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方法文章

通过质谱分析鉴定EYFP标记的CENP-A（EYFP-CENP-A）的泛素化修饰

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DOI：

10.3791/61138

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2020年6月10日

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1MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Model Animal Research Center, Nanjing University, 2Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine, Medical School of Nanjing University, 3Greehey Children's Cancer Institute, Department of Molecular Medicine, UT Health Science Center San Antonio

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

CENP-A 的泛素化是 CENP-A 在着丝粒上沉积的重要前提，通过细胞分裂过程中的二聚化作用遗传，并对细胞存活至关重要。本文介绍通过质谱分析鉴定EYFP标记的CENP-A蛋白（EYFP-CENP-A）泛素化的方法。

摘要

研究动粒和着丝粒的结构与动态对于理解染色体不稳定性（CIN）和癌症进展具有重要意义。着丝粒的染色体位置及其功能（即着丝粒身份）是如何被决定的，以及如何参与染色体的准确分离，是一个基本科学问题。CENP-A 被认为是着丝粒身份的非DNA指示因子（表观遗传标记），CENP-A 的泛素化对于其在着丝粒上的沉积至关重要，该过程通过细胞分裂间的二聚化作用得以遗传，并且对细胞存活不可或缺。

本文描述了通过质谱分析鉴定EYFP-CENP-A K124R突变体的泛素化修饰，结果表明由于CENP-A K124R突变蛋白上连接了EYFP标签，可能诱导了其他赖氨酸位点的泛素化。质谱分析成功鉴定了EYFP-CENP-A K124R中赖氨酸306（K306）的泛素化修饰，该位点对应于CENP-A中的赖氨酸56（K56）。本文还讨论了使用GFP/EYFP或高分子量蛋白标签作为研究蛋白质功能工具时存在的局限性。同时探讨了当前技术在检测泛素化条带、鉴定特定位点的泛素化修饰以及在活细胞或单个细胞整个细胞周期中可视化泛素化过程方面所面临的技术限制。

本文所介绍的质谱分析方法可应用于带有不同标签的人类CENP-A蛋白以及其他着丝粒-动粒蛋白。对于希望鉴定泛素化功能作用的研究人员，建议采用由多种检测/分析方法组合而成的这一系列方法。

引言

在大多数真核生物中，纺锤体微管必须与每条染色体上的一个特定区域结合，该区域称为着丝粒。动粒是由位于着丝粒处的多种蛋白质组成的复合物。研究着丝粒和动粒蛋白的运动时序以及动粒和着丝粒的结构，对于理解染色体不稳定性（CIN）和癌症进展具有重要意义。关键科学问题在于：染色体上着丝粒的位置及其功能（即着丝粒身份）是如何确定的，以及它们如何参与染色体的准确分离。在大多数物种中，着丝粒身份由一种含有特殊组蛋白样蛋白CENP-A的核小体的存在所决定。因此，人们认为CENP-A是着丝粒身份的非DNA决定因素（表观遗传标记）。阐明CENP-A如何在人类中定义着丝粒身份的机制至关重要。

Holliday连接识别蛋白（HJURP）是一种CENP-A特异性分子伴侣，可将CENP-A沉积至着丝粒核小体中1,2,3。我们先前报道过，CUL4A-RBX1-COPS8 E3连接酶对于CENP-A在赖氨酸124位点（K124）的泛素化以及着丝粒定位是必需的4。此外，我们的研究结果表明，新合成CENP-A向着丝粒的招募依赖于预先存在的泛素化CENP-A5。因此，我们提出了一种模型，认为CENP-A的泛素化状态通过细胞分裂间的二聚化作用得以遗传。

与我们的研究结果以及Yu等人的研究结果相反，最近有文章发表了关于CENP-A及其着丝粒定位的阴性结果6。该文章声称，基于其阴性结果——即K124R突变对CENP-A着丝粒定位和细胞活力均无影响——赖氨酸124（K124）位点的CENP-A修饰对于人类着丝粒的建立、维持及长期功能并非必需6。然而，该研究的结果与结论仍存在充分的讨论空间，我们已在先前的出版物中描述了其前一篇论文中可能存在的问题7。值得注意的是，他们在实验中将CENP-A与分子量远大于内源性CENP-A的蛋白进行了融合：例如，他们将约30 kDa的增强型黄色荧光蛋白（EYFP）与约16 kDa的CENP-A融合，并在RPE-1 CENP-A-/F基因敲除系统中分析了EYFP-CENP-A K124R融合蛋白。根据结构预测，K124位点的泛素化并不预期直接与HJURP结合4；然而，单泛素化的添加预计会影响CENP-A的蛋白构象。大分子融合蛋白的存在可能改变CENP-A的构象，而这种构象变化可能掩盖了因去泛素化所引起的结构改变。我们推测，大分子蛋白的融合可能诱导EYFP-CENP-A K124R突变体在K124以外的赖氨酸位点发生泛素化，而该位点的泛素化会抑制或掩盖K124R单突变体的原始表型。我们此前的研究已报道过，在带有大标签蛋白（EYFP）的CENP-A K124R突变体中，泛素化可发生在其他赖氨酸位点8。研究发现，EYFP标签的引入会诱导EYFP-CENP-A K124R另一赖氨酸位点的泛素化，并使该突变体能够与HJURP结合。因此，这种在其他位点的泛素化抑制或掩盖了K124R单突变体的原始表型，导致EYFP-CENP-A野生型和K124R突变体均表现出着丝粒定位（我们同时使用并比较了pBabe-EYFP-CENP-A野生型、K124R突变体以及pBabe-EYFP对照）。实验结果表明，Flag标签化或无标签的CENP-A K124R突变体具有致死性，但可通过单泛素融合得以挽救，提示CENP-A的泛素化对细胞存活至关重要。

