CENP-A 的泛素化是 CENP-A 在着丝粒上沉积的重要前提，通过细胞分裂过程中的二聚化作用遗传，并对细胞存活至关重要。本文介绍通过质谱分析鉴定EYFP标记的CENP-A蛋白（EYFP-CENP-A）泛素化的方法。
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方法文章
通过质谱分析鉴定EYFP标记的CENP-A（EYFP-CENP-A）的泛素化修饰
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本文内容
摘要
摘要
研究动粒和着丝粒的结构与动态对于理解染色体不稳定性（CIN）和癌症进展具有重要意义。着丝粒的染色体位置及其功能（即着丝粒身份）是如何被决定的，以及如何参与染色体的准确分离，是一个基本科学问题。CENP-A 被认为是着丝粒身份的非DNA指示因子（表观遗传标记），CENP-A 的泛素化对于其在着丝粒上的沉积至关重要，该过程通过细胞分裂间的二聚化作用得以遗传，并且对细胞存活不可或缺。
本文描述了通过质谱分析鉴定EYFP-CENP-A K124R突变体的泛素化修饰，结果表明由于CENP-A K124R突变蛋白上连接了EYFP标签，可能诱导了其他赖氨酸位点的泛素化。质谱分析成功鉴定了EYFP-CENP-A K124R中赖氨酸306（K306）的泛素化修饰，该位点对应于CENP-A中的赖氨酸56（K56）。本文还讨论了使用GFP/EYFP或高分子量蛋白标签作为研究蛋白质功能工具时存在的局限性。同时探讨了当前技术在检测泛素化条带、鉴定特定位点的泛素化修饰以及在活细胞或单个细胞整个细胞周期中可视化泛素化过程方面所面临的技术限制。
本文所介绍的质谱分析方法可应用于带有不同标签的人类CENP-A蛋白以及其他着丝粒-动粒蛋白。对于希望鉴定泛素化功能作用的研究人员，建议采用由多种检测/分析方法组合而成的这一系列方法。
引言
在大多数真核生物中，纺锤体微管必须与每条染色体上的一个特定区域结合，该区域称为着丝粒。动粒是由位于着丝粒处的多种蛋白质组成的复合物。研究着丝粒和动粒蛋白的运动时序以及动粒和着丝粒的结构，对于理解染色体不稳定性（CIN）和癌症进展具有重要意义。关键科学问题在于：染色体上着丝粒的位置及其功能（即着丝粒身份）是如何确定的，以及它们如何参与染色体的准确分离。在大多数物种中，着丝粒身份由一种含有特殊组蛋白样蛋白CENP-A的核小体的存在所决定。因此，人们认为CENP-A是着丝粒身份的非DNA决定因素（表观遗传标记）。阐明CENP-A如何在人类中定义着丝粒身份的机制至关重要。
Holliday连接识别蛋白（HJURP）是一种CENP-A特异性分子伴侣，可将CENP-A沉积至着丝粒核小体中1,2,3。我们先前报道过，CUL4A-RBX1-COPS8 E3连接酶对于CENP-A在赖氨酸124位点（K124）的泛素化以及着丝粒定位是必需的4。此外，我们的研究结果表明，新合成CENP-A向着丝粒的招募依赖于预先存在的泛素化CENP-A5。因此，我们提出了一种模型，认为CENP-A的泛素化状态通过细胞分裂间的二聚化作用....
