使用硫代巴比妥酸反应物测定法评估生物样本中的氧化应激

摘要

硫代巴比妥酸反应性物质检测的目的是通过在532 nm可见光波长下使用分光光度法测定脂质过氧化产物（主要是丙二醛）的生成量，来评估生物样本中的氧化应激水平。此处所述方法可应用于人血清、细胞裂解液和低密度脂蛋白。

摘要

尽管硫代巴比妥酸反应物（TBARS）测定法在分析特异性和稳健性方面存在局限性，但它仍被广泛用作生物流体中脂质过氧化的通用指标。只要样本得到妥善处理和储存，该方法通常被认为是反映生物样本中氧化应激水平的良好指标。该检测基于脂质过氧化产物（主要是丙二醛，MDA）与硫代巴比妥酸（TBA）发生反应，生成称为TBARS的MDA-TBA₂加合物。TBARS呈现红色至粉红色，可在532 nm波长下通过分光光度法进行测定。TBARS测定在酸性条件（pH = 4）和95 °C下进行。纯MDA不稳定，但在上述条件下可从用作本方法分析标准品的MDA双（二甲基缩醛）中释放出MDA。TBARS测定是一种操作简便的方法，约需2小时即可完成。本文详细描述了测定试剂的配制方法。注重预算的研究人员可使用这些试剂以较低成本开展多次实验，而不必购买昂贵的TBARS测定试剂盒（此类试剂盒通常仅能构建一条标准曲线，因而只能用于一次实验）。本TBARS测定方法已成功应用于人血清、低密度脂蛋白及细胞裂解液。该方法结果稳定且可重复，检测限可达1.1 μM。本文还提供了分光光度法TBARS测定的使用与结果解读建议。

引言

脂质过氧化是一种自由基（如活性氧和活性氮）攻击脂质中碳-碳双键的过程，该过程涉及从碳原子上夺取一个氢原子并插入一个氧分子。这一过程产生一系列复杂的产物，主要包括脂质过氧自由基和氢过氧化物等初级产物，以及丙二醛（MDA）和4-羟基壬烯醛等主要的次级产物¹。

由于丙二醛（MDA）与硫代巴比妥酸（TBA）反应迅速，它已被广泛用作生物医学研究中脂质过氧化的标志物。该反应生成MDA-TBA₂复合物，在可见光谱532 nm处有吸收峰，并产生红粉色²。除MDA外，脂质过氧化产生的其他分子也可与TBA反应，并在532 nm处吸收光，从而贡献于所测得的总吸收信号。类似地，MDA还可与大多数其他主要类别的生物分子发生反应，可能限制其与TBA反应的可及性^3,4。因此，这种传统检测方法通常被认为仅用于测定“硫代巴比妥酸反应性物质”（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）⁵。

当正确实施和解读时，TBARS 检测通常被认为是反映生物样本中氧化应激总体水平的良好指标⁶。....

方案

人血清样本是在获得机构审查委员会批准并遵循《赫尔辛基宣言》原则的前提下，从知情同意的志愿者处采集的。样本在转移至分析实验室之前已进行编码并去除了个人身份信息。

1. 样品制备

1. HepG2 细胞裂解液
   1. 在 16 个 T75 培养瓶中，每瓶接种约 10 × 10⁶ 个 HepG2 细胞，每瓶加入 14 mL 添加 10% 胎牛血清（FBS）的 EMEM 培养基，培养 2 天。
   2. 配制 RIPA 裂解缓冲液：取一个 50 mL 离心管，加入 1.5 mL 5 M NaCl、2.5 mL 1 M Tris-HCl（pH = 7）、500 μL NP-40 试剂，然后用去离子水定容至 50 mL。
   3. 配制裂解缓冲液：将 20 mL RIPA 缓冲液分装至一个 50 mL 离心管中，加入 200 μL 100× 蛋白酶抑制剂溶液，以抑制蛋白质和脂质降解。4 °C 保存。
      注意：该裂解缓冲液与 TBARS 试剂兼容，不会干扰 532 nm 处的吸光度。若计划使用其他裂解缓冲液或向其中添加额外成分，需先进行预实验验证其组分与 TBARS 检测的兼容性。
   4. 吸除含 10% FBS 的培养基，用 5 mL 冷的无菌 1× PBS 洗涤细胞 2 次。
   5. 向含细胞的 T75 培养瓶中加入 1 mL 裂解....

