骨骼肌成纤维细胞外泌体的分离与表征

摘要

本方案阐述了以下两个方面：1）从小鼠成年腓肠肌中分离和培养原代成纤维细胞；以及 2）采用差速超速离心结合蔗糖密度梯度法纯化外泌体，并通过蛋白质印迹分析对外泌体进行表征。

摘要

外泌体是由几乎所有细胞释放并分泌到各种生物体液中的小型细胞外囊泡。目前已开发出多种分离这些囊泡的方法，包括超速离心法、超滤法和尺寸排阻色谱法。然而，并非所有方法都适用于大规模外泌体的纯化与表征。本文所述方案旨在建立从小鼠成年骨骼肌组织中分离的原代成纤维细胞培养体系，随后从这些细胞的培养上清中纯化并表征外泌体。该方法基于连续离心步骤结合蔗糖密度梯度分离。通过使用一系列经典标志物（如 Alix、CD9 和 CD81）进行蛋白质印迹分析，验证所获得外泌体组分的纯度。本方案详细描述了如何分离和浓缩具有生物活性的外泌体，以用于透射电子显微镜观察、质谱分析以及功能研究中的细胞摄取实验。该方法易于放大或缩小规模，并可针对不同细胞类型、组织及生物体液中的外泌体分离进行优化调整。

引言

外泌体是一类大小在30–150 nm之间的异质性细胞外囊泡。由于其在组织和器官中广泛分布，外泌体已被确认为生理和病理过程中的关键参与者^1,2。外泌体携带复杂的蛋白质、脂质、DNA类型和RNA类型，其内容物因来源细胞类型的不同而有所差异^1,2,3。外泌体富含具有不同功能的蛋白质，例如四跨膜蛋白（如CD9和CD63）参与膜融合事件；热休克蛋白HSP70和HSP90参与抗原结合与呈递。此外，Alix、Tsg101和flotillin参与外泌体的生物合成与释放过程，被广泛用作这些纳米囊泡的标志物^2,3,4。

外泌体还含有多种RNA（例如microRNA、长链非编码RNA、核糖体RNA），这些RNA可转移至受体细胞，并影响下游信号传导³。由于外泌体被单层膜结构包裹，其生物活性不仅取决于蛋白质和核酸的内含物，还依赖于限界膜的脂质成分¹。外泌体膜富含磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、胆固醇、鞘磷脂、花生四烯酸以及其他脂肪酸，这些成分均可影响外泌体的稳定性和膜拓扑结构^2,3。由于其内含物和脂质排列特性，外泌体可在受体细胞中启动信号通路，并参与维持正常组织生理功能^1,2,4,5。在某些病理条件下（例如神经退行性疾病、纤维化和癌症），外泌体已被证实可触发并传播病理刺激信号^{4,6,7,8,9,10,11}。

由于外泌体能够向邻近或远端位点传递信号，它们已成为疾病诊断或预后评估的重要生物标志物。此外，外泌体在实验中已被用作治疗化合物的载体^2,12。这些纳米囊泡在临床中的潜在应用使得其分离方法日益重要，以实现最高的得率、纯度和可重复性。目前已有多种外泌体分离技术被开发并应用。通常，外泌体可通过差速离心法、尺寸排阻色谱法以及免疫捕获法（使用 commercially available kits）从细胞培养上清或体液中分离获得。每种方法均有其独特的优缺点，已有文献对此进行了讨论^1,2,13,14。

本方案重点介绍：1）从成年小鼠腓肠肌中分离和培养原代成纤维细胞；2）纯化并表征这些细胞释放到培养基中的外泌体。目前尚缺乏用于功能研究的原代成纤维细胞外泌体分离的标准方案。原代成纤维细胞分泌的外泌体量较少，使得其分离与纯化过程具有挑战性。本方案描述了如何从大体积培养液中纯化出大量高纯度外泌体，同时保持其形态完整性和功能活性。从条件培养基中纯化的外泌体已成功应用于体外摄取实验，以在受体细胞中激活特定信号通路。此外，这些外泌体也被用于多个生物学样本间外泌体携带物的比较蛋白质组学分析⁴。