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方案
1. pBabe-EYFP-CENP-A 载体的细胞培养与逆转录病毒转染
注意：EYFP-CENP-A 由 pBabe-EYFP-CENP-A 表达，其蛋白水平与内源性 CENP-A 相似。在 RPE-1 CENP-A-/- 细胞中，通过 Cre 重组酶破坏 CENP-A-/F 等位基因后，总细胞 CENP-A 蛋白即被此 EYFP-CENP-A 取代6。
- 使用 293T 包装细胞制备含有逆转录病毒的上清液。
- 第 0 天：将 293T 包装细胞接种于 6 孔培养板中（1.0 × 106 个细胞/孔）。使用含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的高糖 DMEM 培养基培养细胞。在 37 °C、5% CO2 的条件下培养 24 小时。
注意：为获得最佳结果，需通过实验确定接种时使用的细胞密度。 - 第 1 天：在接种细胞约 23 小时后准备转染反应（以接种后 24 小时作为转染的 0 小时点）。转染各表达质粒 pBabe-EYFP（B3182）、pBabe-EYFP-CENP-A WT（B3161）和 pBabe-EYFP-CENP-A K124R（B3164）（见表 1）。
- 从表 2
- 第 0 天：将 293T 包装细胞接种于 6 孔培养板中（1.0 × 106 个细胞/孔）。使用含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的高糖 DMEM 培养基培养细胞。在 37 °C、5% CO2 的条件下培养 24 小时。
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结果
EYFP-CENP-A K124突变体表现出泛素化、与HJURP相互作用，且在着丝粒定位和细胞存活方面均无缺陷。 此处引用Fachinetti等人（2017年）报道的系统6 重新构建：在携带一个被破坏和一个“floxed”等位基因的二倍体人类（RPE-1）细胞中 CENP-A 等位基因CENP-A-/F），EYFP-CENP-A 由 pBabe-EYFP 逆转录病毒载体表达。在此系统中，内源性 CENP-A 的表达来自 CENP-A-/F 等位基因可被Cre重组酶破坏6EYFP-CENP-A野生型或K124R突变体基因构建体图1A)，可在逆转录病毒整合后稳定表达，以挽救内源性CENP-A的缺失。内源性CENP-A的残余表达来自 CENP-A-/F 等位基因随后被Cre重组酶破坏。在诱导Cre重组酶7天后，未检测到内.......
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讨论
本文描述了采用质谱分析方法鉴定EYFP-CENP-A K124R突变体的泛素化修饰，结果表明EYFP标签可能导致CENP-A K124R突变蛋白在另一个赖氨酸位点发生泛素化8。在我们的研究结果中，通过质谱分析成功鉴定了EYFP-CENP-A K124R蛋白中赖氨酸306（K306）的泛素化修饰，该位点对应于CENP-A中的赖氨酸56（K56）。此处描述的质谱分析方法是一种模拟我们先前鉴定CENP-A WT-Flag中赖氨酸124（K124）泛素化位点的方法12。因此，该方法可适用于带有不同标签的人源CENP-A蛋白以及其他着丝粒-动粒蛋白。基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的质谱分析已被广泛用于鉴定多种蛋白质潜在的翻译后修饰（PTMs）。我们整合的多种实验与分析方法（包括体内泛素化实验、克隆生长实验和质谱分析）可推荐给希望研究其目标蛋白泛素化功能作用的研究人员。
然而，本方案并未涵盖在活细胞或整个细胞周期中特定单个细胞内检测泛素化条带和/或鉴定这些蛋白质位点特异性泛素化的方法。近.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
我们感谢南京大学模式动物研究所的Chao-Jun Li提供的质谱分析。感谢Yanmini Dalal、Tatsuo Fukagawa以及南京大学模式动物研究所和Greehey儿童癌症研究所的现任研究人员在讨论、实验指导和试剂方面提供的帮助。感谢Don W. Cleveland、Daniele Fachinetti、Yanmini Dalal、Minh Bui、Gustavo W. Leone、John Thompson、Lawrence S. Kirschner、Amruta Ashtekar、Ben E. Black、Glennis A. Logsdon、Kenji Tago和Dawn S. Chandler慷慨提供试剂。Y.N.的研究得到了江苏省“双一流”建设基金、江苏省自然科学基金（SBK2019021248）以及江苏省16th 六项重大人才高峰基金（TD-SWYY-001）、江苏省“海外专家百人计划”基金（SBK2019010048）和国家自然科学基金（31970665）。本研究部分由美国国家癌症研究所资助项目R21 CA205659支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 仪器/工具 | |||
| 0.5 ml 蛋白低吸附管 | Eppendorf | 022431064 | 用于质谱分析 |
| 10 cm 细胞培养皿 | BIOFIL/JET，中国 | 700224 | 10 cm 组织培养皿（Yohei 实验室，PN63） |
| 6 孔细胞培养板 | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6 孔培养板 |
| CentriVap | LABCONCO | - | 台式真空浓缩仪，用于质谱分析前肽段的真空干燥 |
| ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μm | Eksigent Technologies | 805-00120 | 用于质谱分析的液相色谱（RPLC）柱 |
