目前用于构建可长期植入小型啮齿类动物的外周神经袖状电极的方法通常需要专用设备和/或经过高度培训的专业人员。在本方案中，我们展示了一种简单且低成本的可长期植入袖状电极的制备方法，并验证了其在大鼠迷走神经刺激（VNS）中的有效性。
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摘要
摘要
外周神经袖状电极长期以来被用于神经科学及相关领域，以刺激迷走神经或坐骨神经等。近年来多项研究证明，慢性迷走神经刺激（VNS）可有效增强中枢神经系统可塑性，从而改善运动康复、消退学习和感觉分辨能力。由于大鼠体型较小，构建适用于此类研究的慢性植入式装置具有挑战性，典型方案需要操作人员经过 extensive 培训，并采用耗时的微加工方法。此外，也可购买商业化的可植入袖状电极，但成本显著更高。在本方案中，我们介绍一种简单、低成本的方法，用于制备适用于大鼠的小型慢性可植入外周神经袖状电极。我们通过在氯胺酮/赛拉嗪麻醉的大鼠中实施迷走神经刺激，验证了所制电极的短期和长期可靠性：结果显示，无论是在植入时还是植入后长达10周，刺激均引起呼吸频率下降，符合赫林-布雷尔反射激活的表现。此外，我们进一步通过将迷走神经刺激与熟练杠杆按压行为相结合以诱导运动皮层图谱可塑性，证明了该袖状电极适用于慢性刺激研究。
引言
近年来，随着越来越多的研究证明了这种技术在治疗多种炎症性疾病方面的临床前应用价值，对可长期植入的袖状电极用于外周神经刺激的需求不断增长1,2,3 和神经系统疾病4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15例如，慢性迷走神经刺激（VNS）已被证明可在多种学习情境中增强新皮层可塑性，从而改善运动功能康复4,5,6,7,8，消退学习10,11,12,13,14，以及感觉辨别15市面上可购得的外周神经袖状电极通常存在订单交付周期较长且成本较高的问题，这可能限制其可及性。相比之下，用于“自行制备”可长期植入袖状电极的实验方案仍较为有限，而由于啮齿类动物体型较小，其解剖结构带来了特殊挑战。目前用于构建适用于长期啮齿类实验的袖状电极的方案，通常需要使用复杂设备与技术，并依赖经过 extensive 培训的专业人员。在本方案中，我们展示了一种简化的袖状电极制备方法，该方法基于先前已发表且被广泛使用的技术16,17我们通过以下方式验证了大鼠慢性植入电极的功能：在将套管电极植入左侧颈迷走神经时，施加于电极的刺激成功引起呼吸停止及SpO2下降。已知刺激肺受体迷走神经的传入纤维可激活赫林-布劳尔反射，该反射通过抑制脑干中多个呼吸核团，从而抑制吸气。18因此，与赫林-布雷尔反射一致的呼吸停止以及随之而来的血氧饱和度（SpO2）下降，可为麻醉大鼠中电极植入位置的准确性和套管功能提供一种简便的检测方法。为验证长期植入的套管电极的长期功能，分别在植入时及同一动物植入后六周时测量反射反应，并进行比较。另一组大鼠在完成杠杆按压任务的行为训练后植入迷走神经刺激（VNS）套管电极。在这些大鼠中，迷走神经刺激与正确任务表现配对可引起皮层运动图的重组，这与先前已发表的研究结果一致。19,20,21,22在植入设备后5至10周进行麻醉状态下的运动皮层定位时，我们通过确认迷走神经刺激（VNS）成功诱发呼吸停止及血氧饱和度（SpO₂）下降超过5%，进一步验证了VNS动物模型中袖带的功能。2.