近年来，许多研究开发了不同的检测方法，用于鉴定 CENP-A 蛋白及其他着丝粒-动粒蛋白在体内和体外的翻译后修饰（PTMs）9,10,11。与组蛋白的翻译后修饰类似——后者是调控染色质功能的主要机制之一，着丝粒染色质组分的翻译后修饰也参与调控着丝粒整体结构与功能的关键机制。大多数 CENP-A 的 PTM 位点特异存在于含 CENP-A 的核小体中，尽管其中少数位点在组蛋白 H3 中保守存在，这表明这些残基的修饰有助于实现着丝粒特异的功能。已有研究报道 CENP-A 存在磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化等多种翻译后修饰9，提示 CENP-A 的氨基末端及C端组蛋白折叠结构域可发生多种 PTMs 及其组合修饰。多个研究团队（包括我们自己的团队）已揭示 CENP-A 修饰在多种功能中的重要性，这些功能包括 CENP-A 在着丝粒上的沉积、蛋白稳定性以及 CCAN（组成型着丝粒相关网络）的招募9。然而，目前针对 CENP-A PTMs 的研究仍较为有限，且鲜有研究将其与经典组蛋白（可直接或间接调控其功能）进行比较分析。此外，专注于鉴定这些 CENP-A PTMs 方法学的技术性报告也十分有限。

由于CENP-A的泛素化修饰对于CENP-A在着丝粒上的沉积至关重要12，且该过程通过细胞分裂期间的二聚化作用遗传5，并对于细胞存活不可或缺8，因此，鉴定CENP-A泛素化的方法对未来研究着丝粒的功能活性、定位及结构具有重要意义。因此，本文描述了通过质谱分析鉴定EYFP-CENP-A K124R突变体的泛素化修饰，结果提示EYFP标签可能导致CENP-A K124R突变蛋白在另一个赖氨酸位点发生泛素化修饰8。此外，还提供了其他对照实验与分析方法（免疫荧光分析、克隆形成实验以及体内泛素化实验）的操作方案，以全面讨论质谱分析的主要结果。

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方案

1. pBabe-EYFP-CENP-A 载体的细胞培养与逆转录病毒转染

注意：EYFP-CENP-A 由 pBabe-EYFP-CENP-A 表达，其蛋白水平与内源性 CENP-A 相似。在 RPE-1 CENP-A-/- 细胞中，通过 Cre 重组酶破坏 CENP-A-/F 等位基因后，总细胞 CENP-A 蛋白即被此 EYFP-CENP-A 取代6。

  1. 使用 293T 包装细胞制备含有逆转录病毒的上清液。
    1. 第 0 天：将 293T 包装细胞接种于 6 孔培养板中（1.0 × 106 个细胞/孔）。使用含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的高糖 DMEM 培养基培养细胞。在 37 °C、5% CO2 的条件下培养 24 小时。
      注意：为获得最佳结果，需通过实验确定接种时使用的细胞密度。
    2. 第 1 天：在接种细胞约 23 小时后准备转染反应（以接种后 24 小时作为转染的 0 小时点）。转染各表达质粒 pBabe-EYFP（B3182）、pBabe-EYFP-CENP-A WT（B3161）和 pBabe-EYFP-CENP-A K124R（B3164）（见表 1）。
    3. 从表 2列出的辅助/包装质粒组合中选择一种，并将其加入含有上述任一质粒的离心管中。表 2中主要列出这三种辅助/包装质粒组合。在本实验中，任意一种组合均有效，且表现出相似的转染效率。
    4. 准备 50 μL 低血清培养基，分别加入 2.0 μg 的 pBabe-EYFP（B3182）、pBabe-EYFP-CENP-A WT（B3161）和 pBabe-EYFP-CENP-A K124R（B3164）（见表 1），并加入表 2中列出的一种辅助/包装质粒组合（见下文）。室温孵育 5 分钟。此混合物为溶液 A。
    5. 另取 50 μL 低血清培养基，分别加入 1.5 μL 转染试剂 I 和 II（材料表）。室温孵育 5 分钟。此混合物为溶液 B。
      注意：可选操作为，在溶液 B 中仅加入 6.0 μL 转染试剂 III（聚乙烯亚胺 [PEI]；1.0 mg/mL），或在溶液 B 中除转染试剂 I 和 II 外额外加入 6.0 μL 转染试剂 III（材料表）。
    6. 将溶液 A 与溶液 B 混合，室温孵育 15 分钟。
    7. 用 PBS 洗涤培养细胞一次后，将溶液 A 与溶液 B 的混合物（即 DNA-脂质复合物）直接加入含有 500 μL 低血清培养基的 6 孔培养板各孔中。质粒的终浓度为 3.3 μg/mL。
    8. 在 37 °C、5% CO2 条件下孵育细胞 4.5 小时后，更换为含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的高糖 DMEM 培养基。换液后每孔加入 2 mL 培养基。
    9. 转染后在 37 °C、5% CO2 条件下继续培养细胞 48 小时。于第 3 天使用含逆转录病毒的上清液进行病毒感染。
  2. 对 CENP-A-/F RPE-1 靶细胞进行逆转录病毒感染。
    1. 第 2 天：感染前一天，将 CENP-A-/F RPE-1 靶细胞接种于 6 孔培养板中（2.25 × 105 个细胞/孔）。使用含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM:F12 培养基（材料表）进行培养。
      注意：为克隆形成实验、免疫荧光及 Western 印迹分析设置对照组，需同时接种相应细胞。为获得最佳结果，需通过实验确定接种时使用的细胞密度。
    2. 第 3 天（病毒感染日）：在 293T 包装细胞转染 48 小时后，收集含病毒的上清液，并通过 0.45 μm 滤器过滤（切勿使用 0.2 μm 滤器，以免剪切病毒包膜）。建议使用聚醚砜（PES）滤器。
    3. 用病毒上清液感染 CENP-A-/F RPE-1 细胞。对于 6 孔培养板中的每孔，加入 1 mL 新鲜培养基、1 mL 病毒上清液以及聚凝胺（polybrene），使其终浓度为 8 μg/mL。将 CENP-A-/F RPE-1 细胞在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 4 天，直至转染后第 7 天。
      注意：CENP-A-/F RPE-1 细胞的孵育时间需根据后续分析通过实验确定，以获得最佳结果。