| HCX PL APO 100x 油镜 | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X 油浸物镜 |
| HCX PL APO 63x 油镜 | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X 油浸物镜 |
| Immobilon-FL PVDF 转膜膜 | EMD Millipore | IPVH00010 | 用于 Western 印迹 |
| Leica DM IRE2 电动荧光显微镜 | Leica | - | 电动荧光显微镜 |
| Leica EL6000 紧凑型光源 | Leica | 荧光激发用外置光源 | |
| 显微盖玻片（22 mm x 22 mm） | Surgipath | 105 | 盖玻片（22 mm x 22 mm） |
| Model V16-2 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置 | Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences | 31071010 | 凝胶电泳装置 I，用于较大尺寸 SDS-PAGE 凝胶 |
| nanoLC.2D | Eksigent Technologies | - | 用于质谱分析的液相色谱系统 |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris 蛋白凝胶 | Thermo Fisher | NP0335BOX | 市售的 4%-12% Bis-Tris 蛋白凝胶，用于质谱分析 |
| Olympus FLUOVIEW FV3000 共聚焦激光扫描显微镜 | Olympus | - | 共聚焦激光扫描显微镜（https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519） |
| ORCA-R2 数字 CCD 相机 | Hamamatsu | C10600-10B | CCD 相机 |
| PAP Pen | Binding Site | AD100.1 | 用于免疫荧光染色中的防水屏障 |
| TISSUE CULTURE DISHES 10CM | VWR | 25382-166 | 10 cm 组织培养皿 |
| 垂直电泳装置（大尺寸） | Junyi，中国 | JY-SCZ6+ | 凝胶电泳装置 II，用于较大尺寸 SDS-PAGE 凝胶（Yohei 实验室，PE23） |
| VWR 显微载玻片，磨砂 | VWR International | 48312-013 | 显微载玻片 |
| 一抗 | |||
| 抗 CENP-A 抗体 | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | 小鼠单克隆抗体 |
| 抗 CENP-B 抗体 | Novus Biologicals | H00001059-B01P | 小鼠单克隆抗体 |
| 抗 GAPDH 抗体 | ABCAM | ab37168 | 兔多克隆抗体 |
| 抗 GAPDH 抗体 | Invitrogen | PA1987 | 兔多克隆抗体 |
| 抗 GFP 抗体 | ANTI #76（实验室自制抗体） | 兔多克隆抗体 | |
| 抗 HA (3F10) | Roche | 11815016001 | 大鼠单克隆抗体 |
| 抗 HJURP 抗体 | Proteintech Group | 15283–1-AP | 兔多克隆抗体 |
| 抗泛素抗体 | Bethyl Laboratories | A300-317A-1 | 兔多克隆抗体 |
| 试剂 | |||
| Bio-Rad 蛋白检测试剂 | Bio-Rad | 500-0006 | 商用蛋白检测试剂 I，用于蛋白浓度测定（兼容 0.1% SDS） |
| Branson SONIFIER 450 | 超声破碎仪 | ||
| Branson Ultrasonics 超声破碎仪微探头，阶梯型，实心螺纹，9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | 超声破碎用破碎头 |
| Branson Ultrasonics 超声破碎仪微探头，锥形，6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | 超声破碎用微探头 |
| 缓冲液 A1 | - | - | 20 mM Tris-HCl，pH 7.4；50 mM NaCl；0.5% Nonidet P-40；0.5% 脱氧胆酸钠；0.5% SDS；1 mM EDTA；完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物 |
| 完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11-873-580-001 | 缓冲液 A1 用完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂试剂 |
| 考马斯亮蓝 R-250 | BBI Life Sciences | CAS 6104-59-2 | 用于质谱分析的考马斯亮蓝溶液 |
| 结晶紫溶液（2.3% 结晶紫，0.1% 草酸铵，20% 乙醇） | SigmaI-Aldrich | HT90132-1L | 用于克隆染色 |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | 用于细胞核染色 |
| DMEM: F12 培养基 | ATCC | 30-2006 | DMEM: F12 培养基 |
| 胎牛血清，认证，热灭活，美国来源 | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS（胎牛血清） |