Childs 等人17 和 Rios 等人16 最近发表的实验方案为简化型袖状电极制备方法提供了一个经过充分验证的起点，因为这一广受欢迎的方法已被多个开展啮齿类动物慢性迷走神经刺激（VNS）研究的实验室所采用1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11。原始方法涉及多个高精度操作步骤，用于处理细小的微丝，导致袖状电极的制备耗时超过一小时，且需要大量训练才能稳定完成。本文所述的简化方法所需材料和工具显著减少，且经过基本培训的人员可在一小时之内完成整个制备过程。
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方案
本方案中描述的所有操作均遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》进行，并已获得德克萨斯大学达拉斯分校机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 刺激袖状电极的制备
- 准备套管导管。
- 使用剃刀刀片切割一段长度为 2.5 mm 的聚合物导管。将镊子尖端或回形针插入导管中，并用刀片沿套管一侧管壁纵向切开一条切口。
- 将镊子从导管中取出，然后将一根大号缝合针穿过套管中线，方向垂直于导管长轴。将针从切口（顶部）穿入，并穿过导管中心对侧（底部）。将针插入泡沫板中，以在后续组装步骤中固定套管位置。
- 放置缝线，用于在植入过程中固定套管闭合。
- 将小号缝合针从套管壁中线处穿入，位置距离一侧顶部切口约 0.5 mm。穿针方向应从内向外，以避免损坏套管导管。将一段 2 cm 长的 6/0 缝线穿过针眼，并将针拉过导管壁，使缝线穿入套管内。
- 保持缝线原位，取下针头，并沿套管中线在第一个孔下方约 0.5 mm 处再次穿刺第二个孔。将缝线穿过针眼，再将针从导管壁穿出，再次将缝线穿入套管。
- 此时缝线两端均应位于套管外侧。调整缝线长度，使上孔处留出约 1.5 cm，下孔处留出约 0.5 mm。
- 在从下孔穿出的短端缝线上涂抹少量紫外光固化胶，然后拉动较长一端的缝线，直至下端尾部几乎与导管外壁齐平。使用紫外光棒照射固化胶水，牢固固定缝线。
- 在套管另一侧重复步骤 1.2.1 至 1.2.3。
- 放置铂:铱（Pt:Ir）导线引线。
- 使用小号缝合针在套管壁上制作 4 个孔。每对孔应位于垂直中线两侧约 0.5–0.8 mm 处，且在套管两侧各有一个孔，距离顶部切口约 0.5–0.8 mm。
警告：为确保引线位置最一致且准确，应以缝线位置为引导，始终从内向外穿针制孔。 - 再次使用缝合针，此次从外向内穿过引线孔 1。将一段 7.5 cm 长的 Pt:Ir 导线约 0.5 cm 长度穿过针眼，拉动针穿过导管，使导线引线穿过套管壁。调整导线，使其在套管外侧留出约 4.5 cm（图 1A）。
- 再次从外向内穿过引线孔 1，并同时将针穿过正对引线孔 1 的引线孔 2。将 Pt:Ir 导线较短（内侧）端约 0.5 cm 长度穿过针眼，拉动针穿过导管，使导线引线穿过套管壁。
注：此时 Pt:Ir 导线两端均应位于套管外侧，并在切口边缘周围形成一个导线环，穿过引线孔 1（图 1B）。 - 重复步骤 1.3.1 至 1.3.3，将 Pt:Ir 导线穿过引线孔 3 和 4。
- 使用丁烷打火机，小心去除从引线孔 2 和引线孔 4 伸出的 Pt:Ir 导线末端 5–6 mm 长度的绝缘层。
警告：需小心将引线末端与套管其余部分隔离，避免损坏套管。使用工具夹持导线，防止受伤。 - 在套管内部调整裸露导线位置，使引线到达最终位置。操作时，轻轻拉动从孔 1 伸出的 Pt:Ir 导线末端，使裸露部分与孔 1 齐平。另一根引线同理操作，使穿过引线孔 3 和 4 的导线裸露端对齐。
- 在套管外侧引线孔 1 和 3 处的导线环上涂抹少量紫外光固化胶，使用紫外光棒照射固化，固定引线位置。
- 使用小移液器吸头将裸露的 Pt:Ir 引线压紧贴附于套管内壁。引线就位后，剪除从引线孔 2 和 4 伸出的导线末端，使其在套管外壁外侧留出约 1 mm。