2. 含pBabe-EYFP-CENP-A的细胞的免疫荧光分析

  1. 第7天：逆转录病毒感染pBabe-EYFP-CENP-A构建体后4天，用抽吸法移除培养基。用TBS（25 mM Tris-HCl，pH 7.5；125 mM NaCl）冲洗细胞一次。将TBS沿培养孔壁加入，避免扰动细胞表面。
    注意：细胞固定的最适时间点需通过实验确定。即使未进行Cre感染，pBabe-EYFP-CENP-A构建体感染后至少4天，着丝粒处仍可检测到EYFP-CENP-A WT和K124R的免疫荧光信号（数据未显示；有关Cre感染的数据参见图1C-E）。
  2. 按照先前描述的方法进行甲醇固定及免疫荧光染色13。
  3. 一抗使用抗GFP抗体（1:1,000稀释）和抗CENP-B抗体（1:200稀释），后者作为着丝粒定位标记，抗体均在含4%山羊血清的TBS中孵育（所用抗体详见材料表）。
  4. 最后一步用纸巾吸除多余的封片剂，并用指甲油密封盖玻片边缘。
  5. 参照先前描述的方法13进行免疫荧光图像的观察、采集、定量及对着丝粒处残留EYFP-CENP-A信号的分析。
  6. 使用软件A或软件B1和B2（详见材料表）进行图像采集、去卷积等图像处理、定量与分析。可选软件C1-C3（详见材料表）用于共聚焦激光扫描显微镜。
    注意：软件A中使用的所有命令见补充编码文件中的2.6.1节；软件B1和B2中使用的所有命令见补充编码文件中的2.6.2节。

3. 逆转录病毒 Cre 感染后使用 pBabe-EYFP-CENP-A 进行菌落扩增实验

注意：进行此实验的目的是在Cre重组酶介导下破坏CENP-A-/F等位基因（即细胞内全部CENP-A蛋白被替换后），比较EYFP-CENP-A野生型与K124R突变体之间的细胞活力差异。

