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方法文章

利用染色质免疫沉淀-外切酶技术（ChIP-Exo）在小鼠干细胞来源的神经元中进行蛋白质-DNA相互作用的高分辨率作图

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DOI：

10.3791/61124

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2020年8月14日

 , 
1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 2Department of Biology, University of Toronto

本文内容

摘要

精确测定蛋白质在整个基因组上的结合位点对于理解基因调控至关重要。本文描述了一种 基因组定位方法，该方法对染色质免疫沉淀获得的DNA进行外切酶消化处理（ChIP-exo），随后进行高通量测序。该方法可在哺乳类神经元中以接近单碱基对分辨率和高信噪比检测蛋白质-DNA相互作用。

摘要

鉴定基因组上特定的蛋白质-DNA 相互作用对于理解基因调控至关重要。染色质免疫沉淀联合高通量测序（ChIP-seq）被广泛用于鉴定DNA结合蛋白在全基因组范围内的结合位点。然而，ChIP-seq 方法受限于超声处理后DNA片段长度的异质性以及非特异性背景DNA，导致作图分辨率较低且DNA结合位点存在不确定性。为克服这些局限，染色质免疫沉淀联合外切酶消化（ChIP-exo）技术利用5’至3’外切酶消化，将长度不均一的免疫沉淀DNA修剪至蛋白质-DNA交联位点。外切酶处理还可消除非特异性背景DNA。经文库制备和外切酶消化后的DNA可送至高通量测序。ChIP-exo 方法可实现接近单碱基对的作图分辨率，具有更高的检测灵敏度和更低的背景信号。以下描述了一种针对哺乳动物细胞和下一代测序优化的 ChIP-exo 实验方案。

引言

蛋白质与DNA相互作用的位置可揭示基因调控的机制。染色质免疫沉淀结合高通量测序（ChIP-seq）已被用于研究活细胞中全基因组范围内的蛋白质-DNA相互作用长达十年之久1,2。然而，ChIP-seq方法受限于DNA片段化不均一以及未结合DNA的污染，导致定位分辨率低、假阳性结果、漏检以及非特异性背景信号。将ChIP与外切酶消化相结合（ChIP-exo）可改进ChIP-seq方法，通过将ChIP获得的DNA修剪至蛋白质-DNA交联位点，实现接近单碱基对的分辨率并显著降低背景信号3,4,5。ChIP-exo所提供的高分辨率定位和低背景信号使得全基因组范围内蛋白质-DNA结合位点的精确且全面的鉴定成为可能。ChIP-exo能够揭示功能上不同的DNA结合基序、转录因子（TF）之间的协同相互作用，以及特定基因组结合位点内的多个蛋白质-DNA交联位点， 这些是其他基因组定位方法无法检测到的3,4,6,7。

ChIP-exo 最初被用于芽殖酵母中，以研究转录因子（TFs）在DNA上的序列特异性结合、转录起始前复合物的精确组织结构，以及全基因组范围内单个组蛋白的亚核小体结构4,8,9。自2011年该技术被提出以来4，ChIP-exo 已成功应用于多种其他生物体系，包括细菌、小鼠和人类细胞7,10,11,12,13,14,15,16,17。2016年，Rhee 等人14首次在哺乳动物神经元中应用 ChIP-exo，以探究在编程性转录因子 Lhx3 下调后，神经元基因表达是如何维持的；Lhx3 可与另一编程性转录因子 Isl1 形成异源二聚体复合物。该 研究表明，在 Lhx3 缺失的情况下，Isl1 会被招募至由 Onecut1 转录因子结合的新神经元增强子区域，从而维持神经元效应基因的基因表达。本研究中，ChIP-exo 揭示了多个转录因子如何以组合方式、在接近单核苷酸分辨率的水平上，动态识别细胞类型 和细胞发育阶段特异性的DNA调控元件。其他研究也利用 ChIP-exo 方法，探究了蛋白质与DNA在其他哺乳动物细胞系中的相互作用。Han 等人7采用 ChIP-exo 分析了小鼠红系细胞中 GATA1 和 TAL1 转录因子的全基因组分布。该研究发现，在整个红系分化过程中，TAL1 是直接与DNA结合，而非通过与 GATA1 的蛋白质-蛋白质相互作用间接结合。近期的研究还利用 ChIP-exo 对 CTCF、RNA 聚合酶 II 以及组蛋白修饰在人类细胞系中的全基因组结合位点进行分析，以研究表观基因组和转录调控机制18,19。