| 高糖 DMEM（Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基） | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | 高糖 DMEM |
| Lipofectamin 3000 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | 化学转染试剂 I |
| Lipofectamin 3000，P3000 溶液 | Life Technologies/Invitrogen | L3000 | 化学转染试剂 II |
| 甲醇 | Fisher | A412-4 | 固定剂 |
| 脱脂奶粉（可替代 Carnation 脱脂奶粉） | Fisher Scientific | NC9255871（重订号 190915；批号 90629） | 脱脂乳粉 |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | 低血清培养基 |
| 对苯二胺 | SIGMA-SLDRICH | P6001 | 用于封片剂 |
| 青霉素-链霉素，液体 | Fisher/Gibco | 15-140 | 青霉素-链霉素 |
| 聚-L-赖氨酸溶液 | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | 聚-L-赖氨酸，0.1% w/v，溶于水 |
| 聚乙烯亚胺 [PEI]；1.0 mg/ml | Polysciences | 23966–2 | 化学转染试剂 III |
| Protein A Sepharose CL-4B 珠 | GE Healthcare/Amersham | 17-0963-03 | 用于使用 pQCXIP-EYFP-CENP-A 进行体内泛素化检测的 Protein A Sepharose CL-4B 珠 |
| Restore Western Blot 剥脱缓冲液 | Thermo Scientific | PI21059 | Western Blot 剥脱缓冲液 I |
| 测序级胰蛋白酶 | Promega | V5111 | 用于质谱分析 |
| SuperSignal West Femto 最大灵敏度底物 | Thermo | 34095 | 超敏增强型化学发光（ECL）底物 |
| UltraPure 去离子水 | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | 无菌组织培养级水 |
| Western Blot 剥脱缓冲液 II（50 mM Tris-HCl，pH 6.85；2% SDS；50 mM DTT；100 mM 2-巯基乙醇） | - | - | Western Blot 剥脱缓冲液 II |
| 二抗 | |||
| Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | 荧光素偶联二抗（亲和纯化二抗） |
| Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | 荧光素偶联二抗（亲和纯化二抗） |
| 软件 | |||
| Acquisition FV31S-SW 软件 | Olympus | - | 软件 C1（https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519） |
| Analysis FV31S-DT 软件 | Olympus | - | 软件 C2（https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519） |
| cellSens Dimension 软件 Ver. 1.18 | Olympus | - | 软件 C3（https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/） |
| Image Studio 分析软件 Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | - | 软件 D |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 系统 | Bio-Rad | - | 化学发光成像仪，用于免疫印迹检测 |
| Odyssey CLx 红外成像系统 | LI-COR Biosciences | - | 红外成像系统，用于免疫印迹检测 |
| OpenCFU 软件 | - | - | 用于菌落计数（http://opencfu.sourceforge.net/） |
| Openlab 版本 5.5.2 科学成像软件 | Improvision/PerkinElmer | - | 软件 A |
| ProteinPilot 软件版本 4.5 | AB SCIEX | - | 用于质谱分析的软件 F |
| Quantity One 1-D 分析软件 | Bio-Rad | - | 软件 E |
| TripleTOF 5600+ 系统 | AB SCIEX | - | 质谱仪 |
| Volocity 版本 6.3 3D 图像分析软件（Volocity Acquisition） | PerkinElmer | - | 软件 B1 |
| Volocity 版本 6.3 3D 图像分析软件（Volocity Quantification） | PerkinElmer | - | 软件 B2 |
参考文献
- Dunleavy, E. M., et al. HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres. Cell. 137 (3), 485-497 (2009).
- Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell<....
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