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方法文章

使用硫代巴比妥酸反应物测定法评估生物样本中的氧化应激

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DOI：

10.3791/61122

⸱

2020年5月12日

 , 
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

本文内容

摘要

硫代巴比妥酸反应性物质检测的目的是通过在532 nm可见光波长下使用分光光度法测定脂质过氧化产物（主要是丙二醛）的生成量，来评估生物样本中的氧化应激水平。此处所述方法可应用于人血清、细胞裂解液和低密度脂蛋白。

摘要

尽管硫代巴比妥酸反应物（TBARS）测定法在分析特异性和稳健性方面存在局限性，但它仍被广泛用作生物流体中脂质过氧化的通用指标。只要样本得到妥善处理和储存，该方法通常被认为是反映生物样本中氧化应激水平的良好指标。该检测基于脂质过氧化产物（主要是丙二醛，MDA）与硫代巴比妥酸（TBA）发生反应，生成称为TBARS的MDA-TBA2加合物。TBARS呈现红色至粉红色，可在532 nm波长下通过分光光度法进行测定。TBARS测定在酸性条件（pH = 4）和95 °C下进行。纯MDA不稳定，但在上述条件下可从用作本方法分析标准品的MDA双（二甲基缩醛）中释放出MDA。TBARS测定是一种操作简便的方法，约需2小时即可完成。本文详细描述了测定试剂的配制方法。注重预算的研究人员可使用这些试剂以较低成本开展多次实验，而不必购买昂贵的TBARS测定试剂盒（此类试剂盒通常仅能构建一条标准曲线，因而只能用于一次实验）。本TBARS测定方法已成功应用于人血清、低密度脂蛋白及细胞裂解液。该方法结果稳定且可重复，检测限可达1.1 μM。本文还提供了分光光度法TBARS测定的使用与结果解读建议。

引言

脂质过氧化是一种自由基（如活性氧和活性氮）攻击脂质中碳-碳双键的过程，该过程涉及从碳原子上夺取一个氢原子并插入一个氧分子。这一过程产生一系列复杂的产物，主要包括脂质过氧自由基和氢过氧化物等初级产物，以及丙二醛（MDA）和4-羟基壬烯醛等主要的次级产物1。

由于丙二醛（MDA）与硫代巴比妥酸（TBA）反应迅速，它已被广泛用作生物医学研究中脂质过氧化的标志物。该反应生成MDA-TBA2复合物，在可见光谱532 nm处有吸收峰，并产生红粉色2。除MDA外，脂质过氧化产生的其他分子也可与TBA反应，并在532 nm处吸收光，从而贡献于所测得的总吸收信号。类似地，MDA还可与大多数其他主要类别的生物分子发生反应，可能限制其与TBA反应的可及性3,4。因此，这种传统检测方法通常被认为仅用于测定“硫代巴比妥酸反应性物质”（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）5。

当正确实施和解读时，TBARS 检测通常被认为是反映生物样本中氧化应激总体水平的良好指标6。然而，正如 Khoubnasabjafari 及其他研究者所记录，TBARS 检测常以容易导致不可靠结论的方式进行和解读3,4,7,8,9,10,11。造成这一问题的主要原因在于与样本相关的分析前变量，以及该检测方法缺乏稳健性，即实验方案中看似微小的变动就可能导致检测结果发生显著变化1,7,12,13。

与生物样本处理和储存相关的分析前变量（例如，血液血浆暂时保存在 -20 °C）14,15 可能对 TBARS 检测结果产生重大影响16,17；影响程度之大，以至于除非有明确的实验室间分析验证数据支持，否则不应在不同实验室之间比较 TBARS 检测结果。这一建议类似于 Western blot 的常规使用和解读方式：条带密度的比较仅在同一次印迹内，或可能在同一实验室内部的研究中有效，而在不同实验室之间比较条带密度通常被视为无效的做法。

一些研究者指出，通过TBARS法测定的MDA水平根本无法满足可接受生物标志物所需的分析或临床标准3,9,10,18,19。事实上，如果该检测方法不是在50多年前开发出来的，它很可能不会获得如今如此广泛的应用和默认的认可。尽管目前已有其他在分析灵敏度、特异性和稳健性方面更优的检测方法用于评估氧化应激，但基于532 nm处吸光度测定的TBARS法仍然是迄今为止最常用的脂质过氧化检测方法之一20，从而用于评估氧化应激水平。