目前已有多个版本的 ChIP-exo 实验方案可供参考3,5,20。然而，对于不熟悉下一代测序文库构建的研究人员而言，这些 ChIP-exo 方案较难操作。曾有一个优秀的 ChIP-exo 方案发布，配有易于理解的操作说明和视频教程21，但其中包含 大量酶促反应步骤，完成所需时间较长。本文报道了一种新的 ChIP-exo 方案，减少了 酶促反应步骤和 孵育时间，并对每一步酶促反应进行了详细说明21。末端修复和 dA 加尾反应通过末端修复酶在一步中完成。利用连接增强剂，将索引接头和通用接头连接步骤的孵育时间从 2 小时缩短至 15 分钟。此前 ChIP-exo 方案中在索引接头连接后所需的激酶反应步骤被省略。取而代之的是，在索引接头的一条 5’ 端寡核苷酸合成时预先加入磷酸基团（表 1），用于后续的λ外切酶消化步骤。此前的 ChIP-exo 方案使用 RecJf 外切酶消化以去除单链 DNA 污染物，而本方案中省略了该步骤，因其对 ChIP-exo 文库质量并非关键。此外，在染色质免疫沉淀洗脱后对反向交联 DNA 进行纯化时，采用磁珠纯化方法替代苯酚:氯仿:异戊醇（PCIA）抽提法，从而缩短了 DNA 提取的孵育时间。更重要的是，该方法可有效去除索引接头连接过程中形成的大部分接头二聚体，避免其影响连接介导 PCR 的效率。

本文介绍的 ChIP-exo 方案经过优化，可用于检测从小鼠胚胎干细胞（ES 细胞）分化而来的哺乳动物神经元中精确的蛋白质-DNA 相互作用。简言之，收集并进行交联的神经元细胞经裂解后，使 染色质暴露于超声处理，通过超声获得合适大小的 DNA 片段（图 1）。利用抗体包被的磁珠选择性地对目标蛋白质结合的片段化可溶性染色质进行免疫沉淀。在免疫沉淀的 DNA 仍结合在磁珠上的状态下，依次进行末端修复、测序接头连接、填补反应 以及 5’ 至 3’ 的λ外切核酸酶消化。其中，外切核酸酶消化步骤赋予了 ChIP-exo 超高分辨率和高信噪比。λ外切核酸酶从交联位点附近开始，将免疫沉淀的 DNA 切除数个碱基对（bp），从而降解非特异性结合的污染 DNA。随后，将经外切核酸酶处理的 ChIP DNA 从抗体包被的磁珠上洗脱，逆转蛋白质-DNA 交联，并降解蛋白质。提取 DNA 后将其变性为单链 ChIP DNA，接着进行引物退火和延伸，生成双链 DNA（dsDNA）。然后，将通用接头连接至经外切核酸酶处理的 DNA 末端。最终得到的 DNA 经纯化后，进行 PCR 扩增、凝胶纯化，并用于高通量测序。

ChIP-exo 实验流程比 ChIP-seq 更长，但技术难度并不高。任何成功进行免疫沉淀的 ChIP DNA 均可进一步用于 ChIP-exo，只需增加若干酶学步骤即可。ChIP-exo 的显著优势包括超高的定位分辨率、背景信号显著降低以及假阳性结果减少 关于基因组结合位点的阳性与阴性结果，其价值超过了时间成本。

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方案

注意：配制缓冲液和反应主混合液时，建议使用经高压灭菌的蒸馏去离子水（ddH2O）。第1−4节描述细胞裂解和超声处理，第5−7节描述染色质免疫沉淀（ChIP），第8−11节描述磁珠上的酶促反应，第12和13节描述ChIP洗脱和DNA纯化，第14−19节描述文库构建。

1. 细胞的收获与交联

  1. 将小鼠胚胎干细胞分化为终末期神经元后，向收获的细胞中加入11%的甲醛，使其终浓度达到1%（v/v）。在室温（RT，25 °C）下于摇床（摇动平台、振荡器或旋转器）上轻轻摇动细胞15分钟。
    注意：根据目标蛋白交联的需求，可采用较低浓度的甲醛交联（例如终浓度为0.5%），或使用二琥珀酰亚胺基戊二酸酯（DSG）进行双重交联。
  2. 加入2.5 M甘氨酸，使其终浓度为150 mM，以终止交联反应。在室温下于摇床上轻轻摇动细胞5分钟。
  3. 将交联后的细胞在15 mL圆锥形离心管中，于室温下以1,350 × g 离心6分钟。吸除上清液，然后将细胞重悬于5 mL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）中。
    注意：交联后的细胞沉淀可在液氮中速冻后于-80 °C保存。