  1. pBabe-EYFP-CENP-A 载体的逆转录病毒转染
    1. 进行 CENP-A 的逆转录病毒转染-/F RPE-1 细胞的培养方法如第1节所述。病毒感染后，在 DMEM:F12 培养基中添加10% FBS 和1%青霉素-链霉素，培养72小时。
    2. 在转染pBabe-EYFP-CENP-A构建体的逆转录病毒3天后（第6天），向含有转染细胞的孔中加入杀稻瘟菌素S（blasticidin S，10 μg/mL），用于集落形成实验及对照实验。病毒感染后，细胞需在含杀稻瘟菌素S的培养基中继续培养至少14天。每5天更换一次含杀稻瘟菌素S的培养基。
      注意：如果细胞在进行克隆形成实验（3.2.7 和 3.2.8）前已达到约 80% 汇合度，需通过胰蛋白酶消化，并以 1:2 和 1:5 的传代比例将细胞接种至 6 孔培养板中进行传代。
    3. 第7天收集细胞进行Western blot，以确认未感染Cre时pBabe-EYFP-CENP-A构建体的蛋白表达水平。Western blot分析步骤如第4节所述。结果如图所示 图1B （泳道 1-4）
    4. 进行克隆扩增实验并感染Cre病毒时，在病毒感染后继续在含有杀稻瘟菌素S（blasticidin S）的培养基中培养细胞14天（即，持续在含杀稻瘟菌素S的培养基中培养细胞至第17天） （针对此处展示的结果）。
  2. pBabe-puro-Cre 的逆转录病毒侵染
    注意：步骤 3.2.1 中的第 0 天对应于第 3.1 节中的第 13 天。
    1. 第0天至第3天：进行CENP-A的逆转录病毒转染-/F 使用 pBabe-puro-Cre（B3027）作为表达质粒转染 RPE-1 细胞（详见第 1 部分）。确保在培养基中添加杀稻瘟菌素 S（10 μg/mL）。
    2. 第4天：用胰蛋白酶消化细胞，使其从培养板上脱落。以每组三个重复，将500或5,000个细胞接种至6孔培养板中。在DMEM:F12培养基（含10% FBS和1%青霉素-链霉素）中培养细胞。
    3. 第5天：在培养基中加入杀稻瘟菌素S（10 μg/mL）。对于接种5,000或500个细胞的实验，应在病毒感染构建体（pBabe-EYFP-CENP-A构建体）后3–24天（至[3.2.7]步骤的第14天）或3–28天（至[3.2.8]步骤的第18天）期间，使用杀稻瘟菌素S（10 μg/mL）进行细胞筛选。
      注意：在此菌落扩增实验中，pBabe-puro-Cre 的转染与 pBabe-EYFP-CENP-A 的转染同时进行。pBabe-EYFP-CENP-A 的转染步骤见 3.1，pBabe-puro-Cre 的转染步骤见 3.2.1。
    4. 第10天（逆转录-Cre病毒转染后7天）：收集细胞进行蛋白质印迹分析，以确认逆转录-Cre病毒转染后内源性CENP-A蛋白的耗竭和/或pBabe-EYFP-CENP-A载体的蛋白表达 同一天第10天。
    5. 在第10天按照第4节所述方法进行蛋白质印迹实验。结果如图所示 图1B （第5-7泳道）。
    6. 进行免疫荧光分析（见上述第2节），以确认在失活残留的内源性CENP-A等位基因7天后，EYFP-CENP-A WT和K124R均定位于着丝粒。结果如图所示 图1C-1E.
    7. 第14天：使用接种了5,000个细胞的培养板进行克隆形成实验。用甲醇固定细胞10分钟，然后在结晶紫溶液（2.3%结晶紫，0.1%草酸铵，20%乙醇）中染色10分钟（参见 图2B）。使用 OpenCFU 软件计数菌落数量（参见 图2C).
    8. 第18天：使用接种了500个细胞的培养板。按照步骤3.2.7所述方法固定并染色细胞（参见 图2B）。计数菌落数量（参见 图2C).

4. 使用 pBabe-EYFP-CENP-A 进行蛋白质印迹分析

注意：有关使用 图1B 和 图2A 中指示的抗体以及 材料表 中 EYFP-CENP-A 蛋白的 Western 印迹分析，请参考先前描述的方法13。

  1. 通过裂解经不同病毒感染培养的细胞来分离蛋白质，然后使用 20 µg 蛋白质于一个孔中 SDS-PAGE 凝胶。按照先前所述方法将蛋白质转移至 PVDF 膜13.
  2. 用一抗和二抗孵育后，将膜洗涤3次。使用红外成像系统和/或化学发光成像仪检测并分析膜上的蛋白质条带。结果如图所示 图1B 和 图2A.
    1. 有关红外成像系统检测和分析蛋白质条带的操作，请参见第 4.2.1 步 补充编码文件.
    2. 使用化学发光成像仪检测和分析蛋白条带，参见步骤 4.2.2 补充编码文件. 对于该系统，使用超敏增强化学发光（ECL）底物（材料表).
    3. 可选地，使用Western blot洗脱缓冲液将PVDF膜上预孵育的抗体洗脱，并用不同的抗体重新孵育，以进行下一轮Western分析。通过实验确定最佳的孵育时间和温度。

5. 使用 pQCXIP-EYFP-CENP-A 进行细胞培养、转染及体内泛素化实验

注意：由 pQCXIP 载体表达的 EYFP-CENP-A 蛋白水平约为内源性 CENP-A 蛋白水平的 10 倍。使用该载体有助于免疫沉淀更高量的 EYFP-CENP-A 蛋白，观察 EYFP-CENP-A 的泛素化条带，并通过质谱分析鉴定 EYFP 标签的 CENP-A（EYFP-CENP-A）蛋白的泛素化修饰。