TBARS 检测目前仅能以价格昂贵的试剂盒形式获得（超过 400 美元），且试剂盒说明书并未提供所用试剂大多数浓度的详细信息。此外，试剂盒所提供的试剂仅够进行一次实验，因为每个试剂盒只能制作一条比色标准曲线。这对于需要在不同时间点测定少量样品氧化水平的研究人员而言可能存在问题，因为同一标准曲线无法在多个时间点重复使用，因此必须为多次实验分别购买多个试剂盒。目前，除非购买昂贵的试剂盒，否则文献中尚无详细的 TBARS 检测操作方案可供参考。过去虽有部分研究人员粗略描述过 TBARS 检测的操作方法21,22，但尚未有完整详尽的操作流程或全面的视频教程，介绍如何在不依赖昂贵试剂盒的情况下完成 TBARS 检测。

本文报道了一种详细且经过分析验证的专用方法，用于以简单、可重复且经济的方式进行TBARS测定。通过Cu(II)离子处理人血清、HepG2细胞裂解物和低密度脂蛋白后其脂质过氧化水平的变化，展示了TBARS测定的典型应用实例。结果表明，该TBARS测定方法在不同日期间具有良好的一致性和可重复性。

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方案

人血清样本是在获得机构审查委员会批准并遵循《赫尔辛基宣言》原则的前提下，从知情同意的志愿者处采集的。样本在转移至分析实验室之前已进行编码并去除了个人身份信息。

1. 样品制备

  1. HepG2 细胞裂解液
    1. 在 16 个 T75 培养瓶中，每瓶接种约 10 × 106 个 HepG2 细胞，每瓶加入 14 mL 添加 10% 胎牛血清（FBS）的 EMEM 培养基，培养 2 天。
    2. 配制 RIPA 裂解缓冲液：取一个 50 mL 离心管，加入 1.5 mL 5 M NaCl、2.5 mL 1 M Tris-HCl（pH = 7）、500 μL NP-40 试剂，然后用去离子水定容至 50 mL。
    3. 配制裂解缓冲液：将 20 mL RIPA 缓冲液分装至一个 50 mL 离心管中，加入 200 μL 100× 蛋白酶抑制剂溶液，以抑制蛋白质和脂质降解。4 °C 保存。
      注意：该裂解缓冲液与 TBARS 试剂兼容，不会干扰 532 nm 处的吸光度。若计划使用其他裂解缓冲液或向其中添加额外成分，需先进行预实验验证其组分与 TBARS 检测的兼容性。
    4. 吸除含 10% FBS 的培养基，用 5 mL 冷的无菌 1× PBS 洗涤细胞 2 次。
    5. 向含细胞的 T75 培养瓶中加入 1 mL 裂解缓冲液，室温（RT）孵育 10 分钟，期间持续轻柔摇晃，确保缓冲液均匀分布。
    6. 将裂解液收集至适当标记的 2 mL 带盖聚丙烯离心管中，冰上孵育 10 分钟。
    7. 在室温下以 5,000 × g 离心 10 分钟，收集细胞碎片，将上清液转移至一个 15 mL 离心管中。
    8. 使用真空浓缩仪（Speed Vac）在 50 °C 和 3 mbar 条件下将细胞裂解液上清浓缩 4 倍，并将 94 μL 每份分装至 2 mL 带盖聚丙烯离心管中。样品保存于 -80 °C，待用于体外氧化实验和/或 TBARS 检测。
      注意：为避免浓缩细胞裂解 上清液，也可使用 3 mL 1× 胰蛋白酶消化细胞，用 6 mL 培养基中和，再用 5 mL 冷 PBS 洗涤 2 次。将细胞沉淀重悬于 250 μL 裂解缓冲液中，然后执行步骤 1.1.6 和 1.1.7。
    9. 在乙酸溶液（pH = 4）中配制 35 mM CuCl2 储存液。
      1. 配制乙酸溶液（pH = 4）：将 1 μL 冰乙酸加入 100 mL 去离子水中（pH 应约为 4，需用 pH 计确认），根据需要添加水或乙酸调节 pH 至 4。
      2. 称取约 0.1936 g 二氯化铜（CuCl2），溶于 10 mL 乙酸溶液（pH = 4）中，配制成 144 mM CuCl2 储存液。从中取出 490 μL，加入 1,510 μL 乙酸溶液（pH = 4）中，得到 35 mM CuCl2 溶液。
    10. 从 35 mM CuCl2 储存液中取 6 μL，加入 6 份含 94 μL 细胞裂解液的样品中，使最终 CuCl2 浓度约为 2 mM。另取 6 μL 不含 CuCl2 的乙酸溶液（pH = 4）加入 6 份含 94 μL 细胞裂解液的样品中作为对照。最终细胞裂解液体积应为 100 μL，用于 TBARS 检测。