方案

所有小鼠实验均按照圣裘德儿童研究医院机构动物护理和使用委员会批准的动物实验方案以及美国国立卫生研究院指南进行。

1. 溶液与培养基的制备

1. 通过将 15.4 mL PBS 与 2.5 mL 20 mg/mL 胶原酶 P（终浓度 5 mg/mL）、2 mL 11 U/mL 分散酶 II（终浓度 1.2 U/mL）以及 100 µL 1.0 M CaCl₂（终浓度 5 mM）混合，制备消化液。
2. 通过将 440 mL DMEM 与 50 mL FBS（10%）、5.0 mL 青霉素-链霉素溶液（终浓度分别为 100 U/mL 和 100 µg/mL）以及 5.0 mL 谷氨酰胺补充剂（终浓度 2 mM）混合，制备 500 mL 原代成纤维细胞培养基（完全 DMEM）。使用孔径为 0.22 µm 的真空滤器过滤灭菌。
3. 将 FBS 置于 38.5 mL 聚丙烯管中，在 4 °C 条件下以 100,000 × g 超速离心过夜，制备无外泌体血清，并将上清液转移至新管中。
4. 通过将 440 mL DMEM 与 50 mL 无外泌体血清（10%）、5 mL 青霉素-链霉素溶液（终浓度分别为 100 U/mL 和 100 µg/mL）以及 5 mL 谷氨酰胺补充剂（终浓度 2 mM）混合，制备 500 mL 无外泌体培养基。使用孔径为 0.22 µm 的真空滤器过滤灭菌。
5. 将 6.057 g Tris 碱溶解于 90 mL dH₂O 中，用 HCl 调节 pH 至 7.4，再用 dH₂O 定容至 100 mL，制备 0.5 M Tris-HCl（pH 7.4）溶液。
6. 将 97.9 mL dH₂O 与 2 mL 0.5 M Tris-HCl（pH = 7.4）以及 100 µL 1 M Mg(Ac)₂ 混合，制备 10 mM Tris-HCl（pH 7.4）/1 mM Mg(Ac)₂ 溶液（蔗糖工作液）。使用前立即加入蛋白酶抑制剂，并将溶液置于冰上保存。
7. 根据表 1在冰上配制蔗糖密度梯度溶液。这些溶液足以制备两根蔗糖梯度管。
8. 向 100 g 三氯乙酸（TCA）粉末中加入 40 mL dH₂O，搅拌至完全溶解，再用 dH₂O 定容至 100 mL，制备 100% TCA 溶液。
9. 将 20 mL dH₂O 与 80 mL 100% 乙醇混合，制备 80% 乙醇溶液。
10. 将 1.8 L dH₂O 与 200 mL 10x 电泳缓冲液混合，制备 Western 印迹电泳缓冲液。
11. 将 1.4 L dH₂O 与 200 mL 10x 转膜缓冲液以及 400 mL 甲醇混合，制备 Western 印迹转膜缓冲液。使用前将转膜缓冲液预冷至 4 °C。
12. 将 122 g Tris 碱和 180 g 氯化钠溶解于 850 mL dH₂O 中（pH 8.0），再用 dH₂O 定容至 1 L，制备 20x Tris 缓冲盐水（TBS）。
13. 将 5 g 脱脂奶粉、1 mL 10% Tween-20、5 mL 20x TBS 和 94 mL dH₂O 混合，制备封闭缓冲液。
14. 将 3 g BSA、1 mL 10% Tween-20、5 mL 20x TBS 和 94 mL dH₂O 混合，制备抗体稀释缓冲液。
15. 将 100 mL 20x TBS 与 20 mL 10% Tween-20（10x）以及 1.88 L dH₂O 混合，制备洗涤缓冲液。
16. 将 1 体积的鲁米诺/增强剂与 1 体积的稳定过氧化物缓冲液混合，制备显色液。

2. 小鼠腓肠肌（GA）的解剖^15,16

1. 准备含有10 mL PBS的50 mL离心管，并置于冰上。
2. 将小鼠放入CO₂麻醉室中实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
3. 取下双侧后肢的腓肠肌，并转移至装有PBS并置于冰上的离心管中。
   注意：在将腓肠肌转移至PBS前，需先去除附着于腓肠肌上的比目鱼肌。