  1. 使用 pQCXIP-EYFP-CENP-A 进行体内泛素化检测的转染实验
    1. 接种 36.2 x 105 CENP-A-/F RPE-1 细胞培养于 10 cm 组织培养皿中。使用含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的高糖 DMEM 培养基培养细胞。
      注意：为获得最佳结果，需通过实验确定用于接种的细胞密度。每个免疫沉淀（IP）样本至少准备2个培养皿。 至少获得 1 mg 总蛋白。
    2. 在37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育细胞2 18 小时。
    3. 接种后17小时，准备转染试剂。
    4. 将6.7 μg的每种质粒pQCXIP-EYFP（B3252）、pQCXIP-EYFP-CENP-A WT（B3254）、pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R（B3256）混合，配制溶液A。表1) 加入335 μL低血清培养基中，室温孵育5分钟。向所有样品中加入6.7 μg pCGN-HA-Ubiquitin (B2806) 质粒。
      注意：所有载体均列于 表1.
    5. 将10.1 μL转染试剂I和10.1 μL转染试剂II分别加入335 μL低血清培养基中，混匀配制溶液B，室温孵育5分钟。
      注意：可选步骤是仅在溶液B中加入40.2 μL转染试剂III（聚乙烯亚胺[PEI]；1.0 mg/mL），或在溶液B中除转染试剂I和II外 additionally 加入40.2 μL转染试剂III（材料表).
    6. 将溶液A与溶液B混合，室温孵育15分钟。
    7. 用 PBS 清洗培养的细胞一次后，直接将溶液 A 和溶液 B 的混合物（即 DNA-脂质复合物）加入各含 3.35 mL 低血清培养基的 10 cm 组织培养皿中。
      注意：质粒的终浓度为 1.67 μg/mL。
    8. 在37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育细胞2 孵育4.5小时后，更换为含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基。
    9. 在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 转染后培养48小时。收集细胞用于制备细胞裂解液。
  2. 制备与抗GFP抗体结合的蛋白A磁珠。
    1. 取25 μL蛋白A磁珠（50%，v/v）用于一次免疫沉淀（IP）反应，用缓冲液A1洗涤材料表用缓冲液 A1（20 mM Tris-HCl，pH 7.4；50 mM NaCl；0.5% Nonidet P-40；0.5% 脱氧胆酸钠；0.5% SDS；1 mM EDTA；不含 EDTA 的完全蛋白酶抑制剂试剂）洗涤至少 3 次以去除乙醇，并用缓冲液 A1 制成 50% 溶液。
    2. 向上述制备的磁珠中加入 2.0 μL 抗 GFP 抗体（Anti#76：自制抗体），并加入相对于磁珠净体积 10 倍体积的缓冲液 A1。
    3. 在 4 °C 下进行末端旋转孵育 4–18 小时。末端旋转孵育的最佳时长需根据免疫沉淀效率通过实验确定。
    4. 将珠子在 100 x g 孵育1分钟，去除未结合的上清液。加入缓冲液A1，重新配制成50%（v/v）的珠子溶液。每项免疫沉淀反应使用25 μL该50%（v/v）溶液。
  3. 使用与抗GFP抗体结合的蛋白A琼脂糖珠进行免疫沉淀（IP）。
    1. 在缓冲液A1中通过超声处理和冻融过程裂解步骤5.1.9中获得的细胞。
    2. 测定蛋白质浓度，并对不同免疫沉淀样品中的蛋白量进行归一化处理。从每根离心管中取出5%样品，作为5% Input样本用于SDS-PAGE分析。
      注意：若一天内不进行上样，5% 输入样品可用液氮速冻后于 -80 °C 保存。
    3. 将剩余的95%裂解液与25 μL（50% v/v）在步骤5.2中制备的与抗GFP抗体结合的蛋白A磁珠混合。在4 °C下进行4–18小时的旋转孵育。
      注意：端对端旋转的最佳时长需通过实验确定。
    4. 离心含有结合蛋白的蛋白A磁珠（即免疫沉淀物），速度为100 × g g 1 分钟，弃上清液。用缓冲液 A1 洗涤免疫沉淀物，于 100 × g 离心 g 1分钟。重复此步骤4次。
    5. 将5% Input与剩余的95%免疫沉淀物分别与2x和4x SDS-PAGE上样缓冲液混合14分别将这两个样品煮沸5分钟，然后加样至10.0%变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶的不同泳道中进行电泳。电泳应使用较大的SDS-PAGE凝胶（例如17 cm × 15 cm）。若使用较小的凝胶，可能无法观察到清晰且锐利的泛素化条带。
    6. 按照第4节所述方法，使用先前报道中指出的抗体进行蛋白质印迹分析8结果如图所示 图2A.
    7. 使用 Western 印迹 stripping 缓冲液从 PVDF 膜上剥离预先孵育的抗体，并用不同的抗体重新孵育，以进行下一轮 Western 印迹分析。