      注意：将 35 mM CuCl2 储存液配制于乙酸（pH = 4）中，可防止氢氧化铜沉淀。
    11. 将样品在 37 °C 烤箱中孵育 24 小时，对每份最终体积为 100 μL 的样品进行 TBARS 检测。
    12. 在不同日期重复步骤 1.1.9 和 1.1.11 两次，以验证 HepG2 细胞裂解液 TBARS 检测的可重复性。
  2. 低密度脂蛋白
    注意：通常，预纯化的低密度脂蛋白（LDL）含有一定量的 EDTA。本实验所用 LDL 样品含 0.01% EDTA。EDTA 可抑制体外 Cu(II) 介导的 LDL 氧化，因此在实验或分析前可能需要去除 LDL 样品中的 EDTA。步骤 1.2.1–1.2.5 描述了该过程。
    警告：氢氧化钠具有腐蚀性，可引起皮肤和眼睛刺激。请使用适当的个人防护装备。
    1. 从 5.51 mg/mL 的 LDL 储存液（蛋白浓度通过改良 Lowry 法测定，以 BSA 为标准）中取 24 μL，分装至适当标记的 1 mL 带盖聚丙烯离心管中。根据需要制备足够份数，4 °C 保存，待用于氧化实验和/或 TBARS 检测。
    2. 配制 10 mM HEPES 缓冲液（含 0.15 M NaCl，用 NaOH 颗粒调节 pH 至 7）：将 4.39 g NaCl 溶于 0.49 L 水中，加入 1.19 g HEPES，用磁力搅拌器充分溶解。加入氢氧化钠颗粒调节 pH 至 7，再加水定容至 0.5 L。4 °C 保存，3 个月内使用。
    3. 向分装的 LDL 样品中加入 476 μL 10 mM HEPES 缓冲液（含 0.15 M NaCl，pH = 7），使总体积达 500 μL。将稀释后的 LDL 样品加入 0.5 mL 离心超滤装置（截留分子量 100K）中。
    4. 在室温下以 14,000 × g 离心 10 分钟，保留约 30 μL 滤留液体积。用 480 μL 10 mM HEPES 缓冲液（含 0.15 M NaCl，pH = 7）重悬样品，再次以 14,000 × g 离心 10 分钟。重复此步骤共 4 次（即共进行 4 次超滤）。
    5. 将滤膜装置倒置放入新的 2 mL 带盖聚丙烯离心管中，以 1,000 × g 离心 2 分钟，收集 LDL 样品（最终体积约 30 μL）。
    6. 将样品分装至适当标记的 1 mL 离心管中，每管加入 20 μL 水，使最终体积为 50 μL。
    7. 在乙酸溶液（pH = 4）中配制 200 μM CuCl2 储存液
      1. 配制乙酸溶液（pH = 4）：参见步骤 1.1.9.1。
      2. 配制 144 mM CuCl2 储存液（参见步骤 1.1.9.2），从中取 5.5 μL，溶于 4 mL 乙酸溶液（pH = 4）中，定容至 4 mL，得到 200 μM 溶液。
    8. 从 200 μM CuCl2 储存液中取 2.7 μL，加入 6 份含 50 μL LDL 的样品中，使最终 CuCl2 浓度约为 10 μM。另取 2.7 μL 不含 CuCl2 的乙酸溶液（pH = 4）加入 6 份含 50 μL LDL 的样品中作为对照。
    9. 将 LDL 样品在 37 °C 烤箱中孵育 2 小时。孵育结束后，用 10 mM HEPES 缓冲液（含 0.15 M NaCl，pH = 7）将每份样品补至 100 μL，立即进行 TBARS 检测。
    10. 在两个不同日期重复步骤 1.2.3–1.2.9 两次，以验证 TBARS 检测的可重复性。
  3. 人血清
    1. 从人血清样品中取 94 μL 每份，分装至 2 mL 带盖聚丙烯离心管中，-80 °C 保存。
    2. 在乙酸溶液（pH = 4）中配制 35 mM CuCl2 储存液：参见步骤 1.1.9。
    3. 从 CuCl2 储存液中取 6 μL，加入 6 份含 94 μL 人血清的样品中，使最终 CuCl2 浓度约为 2 mM。另取 6 μL 不含 CuCl2 的乙酸溶液（pH = 4）加入 6 份含 94 μL 人血清的样品中作为对照。
    4. 将人血清样品在 37 °C 烤箱中孵育 24 小时，通过 TBARS 检测（第 4 节）测定氧化水平。
    5. 在两个不同日期重复步骤 1.3.2–1.3.4 两次，以确定 TBARS 检测的可重复性。