2. 细胞裂解

注意：本方案中的以下步骤适用于约 2 x 107 个由小鼠胚胎干细胞分化而来的神经元细胞。为裂解细胞，将使用含有多种去垢剂的裂解缓冲液。使用前，向 50 mL 缓冲液中加入 50 µL 的 1000 倍浓缩蛋白酶抑制剂（CPI）储备液。

  1. 按照表2所述配制裂解缓冲液1−3。
  2. 将交联的细胞沉淀置于冰上解冻，然后在15 mL锥形管中用3 mL裂解缓冲液1充分重悬细胞沉淀。在摇床上4 °C振荡15分钟。在4 °C以1,350 x g离心5分钟，吸除上清液。
  3. 用3 mL裂解缓冲液2充分重悬沉淀的细胞。在摇床上4 °C振荡10分钟。在4 °C以1,350 x g离心5分钟，吸除上清液。
  4. 向每份细胞沉淀中加入1 mL裂解缓冲液3，然后置于冰上。立即进行超声处理。

3. 染色质超声处理

注意：在超声处理过程中，应将样品置于冰上或 4 °C 环境中，以减少交联逆转。

  1. 使用无菌刮勺，将珠磨珠（材料表）加入至15 mL聚苯乙烯管的0.2 mL刻度线处。用600 µL 1× PBS重悬珠磨珠，涡旋振荡直至无可见干燥区域。在30 × g条件下离心5秒，并吸除1× PBS。
    注意：在聚苯乙烯管中进行超声处理比在聚丙烯管中更高效。若细胞数量较少（例如，<106个细胞），请使用1.5 mL聚苯乙烯管，无需添加珠磨珠。
  2. 将核裂解物充分重悬于1 mL裂解缓冲液3（来自步骤2.4）中，然后转移至含有珠磨珠的15 mL聚苯乙烯管中。短暂涡旋振荡聚苯乙烯管。
  3. 为片段化交联的染色质DNA，在4 °C条件下，以30 W功率振幅、30秒开启/30秒关闭的循环模式，进行优化次数的超声处理。
    注意：针对每种细胞类型和批次优化超声条件，可获得最佳的ChIP-exo产量。对于2 × 107个小鼠神经元细胞，在上述设置下进行20–30个超声循环，可将染色质片段化至100–500 bp范围内。
  4. 超声处理完成后，将每个样品的所有上清液（超声处理后的裂解物）转移至1.5 mL离心管中。向每个样品中加入10% 2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇，使其终浓度为1%。用移液器吹打混匀。
  5. 为沉淀细胞碎片，在4 °C条件下以13,500 × g离心10分钟。将每个样品的超声处理后裂解物（上清液）全部转移至新的1.5 mL离心管中。
  6. 从每个样品中取30 µL超声处理后的裂解物（约占超声处理后裂解物的3%），加入新的1.5 mL离心管中用于检测超声效果。将剩余的超声处理后裂解物于4 °C保存，待后续与抗体包被的磁珠孵育时使用。