- 将导线 1 mm 长的尾端平贴折叠于套管外表面，注意避免相互短路。在两个尾端上涂抹少量紫外光固化胶，仅覆盖尾端部分并进行固化，以固定引线位置并提供电绝缘。
警告：必须完全覆盖暴露在外的 Pt:Ir 表面，以实现导线绝缘，防止非靶向刺激。
- 使用小号缝合针在套管壁上制作 4 个孔。每对孔应位于垂直中线两侧约 0.5–0.8 mm 处，且在套管两侧各有一个孔，距离顶部切口约 0.5–0.8 mm。
- 使用缝线固定 Pt:Ir 引线。
- 将带有套管组件的大号针从泡沫板上取下。将一段 3 cm 长的 6/0 缝线穿过针眼，并拉动针穿过导管，使缝线从套管底部中点穿出。
- 更换为小号缝合针，完成 Pt:Ir 引线固定的缝线穿引。从同一中线孔穿针，仍采用从内向外的方式，以避免导管和导线引线变形。将缝线外侧尾端穿过针眼，拉动针穿过套管壁，在套管边缘形成一个缝线环（图 1C）。
注：使用镊子并在 显微镜下操作，确保缝线沿套管长轴方向平整贴附于导管表面。此步骤可确保引线在套管内侧保持分离，并固定于套管中线侧方位置。 - 在套管另一端外侧，将缝线两端打半结，形成第二个环。确保缝线沿套管长轴方向平整贴附于导管表面。在保持结扎紧实、平整贴附的情况下，在半结上涂抹少量紫外光固化胶并进行固化，以固定位置。
- 小心地将缝线末端尽可能贴近结处剪除。如有必要，可涂抹少量额外紫外光固化胶，将缝线短端粘牢，使其平整贴附于导管表面（图 1D）。
- 将连接器插针焊接到 Pt:Ir 引线上。
- 使用丁烷打火机，去除每根 Pt:Ir 引线末端约 3 mm 长度的绝缘层。将金质插针的杯状端（见材料表）焊接到各引线的裸露端。
- 测试组装完成装置的阻抗。
- 将金质插针连接至 LCR 表或电极阻抗检测模块的输入端，设置测试频率为 1 kHz。将套管导管（以及套管内部的 Pt:Ir 刺激触点）浸入盛有生理盐水的小烧杯中，注意保持金质引线插针和探头连接器干燥。在进行植入前，确认组装完成的套管在 1 kHz 下的阻抗低于 2 kΩ。
注：高阻抗通常表明暴露的 Pt:Ir 表面积不足，可能由绝缘层去除不充分、套管内部误涂胶水、导线断裂等因素引起。还应检查套管是否存在导线断裂或放置不当，以防长期使用中出现短路触点。
- 将金质插针连接至 LCR 表或电极阻抗检测模块的输入端，设置测试频率为 1 kHz。将套管导管（以及套管内部的 Pt:Ir 刺激触点）浸入盛有生理盐水的小烧杯中，注意保持金质引线插针和探头连接器干燥。在进行植入前，确认组装完成的套管在 1 kHz 下的阻抗低于 2 kΩ。
2. 头部固定帽的制作
注意：头帽组件的组装步骤与先前发表的方法类似（Childs 等人17），此处为方便起见进行简要总结。
- 组装头帽17
- 剪取两段细小的30 AWG线缆，一段长约13 mm，另一段长约10 mm。将两根导线两端各剥去约1.5 mm的绝缘层。将一个金针的针脚端焊接到每根导线的一端，尽量靠近焊杯。使用剪线钳剪除焊点以外多余的针脚部分。
- 将AWG导线的另一端分别焊接到4针微带连接器的两个中央焊杯上。
- 将线缆头帽引线向上弯折朝向连接器，并将金针平放在连接器表面，彼此保持平行，如图2A所示。连接较短导线的金针应位于连接较长导线的金针下方。使用指甲丙烯酸树脂、牙科水泥或紫外固化胶将头帽引线固定到位。
3. 设备使用
- 植入套管电极以进行慢性迷走神经刺激。
注意：所有外科手术均应在适当的麻醉条件下，遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》以及当地实验动物护理与使用委员会（IACUC）的批准，采用无菌或无菌技术进行。以下操作步骤旨在说明该设备的代表性用途，不代表完整的操作流程。- 将大鼠置于立体定位仪中，在顶骨和枕骨上方做矢状切口，暴露颅骨表面以植入头帽/连接器。在颅骨上小心钻四个孔，并置入珠宝商螺丝。 使用牙科丙烯酸树脂将头帽固定在颅骨和螺钉上。