2. 试剂准备

警告：硫代巴比妥酸会引起皮肤和眼睛刺激，吸入或经皮肤吸收可能有害。吸入乙酸可能损伤内脏器官。所有酸溶液均须在通风橱中配制。

  1. 8.1% (w/v) 十二烷基硫酸钠 (SDS) 溶液的制备
    1. 称取 32.4 g SDS，加入 350 mL 去离子水中，于烧杯中溶解。使用磁力搅拌子轻轻搅拌以溶解 SDS，避免产生气泡。用去离子水定容至 400 mL，将 SDS 溶液在室温下储存。
      注意：此处制备了过量的 8.1% SDS 溶液；然而，对于 96 个样品，仅需约 20 mL 的 8.1% SDS 溶液。请根据待分析样品的数量配制相应体积的溶液。
  2. 3.5 M 醋酸钠缓冲液 (pH = 4) 的制备
    1. 在烧杯中将 100 mL 冰醋酸稀释于 350 mL 去离子水中。使用磁力搅拌子轻轻搅拌溶解。
    2. 使用氢氧化钠颗粒与水配制 6.5 M NaOH 溶液：将 13 g NaOH 颗粒溶解于 40 mL 去离子水中，再用去离子水定容至 50 mL。
    3. 在磁力搅拌下，缓慢向醋酸溶液中加入约 46 mL 的 6.5 M NaOH 溶液（应使 pH 升至 4，但需使用 pH 计边测量边缓慢添加 NaOH 溶液以确认 pH 值）。
    4. 用去离子水定容至 500 mL，将醋酸钠缓冲液在室温下储存。
  3. 0.8% 硫代巴比妥酸水溶液 (调节至 pH = 4) 的制备
    注意：此步骤中硫代巴比妥酸溶液的配制针对大体积进行了优化，因为将要分析大量样品（108 个样品，不包括标准品）。请根据计划分析的样品数量配制相应体积的溶液。
    1. 使用氢氧化钠颗粒和水配制 5 M 氢氧化钠溶液：将 4 g 氢氧化钠颗粒溶于 20 mL 水中定容。储存于塑料容器中。该溶液应每次使用前新鲜配制。
    2. 称取 4 g 硫代巴比妥酸，加入 450 mL 去离子水。使用磁力搅拌子轻轻搅拌溶解。
      注意：该溶液最终将定容至 500 mL。
    3. 在磁力搅拌下溶解硫代巴比妥酸的过程中，以 100 μL 为增量，缓慢逐滴加入约 3 mL 的 5 M NaOH 溶液。加入 NaOH 溶液后，硫代巴比妥酸颗粒将开始溶解。
    4. 若硫代巴比妥酸颗粒仍未完全溶解，继续以 100 μL 为增量添加 5 M NaOH 溶液，直至所有硫代巴比妥酸颗粒完全溶解。对于此特定体积的溶液，共需加入 4 mL 的 5 M NaOH 溶液才能使硫代巴比妥酸颗粒完全溶解。
      注意：在此浓度下，除非 pH 接近 4，否则硫代巴比妥酸不会完全溶解。
    5. 当所有硫代巴比妥酸 颗粒完全溶解后，停止添加 NaOH。避免 pH 超过 4。可通过从正在搅拌的硫代巴比妥酸 溶液中取 1 μL 滴于 pH 试纸上，以验证最终 pH 值。
    6. 用去离子水定容至 500 mL，将 0.8% 硫代巴比妥酸水溶液在室温下储存。