6. 质谱分析鉴定EYFP-CENP-A K124R突变体的泛素化位点

  1. 使用 pQCXIP-EYFP-CENP-A 进行质谱分析的转染。
    1. 将 CENP-A-/F RPE-1 细胞接种于 10 cm 组织培养皿中。检查细胞密度为每皿 36.2 × 105 个细胞。使用含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的高糖 DMEM 培养基培养细胞。为获得至少 10 mg 总蛋白（见 5.3），每份免疫沉淀（IP）样品需准备至少 20 个培养皿。
      注意：为获得最佳结果，应通过实验确定接种时所用的细胞密度。
    2. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 的环境中孵育 18 小时。在铺板后约 23 小时准备转染试剂（以铺板后 24 小时作为转染的 0 小时时间点）。
    3. 接种后 17 小时，准备转染试剂并进行细胞转染（见 4.1.3）。转染的细胞含有 pCGN-HA-泛素（B2806）和 pQCXIP-EYFP-CENP-A K124R（B3256）。
    4. 转染后，将细胞在 37 °C、5% CO2 的环境中继续孵育 48 小时。收集细胞用于制备细胞裂解液。
    5. 在缓冲液 A1 中裂解细胞，并按照（5.2）和（5.3）进行免疫沉淀。将这两份免疫沉淀裂解液分别按照（6.1.6）和（6.1.7）进行后续操作。
      注意：在（6.1.6）中，使用标准 Tris-甘氨酸凝胶进行电泳；在（6.1.7）中，使用市售的 4%–12% Bis-Tris 蛋白凝胶进行电泳。另见讨论部分。
    6. 保留一份样品（占总免疫沉淀物的 10%），用于确认 EYFP-CENP-A 的泛素化情况，并精确确定泛素化 EYFP-CENP-A 的位置（见第 5 节描述）。该样品使用标准 Tris-甘氨酸凝胶进行电泳。SDS-PAGE 和蛋白质印迹（Western blot） 操作按（5.3）进行。
    7. 另取一份样品（占总免疫沉淀物的 90%）用于质谱分析。将该样品加样至两孔 市售 4%–12% Bis-Tris 蛋白凝胶中。使用考马斯亮蓝溶液进行染色，切取 50–70 kDa 区域的凝胶（推测为单泛素化 EYFP-CENP-A K124R 区域）。将此凝胶区域用于质谱分析。
  2. 基于凝胶内消化的质谱分析。
    1. 将每块目标凝胶切成小片（1 mm2），放入 0.5 mL 蛋白低吸附管中。
    2. 用 100 μL 含 25 mM NH4HCO3 的 50%（v/v）乙腈洗涤，涡旋 10–15 分钟，离心，弃上清，重复 3 次。
    3. 使用台式真空浓缩仪浓缩样品 30 分钟，使凝胶小块完全干燥。
    4. 加入 10 μL 浓度为 10 ng/μL 的测序级胰蛋白酶，使凝胶小块重新水化 5 分钟。
    5. 加入适量 25 mM NH4HCO3 溶液，刚好浸没凝胶小块，在 37 °C 下过夜消化。
    6. 将消化后的上清液转移至洁净的 0.65 mL 硅化管中。加入 50%（v/v）乙腈/5%（v/v）甲酸溶液（30 μL 或足以浸没样品），涡旋 10 分钟，离心后转移至同一提取管中。重复此步骤 3 次。
    7. 向凝胶小块中加入 10 μL 乙腈，涡旋 5 分钟，离心。将上清液转移至同一管中。
    8. 使用台式真空浓缩仪将样品浓缩至 2 μL，加入 8 μL 含 3%（v/v）乙腈和 2%（v/v）甲酸的溶液，涡旋 15 分钟，然后在 16,000 x g 下离心 30 分钟。样品即可用于质谱分析。
    9. 使用液相色谱系统（材料表）与质谱仪（材料表）联用，通过 LC-MS/MS 进行质谱数据采集。
    10. 将 8 μL 重悬后的样品注入反相液相色谱（RPLC）柱中。
    11. 在 60 分钟内使用溶剂 B 的 2%–80% 线性梯度分离肽段。确保梯度设置为：前 40 分钟从 2% 升至 22% 溶剂 B，随后 12 分钟从 22% 升至 35% 溶剂 B，再用 4 分钟升至 80% 溶剂 B，最后维持 80% 溶剂 B 4 分钟。流速保持恒定在 300 nL/min。
      注意：溶剂 A 含 0.1% 甲酸和 2% 乙腈，溶剂 B 含 0.1% 甲酸和 98% 乙腈。所有浓度均以体积/体积表示。
    12. 采用数据依赖性采集模式收集质谱数据。简要而言，以 250 ms 采集 350–1500 m/z 范围内的 MS 谱图。选择强度最高的前 50 个、电荷数为 2–5 的母离子进行二级碎裂。以 100 ms 采集 100–2000 m/z 范围内的 MS/MS 谱图，并在 15 秒内排除母离子的重复选择。
    13. 进行数据库搜索时，打开商业软件（见 材料表）在台式计算机上分析质谱数据。
    14. 创建新搜索时，点击顶部菜单中的“LC”按钮，然后点击“添加”按钮上传原始 MS 原始数据文件。
    15. 在“Paragon 方法”中选择“人源蛋白质鉴定”作为数据库搜索方法。将原始 MS 原始数据文件与 UniProt Homo Sapiens 数据库（包含 160,566 条序列，http://www.uniprot.org/proteomes/UP611385640）进行比对。
    16. 设置搜索参数如下：选择 胰蛋白酶 作为消化酶，允许最多 3 次漏切、4 种修饰以及每条肽段电荷数为 2–5。首次搜索的 质量误差 设为 20 ppm，碎片离子误差设为 0.02 Da。设定蛋白质、肽段及修饰位点的 错误发现率（FDR）阈值均低于 1%。其余所有参数均设为软件默认值（参见 图 3 中的质谱分析示意图）。
    17. 点击顶部菜单右侧的“另存为”按钮，选择存储搜索结果的文件夹，输入搜索名称后点击“保存”按钮。
    18. 点击顶部菜单右侧的“处理”按钮以启动搜索。搜索完成后，以输入名称命名的数据将自动保存至所选文件夹中。该数据可由 Software F 直接打开。
    19. 要获取任意特定肽段的 MS/MS 谱图，可双击搜索结果在 Software F 中打开。首先点击菜单顶部蛋白质列表中的目标蛋白质，然后点击菜单中部的相应肽段，该肽段的 MS/MS 谱图将显示在菜单底部。
    20. 要导出并保存 MS/MS 谱图，可在菜单底部右键点击 MS/MS 谱图，选择复制后粘贴至 PPT 或 doc 等合适文件格式中。

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结果

EYFP-CENP-A K124突变体表现出泛素化、与HJURP相互作用，且在着丝粒定位和细胞存活方面均无缺陷。 此处引用Fachinetti等人（2017年）报道的系统6 重新构建：在携带一个被破坏和一个“floxed”等位基因的二倍体人类（RPE-1）细胞中 CENP-A 等位基因CENP-A-/F），EYFP-CENP-A 由 pBabe-EYFP 逆转录病毒载体表达。在此系统中，内源性 CENP-A 的表达来自 CENP-A-/F 等位基因可被Cre重组酶破坏6EYFP-CENP-A野生型或K124R突变体基因构建体图1A)，可在逆转录病毒整合后稳定表达，以挽救内源性CENP-A的缺失。内源性CENP-A的残余表达来自 CENP-A-/F 等位基因随后被Cre重组酶破坏。在诱导Cre重组酶7天后，未检测到内...

