使用硫代巴比妥酸反应物质测定法评估生物样品中的氧化应激

摘要

硫代巴比妥酸反应物质测定的目的是通过使用可见光波长分光光度法在532nm处测量脂质过氧化产物（主要是丙二醛）的产生来评估生物样品中的氧化应激。这里描述的方法可应用于人血清、细胞裂解物和低密度脂蛋白。

摘要

尽管硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）测定的分析特异性和坚固性有限，但已被广泛用作生物体液中脂质过氧化的通用指标。它通常被认为是生物样品中氧化应激水平的良好指标，前提是样品已得到妥善处理和储存。该测定涉及脂质过氧化产物（主要是丙二醛（MDA））与硫代巴比妥酸（TBA）的反应，这导致形成称为TBARS的MDA-TBA2加合物。TBARS产生红粉红色，可以在532nm处进行分光光度法测量。TBARS测定在酸性条件（pH = 4）和95°C下进行。 纯MDA是不稳定的，但这些条件允许MDA双（二甲缩醛）释放MDA，MDA在该方法中用作分析标准。TBARS测定是一种简单的方法，可以在大约2小时内完成。此处详细介绍了测定试剂的制备。注重预算的研究人员可以低成本将这些试剂用于多个实验，而不是购买昂贵的TBARS检测试剂盒，该试剂盒仅允许构建单个标准曲线（因此只能用于一个实验）。该TBARS测定的适用性在人血清，低密度脂蛋白和细胞裂解物中显示。该测定结果一致且可重复，检测限可达到 1.1 μM。提供了分光光度法TBARS测定的使用和解释的建议。

引言

脂质过氧化是自由基（如活性氧和活性氮）攻击脂质中的碳 - 碳双键的过程，该过程涉及从碳中抽取氢并插入氧分子。该过程导致复杂产物的混合物，包括脂质过氧自由基和氢过氧化物作为主要产物，以及丙二醛（MDA）和4-羟基壬烯醛作为主要的二次产物¹。

MDA因其与硫代巴比妥酸（TBA）的易反应而被广泛用于生物医学研究中，作为脂质过氧化的标志物。该反应导致MDA-TBA2的形成，MDA-TBA2是一种共轭物，在532nm处的可见光谱中吸收并产生红粉红色²。除MDA外，来自脂质过氧化的其他分子也可以与TBA反应并在532nm处吸收光，从而有助于测量的整体吸收信号。同样，MDA可以与大多数其他主要类别的生物分子反应，可能限制其与^TBA3，4反应的可及性。因此，这种传统的测定方法仅被认为可以测量"硫代巴比妥酸反应物质"或^TBARS5。

当正确应用和解释时，TBARS测定通常被认为是生物样品中氧化应激总体水平的良好指标⁶。不幸的是，正如Khoubnasabjafari和其他人所记录的那样，TBARS测定的进行和解释方....

方案

人类血清标本是在IRB批准下根据《赫尔辛基宣言》中表达的原则从同意的志愿者那里获得的。在转移到分析实验室之前，对标本进行编码和去鉴定。

1. 样品制备

1. 七氢呋喃二酮细胞裂解物
   1. 将每个烧瓶接种约10×10 ⁶ 个HepG2细胞放入16个T75烧瓶中，加入14mL EMEM培养基，补充10%胎牛血清（FBS），并培养细胞2天。
   2. 制备 RIPA 缓冲液:在 50 mL 管中，加入 1.5 mL 5 M NaCl、2.5 mL 1 M Tris-HCl （pH = 7）、500 μL NP-40 试剂，然后用 DI 水将最终体积增至 50 mL。
   3. 制备裂解缓冲液:将20mL RIPA缓冲液等分到50mL管中，并加入200μL100x蛋白酶抑制剂溶液以抑制蛋白质和脂质降解。储存在4°C。
      注意:裂解缓冲液与TBARS试剂兼容，不会干扰532nm处的吸光度。如果计划使用不同的裂解缓冲液或向裂解缓冲液中添加其他成分，则需要进行初步验证研究以验证裂解缓冲液组分是否与TBARS测定兼容。
   4. 取出含有10%FBS的培养基，用5 mL冷无菌1x PBS洗涤细胞2x。
   5. 向含有细胞的T75烧瓶中加入1mL裂解缓冲液，并在室温（RT）下孵育10分钟，并持续旋转以确保缓冲液分布良好。
   6. 将裂解物收集到....