3. 丙二醛二（二甲基缩醛）标准样品制备

注意：丙二醛（MDA）不稳定，无法直接购买获得。然而，存在多种可商业获取的 MDA 化学形式，例如丙二醛四丁基铵盐、丙二醛双（二甲基缩醛）和丙二醛双（二乙基缩醛）。在这三种化学形式中，本文采用丙二醛双（二甲基缩醛），因为大多数研究均使用这一标准21,22。若选择使用另外两种 MDA 化学形式，应事先验证其适用性。

  1. 通过将92 μL纯MDA bis(dimethyl acetal)溶于1 L去离子水中，配制550 μM MDA bis(dimethyl acetal)储备液。使用磁力搅拌器彻底混匀溶液10分钟。将溶液储存于4 °C，且在1个月内使用。
  2. 取726 μL的550 μM MDA bis(dimethyl acetal)储备液，加入1274 μL去离子水中，稀释配制200 μM MDA bis(dimethyl acetal)溶液。每次进行TBARS检测时，均应新鲜配制该200 μM MDA bis(dimethyl acetal)溶液。
  3. 标准曲线制备：取八个2 mL带盖聚丙烯管，标记为A至H。根据表1所述，从200 μM储备液中加入相应体积的MDA bis(dimethyl acetal)，并用水稀释。
  4. 取八支玻璃管（13 mm × 100 mm），标记为A–H，然后向对应管中加入100 μL标准品溶液。对空白标准品（样品A）进行六次重复测定，以计算TBARS检测的检出限。
    注意：此步骤可暂停，但不超过1小时。

4. TBARS 测定

注意：一旦开始TBARS检测，应连续完成，不得中断。

  1. 根据待分析样品的数量取相应数量的玻璃管，并用样品名称进行标记。然后，向每根玻璃管中加入100 μL的各已制备样品（如上所述）。
  2. 向每个样品和标准品中加入200 μL的8.1% SDS溶液，并轻轻旋转摇动玻璃管，使样品充分混匀。
  3. 向每个样品和标准品中加入1.5 mL的3.5 M乙酸钠缓冲液（pH = 4）。
  4. 向每个样品和标准品中加入1.5 mL的0.8%硫代巴比妥酸水溶液（pH = 4）。
  5. 通过加入700 μL去离子水，将每个样品和标准品的终体积调整至4 mL。
  6. 将每根玻璃管盖紧，置于设定为95 °C的加热块中孵育1小时。用铝箔包裹玻璃管顶部，以防止冷凝水形成。
  7. 从加热块中取出玻璃管，置于冰上孵育30分钟。
  8. 在4 °C条件下，以1500 × g离心样品和标准品10分钟。离心后，将含有样品和标准品的玻璃管置于室温下保存。
    注意：若将样品保持在冰上或4 °C条件下，会导致样品或标准品完全沉淀。
  9. 离心后立即从每根管中取出150 μL上清液，转移至96孔板的各个独立孔中。
  10. 使用移液器吸头去除每个孔中的气泡。
    注意：孔中存在气泡会导致吸光度读数不一致，从而引起检测结果精密度降低。
  11. 在532 nm波长下测定吸光度。用所有其他样品的吸光度值减去空白样品的平均吸光度值。
  12. 通过绘制532 nm处扣除空白后的吸光度值与各标准品已知浓度的关系图，建立标准曲线。采用线性回归拟合数据点。根据标准曲线所得线性回归方程，计算未知样品的浓度。