4. 检查超声处理

  1. 通过加入2 mL 0.5 M Tris-HCl（pH 8.0）、2 mL 0.5 M EDTA、10 mL 10% 十二烷基硫酸钠（SDS）和6 mL 经高压灭菌的ddH2O，配制20 mL 2×蛋白酶K缓冲液。此缓冲液中不要加入CPI。将缓冲液储存于50 mL离心管中，室温保存。
  2. 为逆转蛋白-DNA交联并去除蛋白质，取每个样本（来自步骤3.6）的30 µL超声处理后的染色质，加入166 µL高压灭菌的ddH2O、200 µL 2×蛋白酶K缓冲液和4 µL 20 mg/mL蛋白酶K。短暂涡旋混匀样品，然后在65 °C、24 × g条件下孵育1–3小时。
  3. 注意：超声处理后的裂解物可在65 °C条件下过夜进行交联逆转。
  4. 采用PCIA（25:24:1）抽提与乙醇沉淀法提取DNA，步骤如下。
    警告：PCIA具有毒性。请在通风橱内操作，并佩戴标准个人防护装备（PPE）。
    1. 向1.5 mL离心管中的每个样品加入400 µL PCIA，将涡旋振荡器调至最高速度，振荡20秒。室温下以18,400 × g离心6分钟。此时可见两相分层。小心将每个样品的上层水相（澄清相）转移至新的1.5 mL离心管中。
    2. 向每个样品中加入1 µL 10 mg/mL RNase A。在37 °C孵育30分钟。
    3. 向每个样品中加入1 µL 20 mg/mL糖原，然后加入1 mL预冷的100%乙醇（存放于-20 °C冰箱）。短暂混匀后，将样品置于-80 °C冰箱中孵育30分钟至1小时。在4 °C下以18,400 × g离心10分钟，小心倾去上清中的100%乙醇。
    4. 用500 µL预冷的70%乙醇（存放于-20 °C冰箱）洗涤沉淀。在4 °C下以18,400 × g离心5分钟，小心倾去70%乙醇。
    5. 将样品置于1.5 mL离心管中，在50 °C孵育直至残留乙醇完全挥发。用15 µL高压灭菌的ddH2O或无核酸酶的ddH2O重悬DNA沉淀。
    6. 将提取的DNA样品与DNA分子量标记物一同在1.5%琼脂糖凝胶中以120–180 V电泳，检测超声处理后DNA的片段大小。

5. 抗体与磁珠孵育

注意：本方案中的以下步骤适用于约 2 x 107 个由小鼠胚胎干细胞分化而来的神经元细胞。在 ChIP-exo 操作过程中，切勿对磁珠进行冷冻和解冻，否则磁珠可能破裂，导致样本污染或抗体性能下降。

  1. 细胞裂解和超声处理后，为染色质免疫沉淀（ChIP）准备蛋白G磁珠（材料表），将磁珠混匀，然后向2 mL低吸附蛋白管中加入25 µL磁珠。
    注意：所用磁珠的类型取决于抗体的物种来源。
  2. 用1 mL封闭液（表2）洗涤磁珠，充分混匀，然后将管子置于磁力架上1分钟。仍在磁力架上时，待上清澄清后将其弃去。
  3. 向磁珠中加入1 mL封闭液。在4 °C摇床平台上轻轻摇动孵育10分钟。短暂离心后，将管子置于磁力架上并弃去上清。
  4. 重复步骤5.3两次。
  5. 向磁珠中加入500 µL封闭液。短暂离心后，取抗Isl1抗体（0.04 µg/µL，材料表），向含磁珠和封闭液的相应2 mL低吸附蛋白管中加入4 µg抗体。
  6. 重复步骤5.5，但不加抗体（即ChIP实验的无抗体对照）。
    注意：抗体的添加量可根据抗体质量和用于ChIP的细胞数量通过实验经验确定。
  7. 在4 °C摇床平台上轻轻摇动孵育样品6−24小时。

6. 染色质免疫沉淀（ChIP）

  1. 用1 mL封闭液洗涤第5.8步中的抗体包被磁珠。将样品置于4 °C摇床上孵育5分钟，然后移除上清液。
  2. 重复步骤6.1两次。
  3. 将抗体包被磁珠重悬于50 µL封闭液中，然后转移至新的2 mL低吸附蛋白管中。对于每个ChIP样品，将超声破碎后的裂解物（约1.0 mL，来自第3.6步）加入含有抗体包被磁珠的2 mL低吸附蛋白管中。
  4. 将每个样品置于4 °C摇床上过夜孵育。