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讨论

本文描述了采用质谱分析方法鉴定EYFP-CENP-A K124R突变体的泛素化修饰，结果表明EYFP标签可能导致CENP-A K124R突变蛋白在另一个赖氨酸位点发生泛素化8。在我们的研究结果中，通过质谱分析成功鉴定了EYFP-CENP-A K124R蛋白中赖氨酸306（K306）的泛素化修饰，该位点对应于CENP-A中的赖氨酸56（K56）。此处描述的质谱分析方法是一种模拟我们先前鉴定CENP-A WT-Flag中赖氨酸124（K124）泛素化位点的方法12。因此，该方法可适用于带有不同标签的人源CENP-A蛋白以及其他着丝粒-动粒蛋白。基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的质谱分析已被广泛用于鉴定多种蛋白质潜在的翻译后修饰（PTMs）。我们整合的多种实验与分析方法（包括体内泛素化实验、克隆生长实验和质谱分析）可推荐给希望研究其目标蛋白泛素化功能作用的研究人员。

然而，本方案并未涵盖在活细胞或整个细胞周期中特定单个细胞内检测泛素化条带和/或鉴定这些蛋白质位点特异性泛素化的方法。近...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

我们感谢南京大学模式动物研究所的Chao-Jun Li提供的质谱分析。感谢Yanmini Dalal、Tatsuo Fukagawa以及南京大学模式动物研究所和Greehey儿童癌症研究所的现任研究人员在讨论、实验指导和试剂方面提供的帮助。感谢Don W. Cleveland、Daniele Fachinetti、Yanmini Dalal、Minh Bui、Gustavo W. Leone、John Thompson、Lawrence S. Kirschner、Amruta Ashtekar、Ben E. Black、Glennis A. Logsdon、Kenji Tago和Dawn S. Chandler慷慨提供试剂。Y.N.的研究得到了江苏省“双一流”建设基金、江苏省自然科学基金（SBK2019021248）以及江苏省16th 六项重大人才高峰基金（TD-SWYY-001）、江苏省“海外专家百人计划”基金（SBK2019010048）和国家自然科学基金（31970665）。本研究部分由美国国家癌症研究所资助项目R21 CA205659支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器/工具
0.5 ml 蛋白低吸附管Eppendorf022431064用于质谱分析
10 cm 细胞培养皿BIOFIL/JET，中国70022410 cm 组织培养皿（Yohei 实验室，PN63）
6 孔细胞培养板Fisher/Corning Incorporated07-200-836 孔培养板
CentriVapLABCONCO-台式真空浓缩仪，用于质谱分析前肽段的真空干燥
ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 μmEksigent Technologies805-00120用于质谱分析的液相色谱（RPLC）柱
HCX PL APO 100x 油镜LeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE100X 油浸物镜
HCX PL APO 63x 油镜LeicaLEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS63X 油浸物镜
Immobilon-FL PVDF 转膜膜EMD MilliporeIPVH00010用于 Western 印迹
Leica DM IRE2 电动荧光显微镜Leica-电动荧光显微镜
Leica EL6000 紧凑型光源Leica荧光激发用外置光源
显微盖玻片（22 mm x 22 mm）Surgipath105盖玻片（22 mm x 22 mm）
Model V16-2 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences31071010凝胶电泳装置 I，用于较大尺寸 SDS-PAGE 凝胶
nanoLC.2DEksigent Technologies-用于质谱分析的液相色谱系统
NuPAGE 4%-12% Bis-Tris 蛋白凝胶Thermo FisherNP0335BOX市售的 4%-12% Bis-Tris 蛋白凝胶，用于质谱分析
Olympus FLUOVIEW FV3000 共聚焦激光扫描显微镜Olympus-共聚焦激光扫描显微镜（https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519）
ORCA-R2 数字 CCD 相机HamamatsuC10600-10BCCD 相机
PAP PenBinding SiteAD100.1用于免疫荧光染色中的防水屏障
TISSUE CULTURE DISHES 10CMVWR25382-16610 cm 组织培养皿
垂直电泳装置（大尺寸）Junyi，中国JY-SCZ6+凝胶电泳装置 II，用于较大尺寸 SDS-PAGE 凝胶（Yohei 实验室，PE23）
VWR 显微载玻片，磨砂VWR International48312-013显微载玻片
一抗
抗 CENP-A 抗体Stressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006小鼠单克隆抗体
抗 CENP-B 抗体Novus BiologicalsH00001059-B01P小鼠单克隆抗体
抗 GAPDH 抗体ABCAMab37168兔多克隆抗体
抗 GAPDH 抗体InvitrogenPA1987兔多克隆抗体
抗 GFP 抗体ANTI #76（实验室自制抗体）兔多克隆抗体
抗 HA (3F10)Roche11815016001大鼠单克隆抗体
抗 HJURP 抗体Proteintech Group15283–1-AP兔多克隆抗体
抗泛素抗体Bethyl LaboratoriesA300-317A-1兔多克隆抗体
试剂
Bio-Rad 蛋白检测试剂Bio-Rad500-0006商用蛋白检测试剂 I，用于蛋白浓度测定（兼容 0.1% SDS）
Branson SONIFIER 450超声破碎仪
Branson Ultrasonics 超声破碎仪微探头，阶梯型，实心螺纹，9.5 mmVWR Scientific Products Inc.33995-325超声破碎用破碎头
Branson Ultrasonics 超声破碎仪微探头，锥形，6.5 mmVWR Scientific Products Inc.33996-185超声破碎用微探头