- 将大鼠从立体定位仪上取下，使其右侧卧位。在颈部左侧皮肤做一垂直切口，仔细分离位于胸锁乳突肌与胸骨舌骨肌之间、肩胛舌骨肌下方的颈动脉旁左侧迷走神经。
- 将套管电极导线皮下穿通至颅骨，使用金针将导线连接至头帽。
- 将迷走神经置于套管内，并通过在套管缝合线上打双结固定装置使其闭合。植入过程中需小心操作，使用钝性非导电钩牵拉神经或抓握神经周围结缔组织，避免损伤神经。
- 通过给予设备刺激来测试植入效果（0.8 mA、30 Hz、100 µs 双相脉冲，持续10秒）。正确植入将导致呼吸停止和SpO₂下降2 5% 或更高。
- 用牙科丙烯酸树脂覆盖金针和暴露的导线，用缝线闭合伤口，并用生理盐水、酒精和聚维酮碘溶液清洁切口部位。
- 根据美国国立卫生研究院（NIH）指南和实验动物护理与使用委员会（IACUC）的批准，提供替代液体、镇痛药物及术后护理。
- 在清醒行为期间刺激迷走神经。
注意：已有研究表明，在动物执行特定运动任务时给予迷走神经刺激（VNS）可扩大与任务相关的肌肉在运动皮层地图中的表征区域。我们采用这一经过验证的实验范式，以提供设备使用的代表性示例，但其他行为范式和/或刺激参数也可能适用于不同的应用情境。大鼠在植入设备前已在此处使用的杠杆按压任务中训练至熟练水平。术后，在给予VNS之前再次确认其表现良好：大鼠每日进行两次30分钟的训练会话，每次至少完成100次成功试验。在随后5天内的10个训练会话中，VNS与正确的杠杆按压动作配对呈现。- 通过植入的头帽将大鼠连接至刺激发生器，并调整至适当的刺激参数。对于迷走神经刺激诱导的运动皮层图谱重组，将每次正确的杠杆按压与一个 单次15个双相脉冲序列，每个脉冲宽度为100 µs，幅度为800 µA，以30 Hz的频率输出。
- 在十次30分钟的训练过程中，每次检测到成功按压杠杆后立即给予一次刺激序列。在迷走神经刺激（VNS）递送期间，使用示波器监测电流刺激的准确递送。
- 验证慢性植入式套管功能。
- 在最后一次VNS配对训练后的24小时内，使用颅内微刺激（ICMS）量化运动皮层中的功能性躯体定位图19,20,21,22.
- 麻醉诱导后，在进行运动皮层ICMS定位前，再次通过施加持续10秒、频率30 Hz、电流强度0.8 mA的刺激（100 µs双相脉冲）来验证套管功能，该刺激应导致呼吸停止及SpO₂下降2 至少5%的水平，与赫林-布雷尔反射一致。
注意：根据具体应用情况，若能获得可靠的 SpO2 观察到下降幅度小于5%，或较高电流强度（最高达1.6 mA）可靠地产生至少5%的SpO₂下降时2未能观察到呼吸停止和/或 SpO₂ 可靠下降2 表明植入物失效。
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结果
根据已发表的手术方案17,19,20,21,22，将迷走神经袖状电极和头帽慢性植入大鼠体内。植入前，将袖状电极套管浸入生理盐水中，在1 kHz频率下测量电极引线间的阻抗（阻抗 = 1.2 ± 0.17 kΩ [均值 ± 标准差]；N = 9）。仅植入在生理盐水中阻抗低于2 kΩ的袖状电极；所有电极均符合该标准（排除0/9个电极）。在植入手术期间，通过检测刺激诱发的短暂呼吸停止及伴随的血氧饱和度下降（归因于赫林-布雷尔反射）对所有袖状电极进行功能验证。为诱发该反应，通过袖状电极引线施加持续10秒、频率为30 Hz、电流为0.8 mA的刺激（100 µs双相脉冲）。在9/9个植入的袖状电极中，我们观察到在10秒刺激期间由迷走神经刺激（VNS）引起的呼吸停止，同时伴随SpO2下降至少5%（SpO
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讨论
