入450毫升去离子水。使用磁性搅拌棒轻轻溶解。
      注:该溶液最终将达到500 mL的总体积。
   3. 当用搅拌棒溶解硫代巴比妥酸时，以100μL的增量（缓慢和滴滴方式）加入约3mL的5M NaOH溶液。加入NaOH溶液后，硫代巴比妥酸颗粒将开始溶解。
   4. 如果硫代巴比妥酸颗粒仍未完全溶解，则以100μL的增量加入更多的5M NaOH溶液，直到所有硫代巴比妥酸颗粒完全溶解。对于这种特定体积的溶液，共加入4mL的5M NaOH溶液以完全溶解硫代巴比妥酸颗粒。
      注意:在此浓度下，硫代巴比妥酸不会完全溶解，除非pH值接近4。
   5. 在所有硫代巴比妥酸完全溶解后停止添加NaOH。避免超过pH值4。可以通过从混合的硫代巴比妥酸溶液中取1μL并将其置于pH纸上来验证最终的pH值。
   6. 用去离子水将最终体积降至500 mL，并在室温下储存0.8%硫代巴比妥酸水溶液。

3. 丙二醛双（缩二甲醇）标准样品制备

注意:丙二醛（MDA）不稳定，无法在市场上买到。然而，市面上有不同的化学形式的MDA，例如MDA四丁基铵盐，MDA双（二甲缩醛）和MDA双（缩二乙醇）。在这三种化学形式中，这里使用MDA双（二甲缩醛），因为大多数研究使用相同的标准^21，22。如果选择使用其他两种化学形式的MDA，应事先验证其适用性。

1. 通过将92μL纯MDA双（二甲基缩醛）稀释在1L二甲基苯丙水中，制备550μM MDA双（二甲基缩醛）储备溶液。使用磁性搅拌棒将溶液彻底混合10分钟。将溶液储存在4°C并在1个月内使用。
2. 通过将550μM MDA双（二甲缩醛）储备液中的726μL稀释到1274μL的DI水中，制备200μM MDA双（二甲缩醛）。每次进行TBARS测定时，应新鲜制备这种200μM MDA双（缩二甲醇）溶液。
3. 标准曲线制备:取8个2 mL卡扣帽聚丙烯管，并用字母A至H标记，从200μM储备液中加入MDA双（二甲缩醛），并按 表1所述在水中稀释。
4. 取8个玻璃管（13 mm x 100 mm）并标记它们A-H，然后将100μL标准品加入相应的管中。对空白标准品（样品A）执行六次重复，以计算TBARS测定的检测限。
   注意:该协议可以在此处暂停不超过1小时。

4. TBARS检测

注意:一旦开始TBARS测定，就应该在不停止的情况下完成。

1. 根据需要取尽可能多的玻璃管，以分析样品的数量，并用样品名称标记它们。然后，将100μL每个制备的样品（如上所述）加入每个玻璃管中。
2. 向每个样品和标准品中加入200μL8.1%SDS，并以圆周运动轻轻旋转玻璃管以混合样品。
3. 向每个样品和标准品中加入1.5 mL的3.5 M乙酸钠缓冲液（pH = 4）。
4. 向每个样品和标准品中加入1.5mL的0.8%硫代巴比妥酸水溶液（pH = 4）。
5. 通过加入700μL的DI水，将每个样品的最终体积和标准品的最终体积降至4 mL。
6. 紧紧盖住每个玻璃管，并在设置为95°C的加热块中孵育1小时。用铝箔盖住玻璃管，以防止管顶部结露。
7. 从加热块中取出玻璃管，在冰上孵育30分钟。
8. 在4°C下以1500×g离心样品和标准品10分钟。 离心后，将含有样品和标准品的玻璃管保持在室温。
   注意:将样品保存在冰上或4°C会导致整个样品或标准品沉淀。
9. 离心后立即，从每个管中等分150μL上清液，并放入96孔板的单独孔中。
10. 使用移液器吸头从每个孔中除去任何气泡。
    注意:气泡的存在会产生不一致的吸光度读数，从而导致高度的测定不精确性。
11. 读取532nm处的吸光度。从所有其他吸光度读数中减去空白样品的平均吸光度读数。
12. 通过绘制532nm处的空白减去吸光度读数与每种标准的已知浓度来创建标准曲线。使用线性回归拟合数据点。通过使用从标准曲线获得的线性回归线方程计算未知样品浓度。