7. 染色质免疫沉淀洗涤

注意：在 ChIP 洗涤过程中，将样品置于冰上或 4 °C 以维持蛋白质-DNA 交联。

  1. 按照表3所述配制高盐洗涤缓冲液、LiCl洗涤缓冲液和10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）。将缓冲液储存于50 mL离心管中，4 °C保存。使用前立即向所有缓冲液中加入50 µL的1000倍CPI储备液。
  2. 将2 mL低吸附蛋白管中的样品短暂离心，以收集管盖上的液体，随后置于磁力架上1分钟，并用移液器小心吸除上清液。
  3. 进行ChIP洗涤时，向每管中加入1 mL 4 °C的裂解缓冲液3，在4 °C摇床中混匀5分钟。短暂离心样品，置于磁力架上1分钟，用移液器吸除上清液。
  4. 向每管中加入1 mL预冷的高盐洗涤缓冲液，在4 °C摇床中混匀5分钟。短暂离心样品，置于磁力架上1分钟，用移液器吸除上清液。
  5. 向每管中加入1 mL预冷的LiCl洗涤缓冲液，在4 °C摇床中混匀5分钟。短暂离心样品，置于磁力架上1分钟，用移液器吸除上清液。
  6. 向每管中加入1 mL预冷的10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4），在4 °C摇床中混匀5分钟。短暂离心样品，置于磁力架上1分钟，用移液器吸除上清液。
    注意：可使用Tris-EDTA缓冲液（pH 8.0）替代Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）。
  7. 重复步骤7.4−7.6三次。
  8. 用500 µL Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）将样本磁珠转移至新的1.5 mL离心管中。短暂离心样品，置于磁力架上1分钟，用移液器吸除上清液。

8. 磁珠上的末端修复和dA加尾反应

注意：超声处理通常会产生非平末端的双链 DNA。在进行 dA 加尾反应及随后的索引接头连接步骤之前，需要进行末端修复反应，以获得平末端 DNA。对于带有索引接头 DNA 的黏性末端连接，dA 加尾反应会将 dATP 添加到平末端双链 DNA 片段的 3’ 端。末端修复反应体系中包含 dATP。

  1. 染色质免疫沉淀（ChIP）洗涤后，向1.5 mL离心管中的样本磁珠中加入38 µL灭菌去离子水（ddH2O），用于末端修复和dA加尾反应。
  2. 向每个样本中加入5.6 µL末端修复反应混合液和2.4 µL末端修复酶混合液（材料表），总体积为46 µL。将样本在20 °C孵育30分钟。
  3. 按照前述ChIP洗涤步骤7.4−7.6所述方法洗涤磁珠。

9. 磁珠上的索引接头连接

注意：索引接头包含6−10个碱基的条形码索引序列，这些序列针对特定样本，用于在高通量测序中对多个样本进行多重检测。索引接头DNA序列见表1。

  1. 进行index接头连接时，向样本磁珠中加入27 µL预冷的10 mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）。向每个样本中加入2 µL 15 µM的index接头、0.5 µL连接增强剂和15 µL连接酶主混合液（材料表）（总反应体积：44.5 µL）。
  2. 将样本在20 °C孵育15分钟。按照步骤7.4−7.6所述方法洗涤磁珠。

10. 磁珠上的填补反应

注意：连接接头后，接头的5’端与ChIP DNA的3’端之间不存在磷酸二酯键。该切口可通过填补反应进行修复。

  1. 向样本磁珠中加入 47 µL 冷的 10 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4）。
  2. 在冰上配制填补反应混合液（表 4 和材料表）。
  3. 向每个样本中加入 11.1 µL 填补反应混合液（总反应体积：58.1 µL）。将样本在 30 °C 下孵育 20 分钟。按照步骤 7.4−7.6 所述方法洗涤磁珠。

11. 磁珠上的λ外切酶消化

  1. 在磁珠上完成填补反应后，向样品磁珠中加入 50 µL 冷的灭菌去离子水（ddH2O）。
  2. 为从 5’ 到 3’ 方向消化 ChIP DNA，加入 6 µL 10× lambda 外切酶缓冲液和 2 µL 5 U/µL lambda 外切酶（材料表，总体积：58 µL）。将样品在 37 °C 下孵育 30 分钟。按照步骤 7.4−7.6 所述方法洗涤磁珠。

12. 洗脱与逆转交联

  1. 按照表5所述配制ChIP洗脱缓冲液。
    注意：ChIP洗脱缓冲液中不要加入CPI。
  2. 为从磁珠上洗脱ChIP样品，将样品重悬于75 µL ChIP洗脱缓冲液中，在65 °C、130 × g 条件下孵育15分钟。
  3. 向样品中加入2.5 µL 20 mg/mL蛋白酶K（材料表），短暂涡旋混匀，然后在65 °C孵育过夜。