3. 小鼠原代成纤维细胞的分离与培养

1. 称取肌肉组织，置于生物安全柜中的10 cm培养皿内。用手术刀将肌肉切碎，直至形成细小的糊状物。
2. 将切碎的肌肉糊状物转移至50 mL离心管中，按每毫克组织加入3.5倍体积的消化液，于37 °C孵育45分钟。每隔10分钟用5 mL移液器充分混匀悬浮液（有助于组织完全解离）。
   注意：也可使用组织解离仪完成此步骤。
3. 向细胞悬液中加入20 mL完全DMEM培养基以终止消化反应。将混合液转移至置于50 mL离心管上的70 µm尼龙细胞筛网中。收集滤过液，并用额外5 mL完全DMEM培养基冲洗细胞筛网。
4. 在室温（RT）下以300 × g离心10分钟，小心弃去上清液。
5. 将沉淀物重悬于10 mL完全DMEM培养基中，接种至10 cm培养皿中。
6. 将细胞置于37 °C、5% CO₂、3% O₂条件下培养（第0代或P0）。
   注意：1）此类培养需维持在低氧环境中，以模拟生理条件（骨骼肌内O₂水平约为2.5%）¹⁷。2）细胞培养的传代次数（如P0）是指该培养物被继代培养的次数。3）P0代原代成纤维细胞通常培养至100%汇合后再继续培养1天（仅适用于P0代），以清除其他类型的细胞，确保培养体系中仅存成纤维细胞，并通过显微镜观察确认肌源性细胞已被清除。2月龄成年动物的骨骼肌中约含有2%的肌源性前体细胞⁴。此外，肌源性前体细胞通常无法贴附于未包被的培养皿表面，因此在继代过程中会丢失^18,19,20。肌源性细胞需要使用不同的培养基（F10），并补充20%胎牛血清（FBS）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）¹⁸。在完全DMEM培养基中，成纤维细胞的增殖速率高于肌源性细胞，从而在首次传代前即可消除这些污染细胞。
7. 当P0代细胞达到100%汇合并继续培养1天后，用PBS洗涤一次。加入1 mL胰酶消化液，于37 °C、5% CO₂、3% O₂条件下孵育以使细胞脱落。加入10 mL完全DMEM培养基以终止酶活性。
8. 在室温下以300 × g离心10分钟，将沉淀重悬于20 mL完全DMEM培养基中，接种至15 cm培养皿中（第1代或P1）。细胞培养至80%–90%汇合度，可进一步扩增至第3代。
   注意：根据后续实验需求，可选用第1代、第2代（P2）或第3代（P3）细胞。

4. 细胞接种与条件培养基的收集

1. 用 10 mL PBS 清洗成纤维细胞（P1、P2 或 P3），加入 2.5 mL 消化液，于 37 °C、5% CO₂、3% O₂ 条件下孵育。加入 10 mL 完全 DMEM 培养基以终止酶活性。
   注意：原代细胞在第 4 代之后应弃用，不可用于后续实验，因其特性会发生改变。
2. 收集细胞，在室温下以 300 x g 离心 10 分钟。
3. 将细胞沉淀重悬于 10 mL 无外泌体培养基中，并进行细胞计数。
4. 以每皿（15 cm）1.5–2.0 × 10⁶ 个细胞的密度接种细胞，并于 37 °C、5% CO₂、3% O₂ 条件下孵育。
5. 在 16–24 小时内将条件培养基收集至预冷的 50 mL 离心管中，置于冰上。
   注意：若细胞未达到 80% 汇合度，可再次加入新鲜的无外泌体培养基，并在额外培养 16–24 小时后收集。两次收集的培养基可合并用于后续处理。

5. 使用差速离心和超速离心法纯化外泌体

注意：所有步骤均在 4 °C 或冰上进行。必要时，使用装有水的离心管配平。

1. 将条件培养基在 300 x g 下离心 10 分钟，以去除活细胞，然后将上清液转移至新的 50 mL 离心管中。
2. 在 2,000 x g 下离心 10 分钟以去除死细胞，并将上清液转移至 38.5 mL 聚丙烯管中。
3. 在 10,000 x g 下离心上清液 30 分钟，以去除细胞器、凋亡小体和膜碎片。将上清液转移至 38.5 mL 超净管中。
4. 在 100,000 x g 下超速离心上清液 1.5 小时，使外泌体沉淀。
5. 小心弃去上清液，保留约 1 mL 条件培养基，并用总共 30 mL 冰冷的 PBS 洗涤外泌体沉淀。
6. 在 100,000 x g 下离心 1.5 小时，然后用移液器小心吸弃上清液，注意不要扰动外泌体沉淀。
7. 将沉淀重悬于冰冷的 PBS 中（每 15 cm 培养皿约 25 μL），并使用 BCA 蛋白检测试剂盒和酶标仪在 562 nm 处测定蛋白浓度。
   注：蛋白浓度测定采用含 0.1% Triton-X100 的 dH₂O 对样品进行 1:2 稀释。从汇合度为 80% 的原代成纤维细胞（15 cm 培养皿，20 mL 条件培养基）中获得的外泌体产量约为 3–4 μg。