本文介绍一种简单且低成本的方法，用于组装可长期植入的刺激性袖状电极，适用于啮齿类动物，有助于推动这种新兴疗法的临床前研究。该简化方法无需特殊培训或设备，仅需少量工具和耗材，大多数研究实验室均可轻松获取，与其它方法相比，显著降低了设备制造的经济成本和人力成本16,26,27,28。在组装过程中需格外注意，避免过量使用紫外光固化胶水，同时确保缝合线和铂铱（Pt:Ir）导线具有足够的机械稳定性，以保障袖状电极的长期功能。胶水过多会增加设备植入难度，并可能在术后刺激周围组织；而胶水不足则可能导致导线随时间推移无法与神经保持良好接触，从而降低设备性能或导致失效。将去绝缘层的铂铱导线一致地放置在袖状电极腔内，对于实现低阻抗和良好设备性能也至关重要。操作时应仔细对齐去绝缘导线，使暴露导线的最大表面积位于袖状电极内部，同时确保外部无任何裸露导线。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由德克萨斯大学达拉斯分校和德克萨斯大学系统董事会资助。我们感谢Solomon Golding、Bilaal Hassan、Marghi Jani和Ching-Tzu Tseng提供的技术协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物相容性聚氨酯基聚合物导管，外径 0.080" × 内径 0.040" | Braintree Scientific | MRE080 36 FT | |
| 解剖显微镜 | AM Scopes | #SM-6T-FRL | |
| 精细锯齿剪刀，直头，22 mm 刃长 | Fine Science Tools | #14058-09 | 用于剪切铂/铱丝和缝合线 |
| 镊子，#5 Dumont 镊子，直头，11 cm，尖端尺寸 0.1 × 0.06 mm | Fine Science Tools | #11626-11 | |
| 镊子，陶瓷尖镊子，尖端尺寸 0.3 mm × 30 mm | Electron Microscopy Sciences | #78127-71 | |
| 金针，PCB 压合插座 | Mill-Max | #1001-0-15-15-30-27-04-0 | 或类似的小型针脚，用于连接套管引线与头帽 |
| 异丁烷打火机 | BIC | #LCP21-AST | 用于去除铂/铱丝的绝缘层 |
| 带锁扣微型条形连接器，4 针 | Omnetics | A24002-004 / PS1-04-SS-LT | |
| 移液器吸头，10 µL | VWR | 89079-464 | |
| 铂-铱（90/10%）丝，直径 0.001"，9 股，PTFE 绝缘 | Sigmund Cohn | 10IR9/49T | |
| 单刃手术刀片，碳钢，型号 No.9 | VWR | #55411-050 | 用于切割 MicroRenathane 导管 |
| 缝纫针，长约 4.0 cm，直径约 0.7 mm（6–7 号） | Singer | 00276 | 较小的针，用于穿铂/铱丝 |
| 缝纫针，长约 4.5 cm，直径约 0.8 mm（2–3 号） | Singer | 00276 | 较大的针，用于组装过程中固定套管以及穿缝合线 |
| 小型泡沫板 | Juvo+/Amazon | B07C9637SJ | 作为制作平台；我们的尺寸约为 2.5" × 3.5" × 1"（长 × 宽 × 高） |
| 焊锡，多芯无铅，直径 0.38 mm | Loctite/Multicore | #796037 | |
| 焊接站 | Weller | WES51 | 或类似可兼容长锥形焊嘴的电烙铁（该型号已停产） |
| 焊嘴，长锥形，0.01" / 0.4 mm | Weller | 1UNF8 | |
| 缝线，不可吸收编织丝线，6/0 号 | Fine Science Tools | #18020-60 | |
| 紫外光（405 nm）点光源 | Henkel/Loctite | #2182207 | |
| 紫外光固化胶粘剂，25 ml | Henkel/Loctite | AA 3106 | 或类似的生物相容性紫外固化胶 |
| 绕线用导线，30 AWG | Digikey | K396-ND |
参考文献
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