13. DNA 提取

  1. 样品在 65 °C 孵育过夜后，短暂离心样品，置于磁力架上 1 分钟，然后将各样品的上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中。
  2. 向样品中加入 1 µL 的 10 mg/mL RNase A。短暂涡旋混匀，然后在 37 °C 孵育 30 分钟。加入约 25 µL 经高压灭菌的 ddH2O，使总体积达到 100 µL。
  3. 使用磁珠纯化 DNA（材料表）。用 16 µL 经高压灭菌的 ddH2O 或无核酸酶的 ddH2O 洗脱 DNA。

14. 变性、引物退火和引物延伸

  1. ChIP 洗脱和逆转交联后，将 13.3 步骤中提取的 DNA 样品 16 µL 转移至 PCR 管中。
  2. 在冰上配制变性与引物退火混合液（表 6 和材料表），向每个样品中加入 1.2 µL 该混合液（总反应体积：17.2 µL）。使用 表 6 中描述的程序运行样品，使引物在模板 DNA 上变性并退火。
  3. 在冰上配制引物延伸混合液（表 7 和材料表）。
  4. 当变性与引物退火程序完成后，向每个样品中加入 3 µL 引物延伸混合液（总反应体积：20.2 µL）。使用 表 7 中描述的引物延伸程序运行样品。
  5. 立即进行 dA-加尾反应。

15. dA加尾反应

注意：在使用通用接头DNA进行黏性末端DNA连接时，通过dA加尾反应将dATP添加到平末端双链DNA的3’端。

  1. 在冰上配制dA加尾反应混合液（表8和材料表）。
  2. 向每个样本中加入4.1 µL dA加尾反应混合液（总体积：24.3 µL）。使用dA加尾程序运行样本（表8）。
  3. 立即进行通用接头连接反应。

16. 通用接头连接

注意：通用接头包含用于DNA样本识别的高通量测序特异性序列，以用于测序化学反应。通用接头的DNA序列见表1。

  1. 完成dA加尾反应后，配制通用接头连接反应体系（表9和材料表），用于通用接头连接。
  2. 向每个样本中加入21.5 µL反应液（总反应体积：45.8 µL），在20 °C孵育15分钟。

17. DNA 纯化

  1. 使用磁珠纯化 DNA（材料表）。用 21 µL 经高压灭菌的 ddH2O 或无核酸酶的 ddH2O 洗脱 DNA。
  2. 将样品储存于 -20 °C，直至进行连接介导的 PCR（LM-PCR）及 PCR 纯化。

18. 连接介导的 PCR

注意：LM-PCR 引物序列见表1。

  1. DNA 纯化后，在冰上配制 LM-PCR 反应液（表 10 和材料表）。
  2. 向每个样本中加入 29 µL LM-PCR 反应液（总反应体积：50 µL），并使用 LM-PCR 程序（表 10）运行样本。
  3. 立即进行 PCR 扩增产物的凝胶纯化，随后进行高通量测序所需的 DNA 纯化。

19. LM-PCR 扩增 DNA 的 DNA 纯化

  1. 将LM-PCR扩增的DNA样本与DNA分子量标记物一同在1.5%琼脂糖凝胶中以120−180 V电压电泳，并切取200–400 bp的条带。
  2. 使用凝胶回收试剂盒（材料表）从切下的凝胶中纯化DNA。
  3. DNA纯化后，检测每个ChIP-exo文库样本的浓度（材料表），并将样本送交进行高通量单端测序。
    注意：单端测序的推荐读长至少为35 bp，该长度足以将测序读段唯一比对至小鼠或人类细胞的参考基因组。对于小鼠或人类细胞中的大多数转录因子，每个ChIP-exo样本获得10−20百万条读段即可充分鉴定其基因组结合位点。若需绘制哺乳动物细胞中组蛋白修饰富集的基因组区域，则每个样本至少需要30百万条读段。

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结果

图2A展示了从小鼠胚胎干细胞分化而来的运动神经元细胞在裂解及不同超声循环处理后的超声结果。最佳超声循环次数（例如，图2A中的12个循环）可在100−400 bp的DNA片段中产生较强的DNA条带强度。高质量的ChIP-exo文库依赖于染色质DNA片段的大小和产量。因此，在开展ChIP-exo实验前，建议针对每种细胞类型及每批细胞优化超声条件。

图2B 显示了通过18−21个PCR循环扩增的ChIP-exo DNA样本的连接介导PCR（LM-PCR）产物。LM-PCR可扩增与DNA接头连接的ChIP-exo DNA片段，用于下一代测序。PCR引物是DNA接头序列的一部分。超声处理后的DNA片段大小约为100−400 bp（图2A）。经λ外切核酸酶消化后，DNA片段大小约为起始材料的一半（50−200 bp）。约125 bp的DNA接头被连接到ChI...