6. 通过蔗糖密度梯度对细胞外囊泡进行表征

1. 使用移液器从底部向上依次加入以下溶液，将蔗糖梯度液装入13 mL超清离心管中：1.5 mL 2.0 M、2.5 mL 1.3 M、2.5 mL 1.16 M、2.0 mL 0.8 M和2.0 mL 0.5 M蔗糖溶液。
2. 将30–100 µg外泌体与0.25 M蔗糖溶液混合，并用溶液调节体积至1 mL。
3. 小心地将外泌体加至梯度液上方，于4 °C条件下以100,000 x g超速离心2.5小时。
4. 从超速离心机中取出离心管，置于冰上，从梯度液顶部开始收集1.0 mL的组分，转移至预冷的1.7 mL离心管中，置于冰上。
5. 向每管中加入110 µL 100%三氯乙酸（TCA），充分混匀，在室温下孵育10分钟。
6. 在室温下以10,000 x g离心10分钟，小心弃去上清液。
7. 将沉淀物重悬于500 µL预冷的80%乙醇中，在-20 °C下洗涤10分钟。
8. 在4 °C下以10,000 x g离心10分钟，弃去上清液。
9. 在室温下干燥沉淀10–15分钟，然后将沉淀重悬于PBS中用于体外实验。使用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度；或直接将沉淀重悬于14.5 µL dH₂O、5 µL 4x Laemmli缓冲液和0.5 µL 1 M DTT中，用于Western blot分析。

7. 通过蛋白质印迹分析检测外泌体

1. 取步骤 5.7 中获得的 5–10 µg 外泌体，加入 5 µL 4x Laemmli 缓冲液和 0.5 µL 1 M DTT，再用 dH₂O 调整体积至 20 µL。将所有样品（包括步骤 6.9 中的样品）在 98 °C 加热 5 分钟。
2. 将样品上样至 10% TGX 免染胶，并根据制造商推荐上样蛋白 Marker。
   注意：应根据目标蛋白的分子量选择合适浓度的凝胶。
3. 在电泳缓冲液中以 100 V 电泳约 1 小时，直至上样染料迁移至凝胶底部。
   注意：电泳时间可能因所用设备或凝胶类型及浓度不同而有所变化。
4. 对凝胶成像。免染胶的图像将作为免疫印迹实验中的上样量对照。
5. 使用 PVDF 膜在 4 °C 条件下以 80 V 转膜 1.5 小时，或以 30 V 过夜转膜。
6. 在封闭缓冲液中室温封闭膜 1 小时。
7. 将膜在抗体缓冲液中与特异性抗体（表 2）于 4 °C 摇动孵育过夜。
8. 用洗涤缓冲液洗涤膜后，加入相应的二抗（表 2），室温摇动孵育 1 小时。
9. 用洗涤缓冲液再次洗涤膜，然后使用显影液和基于相机的成像系统对膜进行成像。也可选用 X 射线胶片进行显影。

结果

本方案适用于以经济高效的方式从大量条件培养基中纯化外泌体。该方法具有高度的可重复性和一致性。图1展示了从小鼠原代成纤维细胞培养基中纯化的外泌体的透射电子显微镜（TEM）图像。图2展示了典型外泌体标志物的蛋白表达模式，以及胞质蛋白（LDH）和内质网蛋白（calnexin）污染物的缺失情况。图3展示了外泌体典型标志物（Alix、CD9 和 CD81）在蔗糖密度梯度离心后的分布情况。

图1：从小鼠原代成纤维细胞培养基中分离的外泌...