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结果

在酸性条件（pH = 4）下且在 95 °C，丙二醛（MDA）双（二甲基缩醛）可生成丙二醛（MDA）23MDA 及其密切相关的化学同系物与两分子硫代巴比妥酸（TBA）反应，生成称为硫代巴比妥酸反应性物质（TBARS）的化合物，呈现红粉色，并具有吸收波长 λ最大 在 532 nm 处（图1, 图2）。以 MDA 双（二甲基缩醛）为标准品，绘制标准曲线（图3, 表1) 以确定该检测方法的检出限、灵敏度以及三种不同生物样本中的氧化水平。为测定这三个不同样本在不同日期的氧化水平，共进行了九次TBARS检测。因此，共生成了九条标准曲线，如图所示。 图3最小二乘法24 用于确定斜率和 y 轴截距的标准偏差，分别为 8.67 x 10-6 和 ...

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讨论

尽管存在诸多局限性1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19，且不适合在不同实验室之间进行比较，TBARS 检测仍是测定生物样本中氧化应激的最古老29,

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披露

作者声明无竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

本研究部分得到了美国国立卫生研究院国家癌症研究所资助号 R33 CA217702 以及学生发展最大化倡议（IMSD）项目的支持。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x 无菌 PBS，pH 7.4，1 LVWR, PA101642--262细胞裂解试剂
50 mL 自立式离心管Corning, NYCLS430897通用材料
96 孔板，未处理，透明，带盖，非无菌Thermo Fisher Scientific, MA280895用于测定吸光度
Amicon Ultra-0.5 100 kD 离心过滤装置Fisher Scientific, NHUFC510024LDL 纯化
玻璃管帽Thermo Fisher Scientific, MA14-930-15D用于 TBARS 测定
氯化铜 II（Copper II Chloride）SIGMA, MO222011-250G用于诱导氧化
培养管，一次性，带螺旋盖，硼硅酸盐玻璃（13 x 100 mm）VWR, PA53283-800用于 TBARS 测定
伊格尔最低必需培养基（EMEM）ATCC, VAHB-8065HepG2 细胞培养基
Eppendorf 安全锁扣管，1.5 mLeppendorf, NY22363204通用材料
Eppendorf 安全锁扣管，2.0 mLGenesee Scientific, CA22363352通用材料
胎牛血清，美国来源Omega Scientific, CAFB-11用于细胞培养
冰醋酸SIGMA, MO27225-1L-RTBARS 试剂
Halt 蛋白酶抑制剂混合物（100x）Thermo Scientific, MA87786细胞裂解试剂
HEPESSIGMA, MOH3375-250GLDL 溶剂
HepG2 细胞ATCC, VAHB-8065生物基质原型
盐酸（HCl）Fisher Scientific, NHA144-212细胞裂解试剂
Legend Micro 17 离心机Thermo Scientific, MA75002431通用材料
低密度脂蛋白，人血浆来源Athens Research & Technology, GA12-16-120412生物基质原型
磁力搅拌子，八角形 6 件装组合VWR, PA58948-025通用材料
丙二醛双（二甲基缩醛）SIGMA, MO8207560250TBARS 标准品
Multiskan Go 微孔板分光光度计Fisher Scientific, NH51119200用于测定吸光度
NP-40EMD Millipore Corp, MA492016-100ML细胞裂解试剂
氯化钠SIGMA, MOS7653-1KG细胞裂解试剂
十二烷基硫酸钠（SDS）SIGMA, MO436143-100GTBARS 试剂
氢氧化钠SIGMA, MO367176-2.5KGTBARS 试剂
SpeedVac 浓缩仪Thermo Scientific, MASC250EXP用于浓缩细胞裂解液
T-75 培养瓶，组织培养处理，250 mL，带滤膜瓶盖USA Scientific, FL658175细胞培养
硫代巴比妥酸SIGMA, MOT5500-100GTBARS 试剂
TRIS 碱Fluka, GA93362细胞裂解试剂
胰蛋白酶（1x）VWR, PA16777-166用于解离 HepG2 细胞

参考文献

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使用硫代巴比妥酸反应物测定法评估生物样本中的氧化应激
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