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讨论

在本实验方案中，采用染色质免疫沉淀（ChIP）后接核酸外切酶消化的方法，以获得用于在超高定位分辨率下鉴定哺乳动物细胞中蛋白质-DNA相互作用的DNA文库。多个变量会影响ChIP-exo实验的质量。关键实验参数包括抗体的质量、超声破碎条件的优化以及LM-PCR循环次数。这些关键实验参数同样也是限制ChIP-exo实验效果的主要因素，将在下文中详细讨论。 如下所述。

在任何ChIP实验方案中，抗体质量都是最重要的考虑因素之一。建议在ChIP-exo实验中使用经过ChIP验证的抗体。在开展ChIP-exo实验前，可预先检测抗体质量。可通过ChIP-seq或ChIP-qPCR验证抗体是否适用于ChIP实验，方法是确认目标蛋白在DNA上的特异性结合位点。随后，优化添加至磁珠的抗体浓度，以确保蛋白-DNA复合物能够被有效免疫沉淀22,23。

染色质超声处理是ChIP-exo实验方案中的另一个关键步骤。超声处理对于...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Rhee实验室成员分享未发表的数据和进行富有价值的讨论。本工作得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）基金RGPIN-2018-06404（H.R.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖，超纯级Invitrogen16500染色质超声检测（第4.3.6节）和LM-PCR扩增DNA的凝胶纯化（第19.1节）
牛血清白蛋白（BSA），无蛋白酶，热激分离，纯度≥98%BioShopALB003封闭溶液
抗Isl1抗体DSHB39.3F7抗体与磁珠孵育（第5.6节）
Bioruptor Pico DiagenodeB01060010染色质超声处理（第3.3节）
牛血清白蛋白（BSA），分子生物学级New England BioLabsB9000S磁珠上的填平反应（第10.2节）以及变性、引物退火和引物延伸（第14.2节）
Centrifuge 5424 REppendorf5404000138染色质超声处理（第3.5节），超声效果检测（第4.3.1、4.3.3和4.3.4节）
Centrifuge 5804 REppendorf22623508细胞收集、交联与冷冻（第1.3节），细胞裂解（第2.2和2.3节），染色质超声处理（第3.1节）
cOmplete Mini 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物Roche4693159001添加至所有缓冲液中，蛋白酶K缓冲液和ChIP洗脱缓冲液除外
dATP溶液New England BioLabsN0440SdA加尾反应（第15.1节）
脱氧胆酸钠盐fisher scientificBP349裂解缓冲液3、高盐洗涤缓冲液和LiCl洗涤缓冲液
dNTP混合物，分子生物学级Thermo ScientificR0192磁珠上的填平反应（第10.2节）以及变性、引物退火和引物延伸（第14.2节）
DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x Thermo ScientificK1081连接介导PCR（第18.1节）
EDTA，0.5 M，无菌溶液，pH 8.0BioShopEDT111裂解缓冲液1-3、超声效果检测（第4.1节）、高盐洗涤缓冲液、LiCl洗涤缓冲液和ChIP洗脱缓冲液
无水乙醇，100%Commercial alcoholsP006EAAN超声效果检测（第4.3.3节）
甲醛，36.5-38%，含10-15%甲醇SigmaF8775细胞收集、交联与冷冻（第1.1节）
甘油，试剂级，纯度≥99.5%BioShopGLY002裂解缓冲液1
甘氨酸，生物技术级，纯度≥99%BioShopGLN001细胞收集、交联与冷冻（第1.2节）
糖原，RNA级Thermo ScientificR0551超声效果检测（第4.3.3节）
HEPES，1 M无菌过滤溶液，pH 7.3 BioShopHEP003裂解缓冲液1、高盐洗涤缓冲液
Klenow片段（3->5外切酶缺陷型）New England BioLabsM0212SdA加尾反应（第15.1节）
λ外切酶New England BioLabsM0262S磁珠上的λ外切酶消化（第11.2节）
连接酶增强剂New England BioLabsE7645SNEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒：磁珠上接头连接（第9.1节）和通用接头连接（第16.1节）