讨论

根据本方案所述，成功从培养基中分离外泌体的关键步骤之一是从成年小鼠骨骼肌中正确建立并维持原代小鼠成纤维细胞培养。为了确保类似生理条件（骨骼肌中的 O₂ 水平约为 2.5%），这些培养物需在低氧环境中维持¹⁵。原代成纤维细胞在体外传代次数过多时会发生特性改变，因此，为获得理想的外泌体产量，必须使用低代次细胞。纯化后的外泌体应立即用于实验，或分装后于 -80 °C 冷冻保存，待需要时使用。本方案中的另一个重要步骤是每次均需新鲜配制蔗糖溶液。该方法的一个局限性在于耗时较长，因为原代成纤维细胞通常不像其他分泌细胞那样大量分泌外泌体，因此需要使用大规模培养体系，从而产生大量待处理的条件培养基。

此处使用的差速离心法的优点在于其具有可扩展性（可扩展至升量级），是分离原代成纤维细胞外泌体的首选方法。对于较大体积（每柱最多100 mL）的样本，另一种替代方法是尺寸排阻色谱法（SEC）。该方法速度快，能够将蛋白质与外泌体分离。然而，该色谱柱不会形成外泌体沉淀，因此需要进一步的浓缩或离心步骤。SEC方法的一个缺点是色谱柱可能随时间推...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cm 培养皿	中西部科学公司，TPP	TP93100
15 cm 培养皿	Midwest Scientific	TP93150
BCA 蛋白测定试剂盒	赛默飞世尔科技，Pierce	23225
牛血清白蛋白第五组分	罗氏	10735094001
CaCl2	Sigma	C1016-100G
Centrifuge 5430R 配转子 FA-35-6-30 / FA-45-48-11	Eppendorf	022620659/5427754008
Chemidoc MP 成像系统	伯乐（BioRad）	12003154
胶原酶P	Sigma，Roche	11 213 857 001	100 mg
cOmplete 蛋白酶抑制剂混合物	默克/西格玛，罗氏	11697498001
带板状电极的 Criterion 印迹仪	伯乐（BioRad）	1704070
Criterion TGX 免染蛋白凝胶	BioRad	5678034	10% 18孔中型凝胶
Criterion 垂直电泳槽（中号）	伯乐（BioRad）	NC0165100
Dispase II	Sigma，Roche	04 942 078 001	中性蛋白酶，II 型
二硫苏糖醇	Sigma/Millipore，罗氏	10708984001
杜尔贝科’s 修改型伊格尔培养基	康宁	15-013-CV
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液	康宁	21-031-CV
乙醇 200 proof	Greenfield Global 的 Pharmco	111000200
Falcon 50 mL 圆锥形离心管	康宁	352070
胎牛血清	Gibco	10437-028
Fluostar Omega 多功能微孔板读板仪	BMG Labtech
GlutaMAX 补充剂	赛默飞世尔科技，Gibco	35050-061
盐酸	Fisher Scientific	A144S-500
Immobilon-P 转印膜	默克密理博	IPVH00010
Laemmli上样缓冲液（4x）	伯乐（BioRad）	1610747
乙酸镁溶液	Sigma	63052-100ml
脱脂奶粉	LabScientific	M-0842
O2/CO2 培养箱	Sanyo	MC0-18M
青霉素-链霉素	赛默飞世尔科技，吉比科	15140-122	10,000 U/ml
优质微量离心管	Fisher Scientific，Midwest Scientific	AVSC1510	1.7 mL
受保护的一次性手术刀	Fisher Scientific，Aspen Surgical Bard-Parker	372610
运行缓冲液	伯乐（BioRad）	1610732
氯化钠	Fisher Scientific，Fisher Chemical	S271-3
Stericup Quick release-GP 无菌真空过滤系统	Millipore	S2GPU05RE	500 mL
无菌细胞筛（70 mm）	Fisher Scientific，Fisher 品牌	22-363-548
蔗糖	Fisher Scientific，Fisher Chemical	S5-500
SuperSignal West Femto	赛默飞世尔科技	34096
薄壁聚丙烯管	贝克曼库尔特	326823
转移缓冲液	BioRad	16110734
三氯乙酸	Sigma	91228-100G
Tris 碱	BioRad	1610719
Triton-X100 溶液	Sigma	93443-100mL
TrypLE Express 酶	赛默飞世尔科技，Gibco	12604-013	无酚红
Tween-20	BioRad	#1610781
超速离心机 Optima XPM	贝克曼库尔特	A99842
超透明管（14×89 mm）	贝克曼库尔特	344059
超透明离心管（25×89 mm）	贝克曼库尔特	344058
水浴锅 Isotemp 220	Fisher Scientific	FS220