结果

在酸性条件（pH = 4）和95°C下，丙二醛（MDA）双（二甲缩醛）产生^MDA23。MDA和密切相关的化学同源物与两个硫代巴比妥酸分子（TBA）反应，产生称为硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）的化合物，其呈红粉红色，在532nm处具有吸光度_λmax （图1， 图2）。以MDA bis（缩二甲醇）为标准，生成标准曲线（图3， 表1），以确定三种不同生物样品的检测限和测定灵敏度以及氧化水平。共进行了9次TBARS测定，以确定不同日期三种不同样品的氧化水平。因此，总共生成了九条标准曲线，如图 3所示。最小二乘法²⁴ 确定斜率和y截距的标准差，分别为8.67 x ^10-6 和5.66 x ^10-4。

讨论

尽管 TBARS 检测方法存在局限性^{1、3、4、7、8}、^9、10、^12、13、14、^15、19 且不适合在实验室之间进行比较，但 TBARS 检测方法是最古老的^{检测方法之一29.......}

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x 无菌 PBS pH 7.4 1 L	VWR，PA	--262	细胞裂解试剂
50 mL 自立式离心管	康宁，纽约	CLS430897	通用材料
96 孔板，未处理，透明，带盖，未灭菌	Thermo Fisher Scientific，MA	280895	测量吸光度
Amicon Ultra-0.5 100 kD 离心离心过滤装置	Fisher Scientific，新罕布什尔州	UFC510024	LDL 纯化
玻璃管盖	Thermo Fisher Scientific，MA	14-930-15D	，用于 TBARS 检测
氯化铜	II，MO	222011-250G	诱导氧化
一次性培养管，螺旋盖，硼硅酸盐玻璃 （13 x 100 mm）	VWR，PA	53283-800	用于 TBARS 检测
Eagle 最低必需培养基 （EMEM）	ATCC， VA	HB-8065	HepG2 细胞培养基
Eppendorf Safe-Lock Tubes， 1.5 mL	Eppendorf， NY	22363204	通用材料
Eppendorf Safe-Lock Tubes， 2.0 mL	Genesee Sceitific， CA	22363352	通用材料
胎牛血清 美国来源	Omega Scientific， CA	FB-11	用于细胞培养
冰醋酸	SIGMA， MO	27225-1L-R	TBARS 试剂
Halt 蛋白酶抑制剂混合物 （100x）	Thermo Scientific，MA	87786	细胞裂解试剂
HEPES	SIGMA，MO	H3375-250G	LDL 溶剂
HepG2 细胞	ATCC，VA	HB-8065	生物基质原型
氢氯酸 （HCl）	Fisher Scientific，NH	A144-212	细胞裂解试剂
Legend Micro 17 离心机	Thermo Scientific，MA	75002431	通用材料
低密度脂蛋白，人血浆	Athens Research &技术，GA	12-16-120412	生物基质原型
磁力搅拌棒，八边形 6 种分类	VWR，PA	58948-025	一般材料
二醛双（二甲基缩醛）	SIGMA，MO	8207560250	TBARS 标准
Multiskan Go 全波长酶标仪	Fisher Scientific，NH	51119200	吸光度
NP-40	EMD Millipore Corp，MA	492016-100ML	细胞裂解试剂
氯化钠	SIGMA，MO	S7653-1KG	细胞裂解试剂
十二烷基硫酸钠 （SDS）	SIGMA，MO	436143-100G	TBARS 试剂
氢氧化钠	SIGMA，MO	367176-2.5KG	TBARS 试剂
SpeedVac 浓缩仪	Thermo Scientific，MA	SC250EXP	浓缩细胞裂解物
T-75 培养瓶，经组织培养处理，250 mL，带过滤盖	USA Scientific，佛罗里达州	658175	细胞培养
硫代巴比妥酸	SIGMA，MO	T5500-100G	TBARS 试剂
TRIS 碱	Fluka，GA	93362	细胞裂解试剂
胰蛋白酶 （1x）	VWR，PA	16777-166	分离 HepG2 细胞