连接酶主混合液New England BioLabsE7645SNEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒：磁珠上接头连接（第9.1节）和通用接头连接（第16.1节）
氯化锂（LiCl），试剂级BioshopLIT704LiCl洗涤缓冲液
用于ChIP的磁珠（Dynabeads Protein G）Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP)Dynabeads Protein G (magnetic beads for ChIP)抗体与磁珠孵育（第5节）
用于DNA纯化的磁珠（AMPure XP Beads）Beckman CoulterA63880DNA提取（第13.3节）和DNA纯化（第17.1节）
磁力架（DynaMag-2 Magnet）Invitrogen12321D用于第5–11节和第13节中的多个步骤
MinElute凝胶回收试剂盒Qiagen 28604PCR扩增DNA的凝胶纯化（第19.2节）
N-月桂酰肌氨酸钠盐溶液，30%水溶液，≥97.0%（HPLC）Sigma61747裂解缓冲液3
辛基苯基聚氧乙烯醚（IGEPAL CA630）BioShopNON999裂解缓冲液1和LiCl洗涤缓冲液
苯酚:氯仿:异戊醇，生物技术级（25:24:1）BioShopPHE512超声效果检测（第4.3.1节）
phi29 DNA聚合酶New England BioLabsM0269L磁珠上的填平反应（第10.2节）以及变性、引物退火和引物延伸（第14.3和14.4节）
磷酸盐缓冲液（PBS），1x Corning21040CV细胞收集、交联与冷冻（第1.3节）、染色质超声处理（第3.1节）、抗体与磁珠孵育（第5.1节）
PowerPac Basic电源BioRad1645050超声效果检测（第4.3.6节）和LM-PCR扩增DNA的凝胶纯化（第19.1节）
ProFlex PCR系统Applied BiosystemsProFlex PCR System用于第14.2、14.4、15.2、16.2和18.2节
Protein LoBind管，2.0 mL Eppendorf22431102抗体与磁珠孵育（第5.2节）和染色质免疫沉淀（第6.3节）
蛋白酶K溶液，RNA级Invitrogen25530049超声效果检测（第4.2节）和洗脱及逆转交联（第12.3节）
Qubit 4.0荧光计InvitrogenQ33226PCR扩增DNA的凝胶纯化（第19.3节）
Qubit dsDNA BR检测试剂盒InvitrogenQ32853PCR扩增DNA的凝胶纯化（第19.3节）
RNase A，无DNase和蛋白酶Thermo ScientificEN0531超声效果检测（第4.3.2节）和DNA提取（第13.2节）
氯化钠（NaCl），BioReagent级 SigmaS5886裂解缓冲液1-3、高盐洗涤缓冲液
十二烷基硫酸钠（SDS），电泳级BioShopSDS001超声效果检测（第4.1节）、高盐洗涤缓冲液和ChIP洗脱缓冲液
超声破碎珠和15 mL Bioruptor管DiagenodeC01020031染色质超声处理（第3.1和3.2节）
ThermoMixer F1.5 Eppendorf5384000020第4.2、4.3.2、4.3.5、8.2、9.2、10.3、11.2、12.2、12.3、13.2和16.2节
Trizma盐酸溶液（Tris-HCl），BioPerformance认证，1 M，pH 7.4SigmaT219410 mM Tris-HCl缓冲液
Trizma盐酸溶液（Tris-HCl），BioPerformance认证，1 M，pH 8.0SigmaT2694裂解缓冲液2、裂解缓冲液3、超声效果检测（第4.1节）、LiCl洗涤缓冲液和ChIP洗脱缓冲液
Ultra II末端修复/dA加尾模块（24次反应 -> 120次反应）New England BioLabsE7546S末端修复反应混合液和末端修复酶混合液：磁珠上的末端修复和dA加尾反应（第8.2节）
VWR迷你管式摇床，可调速VWR10159-752用于第1、2、5、6和7节中的多个步骤
2-[4-(2,4,4-三甲基戊烷-2-基)苯氧基]乙醇，Triton X-100，试剂级BioShopTRX506裂解缓冲液1、染色质超声处理（第3.4节）和高盐洗涤缓冲液

参考文献

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小鼠干细胞λ外切酶Islet-1抗体磁珠下一代测序转录因子结合
利用染色质免疫沉淀-外切酶技术（ChIP-Exo）在小鼠干细胞来源的神经元中进行蛋白质-DNA相互作用的高分辨率作图
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