结果

在酸性条件（pH = 4）下且在 95 °C，丙二醛（MDA）双（二甲基缩醛）可生成丙二醛（MDA）²³MDA 及其密切相关的化学同系物与两分子硫代巴比妥酸（TBA）反应，生成称为硫代巴比妥酸反应性物质（TBARS）的化合物，呈现红粉色，并具有吸收波长 λ_最大 在 532 nm 处（图1, 图2）。以 MDA 双（二甲基缩醛）为标准品，绘制标准曲线（图3, 表1) 以确定该检测方法的检出限、灵敏度以及三种不同生物样本中的氧化水平。为测定这三个不同样本在不同日期的氧化水平，共进行了九次TBARS检测。因此，共生成了九条标准曲线，如图所示。 图3最小二乘法²⁴ 用于确定斜率和 y 轴截距的标准偏差，分别为 8.67 x 10^-6 和 .......

讨论

尽管存在诸多局限性^{1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19}，且不适合在不同实验室之间进行比较，TBARS 检测仍是测定生物样本中氧化应激的最古老^29,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x 无菌 PBS，pH 7.4，1 L	VWR, PA	101642--262	细胞裂解试剂
50 mL 自立式离心管	Corning, NY	CLS430897	通用材料
96 孔板，未处理，透明，带盖，非无菌	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	用于测定吸光度
Amicon Ultra-0.5 100 kD 离心过滤装置	Fisher Scientific, NH	UFC510024	LDL 纯化
玻璃管帽	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	用于 TBARS 测定
氯化铜 II（Copper II Chloride）	SIGMA, MO	222011-250G	用于诱导氧化
培养管，一次性，带螺旋盖，硼硅酸盐玻璃（13 x 100 mm）	VWR, PA	53283-800	用于 TBARS 测定
伊格尔最低必需培养基（EMEM）	ATCC, VA	HB-8065	HepG2 细胞培养基
Eppendorf 安全锁扣管，1.5 mL	eppendorf, NY	22363204	通用材料
Eppendorf 安全锁扣管，2.0 mL	Genesee Scientific, CA	22363352	通用材料
胎牛血清，美国来源	Omega Scientific, CA	FB-11	用于细胞培养
冰醋酸	SIGMA, MO	27225-1L-R	TBARS 试剂
Halt 蛋白酶抑制剂混合物（100x）	Thermo Scientific, MA	87786	细胞裂解试剂
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	LDL 溶剂
HepG2 细胞	ATCC, VA	HB-8065	生物基质原型
盐酸（HCl）	Fisher Scientific, NH	A144-212	细胞裂解试剂
Legend Micro 17 离心机	Thermo Scientific, MA	75002431	通用材料
低密度脂蛋白，人血浆来源	Athens Research & Technology, GA	12-16-120412	生物基质原型
磁力搅拌子，八角形 6 件装组合	VWR, PA	58948-025	通用材料
丙二醛双（二甲基缩醛）	SIGMA, MO	8207560250	TBARS 标准品
Multiskan Go 微孔板分光光度计	Fisher Scientific, NH	51119200	用于测定吸光度
NP-40	EMD Millipore Corp, MA	492016-100ML	细胞裂解试剂
氯化钠	SIGMA, MO	S7653-1KG	细胞裂解试剂
十二烷基硫酸钠（SDS）	SIGMA, MO	436143-100G	TBARS 试剂
氢氧化钠	SIGMA, MO	367176-2.5KG	TBARS 试剂
SpeedVac 浓缩仪	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	用于浓缩细胞裂解液
T-75 培养瓶，组织培养处理，250 mL，带滤膜瓶盖	USA Scientific, FL	658175	细胞培养
硫代巴比妥酸	SIGMA, MO	T5500-100G	TBARS 试剂
TRIS 碱	Fluka, GA	93362	细胞裂解试剂
胰蛋白酶（1x）	VWR, PA	16777-166	用于解离 HepG2 细胞