结果

在酸性条件（pH = 4）和95°C下，丙二醛（MDA）双（二甲缩醛）产生^MDA23。MDA和密切相关的化学同源物与两个硫代巴比妥酸分子（TBA）反应，产生称为硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）的化合物，其呈红粉红色，在532nm处具有吸光度_λmax （图1， 图2）。以MDA bis（缩二甲醇）为标准，生成标准曲线（图3， 表1），以确定三种不同生物样品的检测限和测定灵敏度以及氧化水平。共进行了9次TBARS测定，以确定不同日期三种不同样品的氧化水平。因此，总共生成了九条标准曲线，如图 3所示。最小二乘法²⁴ 确定斜率和y截距的标准差，分别为8.67 x ^10-6 和5.66 x ^10-4。

讨论

尽管 TBARS 检测方法存在局限性^{1、3、4、7、8}、^9、10、^12、13、14、^15、19 且不适合在实验室之间进行比较，但 TBARS 检测方法是最古老的^{检测方法之一29...}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x 无菌 PBS pH 7.4 1 L	VWR，PA	--262	细胞裂解试剂
50 mL 自立式离心管	康宁，纽约	CLS430897	通用材料
96 孔板，未处理，透明，带盖，未灭菌	Thermo Fisher Scientific，MA	280895	测量吸光度
Amicon Ultra-0.5 100 kD 离心离心过滤装置	Fisher Scientific，新罕布什尔州	UFC510024	LDL 纯化
玻璃管盖	Thermo Fisher Scientific，MA	14-930-15D	，用于 TBARS 检测
氯化铜	II，MO	222011-250G	诱导氧化
一次性培养管，螺旋盖，硼硅酸盐玻璃 （13 x 100 mm）	VWR，PA	53283-800	用于 TBARS 检测
Eagle 最低必需培养基 （EMEM）	ATCC， VA	HB-8065	HepG2 细胞培养基
Eppendorf Safe-Lock Tubes， 1.5 mL	Eppendorf， NY	22363204	通用材料
Eppendorf Safe-Lock Tubes， 2.0 mL	Genesee Sceitific， CA	22363352	通用材料
胎牛血清 美国来源	Omega Scientific， CA	FB-11	用于细胞培养
冰醋酸	SIGMA， MO	27225-1L-R	TBARS 试剂
Halt 蛋白酶抑制剂混合物 （100x）	Thermo Scientific，MA	87786	细胞裂解试剂
HEPES	SIGMA，MO	H3375-250G	LDL 溶剂
HepG2 细胞	ATCC，VA	HB-8065	生物基质原型
氢氯酸 （HCl）	Fisher Scientific，NH	A144-212	细胞裂解试剂
Legend Micro 17 离心机	Thermo Scientific，MA	75002431	通用材料
低密度脂蛋白，人血浆	Athens Research &技术，GA	12-16-120412	生物基质原型
磁力搅拌棒，八边形 6 种分类	VWR，PA	58948-025	一般材料
二醛双（二甲基缩醛）	SIGMA，MO	8207560250	TBARS 标准
Multiskan Go 全波长酶标仪	Fisher Scientific，NH	51119200	吸光度
NP-40	EMD Millipore Corp，MA	492016-100ML	细胞裂解试剂
氯化钠	SIGMA，MO	S7653-1KG	细胞裂解试剂
十二烷基硫酸钠 （SDS）	SIGMA，MO	436143-100G	TBARS 试剂
氢氧化钠	SIGMA，MO	367176-2.5KG	TBARS 试剂
SpeedVac 浓缩仪	Thermo Scientific，MA	SC250EXP	浓缩细胞裂解物
T-75 培养瓶，经组织培养处理，250 mL，带过滤盖	USA Scientific，佛罗里达州	658175	细胞培养
硫代巴比妥酸	SIGMA，MO	T5500-100G	TBARS 试剂
TRIS 碱	Fluka，GA	93362	细胞裂解试剂
胰蛋白酶 （1x）	VWR，PA	16777-166	分离 HepG2 细胞