缓冲液 A1--20 mM Tris-HCl，pH 7.4；50 mM NaCl；0.5% Nonidet P-40；0.5% 脱氧胆酸钠；0.5% SDS；1 mM EDTA；完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物
完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物Roche11-873-580-001缓冲液 A1 用完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂试剂
考马斯亮蓝 R-250BBI Life SciencesCAS 6104-59-2用于质谱分析的考马斯亮蓝溶液
结晶紫溶液（2.3% 结晶紫，0.1% 草酸铵，20% 乙醇）SigmaI-AldrichHT90132-1L用于克隆染色
DAPISIGMA-SLDRICHD9542用于细胞核染色
DMEM: F12 培养基ATCC30-2006DMEM: F12 培养基
胎牛血清，认证，热灭活，美国来源Life Technologies/Gibco10082FBS（胎牛血清）
高糖 DMEM（Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基）Life Technologies/BioWhittaker12-604高糖 DMEM
Lipofectamin 3000Life Technologies/InvitrogenL3000化学转染试剂 I
Lipofectamin 3000，P3000 溶液Life Technologies/InvitrogenL3000化学转染试剂 II
甲醇FisherA412-4固定剂
脱脂奶粉（可替代 Carnation 脱脂奶粉）Fisher ScientificNC9255871（重订号 190915；批号 90629）脱脂乳粉
Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985低血清培养基
对苯二胺SIGMA-SLDRICHP6001用于封片剂
青霉素-链霉素，液体Fisher/Gibco15-140青霉素-链霉素
聚-L-赖氨酸溶液SIGMA-SLDRICHP 8920聚-L-赖氨酸，0.1% w/v，溶于水
聚乙烯亚胺 [PEI]；1.0 mg/mlPolysciences23966–2化学转染试剂 III
Protein A Sepharose CL-4B 珠GE Healthcare/Amersham17-0963-03用于使用 pQCXIP-EYFP-CENP-A 进行体内泛素化检测的 Protein A Sepharose CL-4B 珠
Restore Western Blot 剥脱缓冲液Thermo ScientificPI21059Western Blot 剥脱缓冲液 I
测序级胰蛋白酶PromegaV5111用于质谱分析
SuperSignal West Femto 最大灵敏度底物Thermo34095超敏增强型化学发光（ECL）底物
UltraPure 去离子水Life Technologies/Invitrogen/Gibco10977无菌组织培养级水
Western Blot 剥脱缓冲液 II（50 mM Tris-HCl，pH 6.85；2% SDS；50 mM DTT；100 mM 2-巯基乙醇）--Western Blot 剥脱缓冲液 II
二抗
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgGLife Technologies/InvitrogenA11008荧光素偶联二抗（亲和纯化二抗）
Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgGLife Technologies/InvitrogenA11005荧光素偶联二抗（亲和纯化二抗）
软件
Acquisition FV31S-SW 软件Olympus-软件 C1（https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519）
Analysis FV31S-DT 软件Olympus-软件 C2（https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519）
cellSens Dimension 软件 Ver. 1.18Olympus-软件 C3（https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/）
Image Studio 分析软件 Ver 4.0LI-COR Biosciences-软件 D
Molecular Imager Versadoc MP4000 系统Bio-Rad-化学发光成像仪，用于免疫印迹检测
Odyssey CLx 红外成像系统LI-COR Biosciences-红外成像系统，用于免疫印迹检测
OpenCFU 软件--用于菌落计数（http://opencfu.sourceforge.net/）
Openlab 版本 5.5.2 科学成像软件Improvision/PerkinElmer-软件 A
ProteinPilot 软件版本 4.5AB SCIEX-用于质谱分析的软件 F
Quantity One 1-D 分析软件Bio-Rad-软件 E
TripleTOF 5600+ 系统AB SCIEX-质谱仪
Volocity 版本 6.3 3D 图像分析软件（Volocity Acquisition）PerkinElmer-软件 B1
Volocity 版本 6.3 3D 图像分析软件（Volocity Quantification）PerkinElmer-软件 B2

参考文献

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  2. Foltz, D. R., et al. Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP. Cell. 137 (3), 472-484 (2009).
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泛素化鉴定免疫共沉淀实验方案液相色谱-串联质谱分析凝胶切取法胰蛋白酶消化蛋白A磁珠抗GFP抗体着丝粒身份识别
通过质谱分析鉴定EYFP标记的CENP-A（EYFP-CENP-A）的泛素化修饰
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