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方法文章

阿霉素负载的适配体-PEI-g-PEG修饰金纳米颗粒的合成用于靶向药物递送

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DOI：

10.3791/61139

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2020年6月23日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Life Sciences, Xinyang Normal University, 2Department of Imaging & Pathology, University of Leuven and Oral & Maxillofacial Surgery, University Hospitals Leuven, 3Analysis & Testing Center, Xinyang Normal University

本文内容

摘要

在本实验方案中，通过三步酰胺反应合成载有阿霉素的AS1411-g-PEI-g-PEG修饰金纳米颗粒。随后，阿霉素被负载并递送至靶向癌细胞，用于癌症治疗。

摘要

由于药物耐药性及对正常细胞的毒性，多柔比星（DOX）在临床癌症治疗中的应用受到限制。本实验方案描述了一种通过酰胺反应制备负载适配体（AS1411）和DOX的功能化金纳米颗粒（AuNPs）的方法，该纳米颗粒由聚乙二醇接枝的聚乙烯亚胺（PEI-g-PEG）共聚物修饰而成。AS1411可特异性结合癌细胞表面的靶向核仁素受体，从而使DOX靶向癌细胞而非正常细胞。首先，将聚乙二醇（PEG）羧基化，再将其接枝至支化聚乙烯亚胺（PEI）上，得到PEI-g-PEG共聚物，并通过1H NMR分析确认其结构。随后，合成由PEI-g-PEG包覆的金纳米颗粒（PEI-g-PEG@AuNPs），并通过逐步酰胺反应将DOX和AS1411共价连接至AuNPs上。所制备的AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs粒径约为39.9 nm，zeta电位为-29.3 mV，表明该纳米颗粒在水和细胞培养基中具有良好的稳定性。细胞毒性实验表明，新设计的负载DOX的AuNPs能够有效杀伤癌细胞（A549）。该合成方法展示了通过分步酰胺反应在AuNPs表面精确组装PEI-g-PEG共聚物、适配体和DOX的策略。此类适配体-PEI-g-PEG功能化的AuNPs为癌症治疗中的靶向药物递送提供了有前景的平台。

引言

癌症是全球主要的公共卫生问题，其特征是治愈率低、复发率高和死亡率高1,2。目前常规的抗癌方法包括手术、化疗和放疗3，其中化疗是临床上治疗癌症患者的主要手段4。临床上使用的抗癌药物主要包括紫杉醇（PTX）5和多柔比星（DOX）6,7。多柔比星（DOX）作为一种抗肿瘤药物，因其具有杀伤癌细胞和抑制癌细胞增殖的优点，已广泛应用于临床化疗8,9。然而，DOX会引起心脏毒性10,11，且其半衰期较短，限制了其在临床上的应用12。因此，需要可降解的药物载体来负载DOX，并在目标区域以可控的方式释放药物。

纳米颗粒已广泛应用于靶向药物递送系统，在癌症治疗中具有多种优势（例如较大的比表面积、尺寸小、可包载多种药物以及可调控的表面化学性质等）13,14,15。特别是金纳米颗粒（AuNPs）已在生物及生物医学领域得到广泛应用，如光热癌症治疗16,17。AuNPs具有易于合成和通用的表面功能化特性，因而在癌症治疗的临床应用中前景广阔18。此外，AuNPs已在多项研究中被用于确定药物递送策略、肿瘤诊断以及克服耐药性问题19,20。

然而，金纳米颗粒（AuNPs）仍需进一步优化，以通过增强的渗透和滞留效应（EPR）在肿瘤病灶处实现高浓度局部释放，从而克服耐药性，例如改善靶向性和可及性。聚合物修饰的AuNPs表现出独特优势，如提高疏水性抗癌药物的水溶性，并延长血液循环时间21,22。多种生物相容性聚合物已被用于AuNPs的包覆，例如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯亚胺（PEI）、透明质酸、肝素和黄原胶。由此显著提升了AuNPs的稳定性和载药能力23。其中，PEI是一种高度支化的聚合物，由大量重复的一级、二级和三级胺单元组成24。PEI具有优异的溶解性、低粘度和高度的功能化特性，适用于AuNPs的表面包覆。

另一方面，抗癌药物需要以更高的载药效率直接递送至癌细胞，同时降低毒性，以治疗原发性和晚期转移性肿瘤25。靶向配体在抗癌药物靶向递送系统中具有巨大潜力26。其对靶分子结合的选择性赋予了抗癌药物靶向特异性，并增加药物在病变组织中的富集27。常见的配体包括抗体、多肽和小分子。与其他配体相比，核酸适配体可在体外合成，且易于修饰。AS1411是一种未经修饰的26个碱基的磷酸二酯寡核苷酸，可形成稳定的二聚体G-四链体结构，特异性结合癌细胞表面过表达的靶向核蛋白受体28,29,30。AS1411能够抑制多种癌细胞的增殖，但不影响正常健康细胞的生长31,32。因此，AS1411已被用于构建理想的靶向药物递送系统。

本研究通过酰胺反应合成PEI-g-PEG共聚物，随后制备PEI-g-PEG包覆的金纳米颗粒（PEI-g-PEG@AuNPs）。此外，将DOX和AS1411依次连接到所制备的PEI-g-PEG@AuNPs上，如图1所示。该详细实验方案旨在帮助研究人员避免在制备载有DOX和AS1411的新型PEI-g-PEG@AuNPs过程中常见的诸多问题。

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方案

警告：使用所有化学品前，务必查阅相关的材料安全数据表（MSDS）。用于制备共聚物和纳米颗粒的多种化学品具有急性毒性。纳米颗粒也存在潜在危害。务必采取所有适当的安全操作规范，并佩戴个人防护装备，包括手套、实验服、通风橱、长裤和封闭式鞋履。

1. 双羧基聚乙二醇（CT-PEG）的合成33

  1. 将1.46 g（14.6 mmol）丁二酸酐（SA）和209 mg（1.71 mmol）4-二甲氨基吡啶（DMAP）加入100 mL圆底烧瓶中。
  2. 向步骤1.1所用的烧瓶中加入15 mL无水四氢呋喃（THF），塞上玻璃塞。将烧瓶在0 °C下保持30分钟。
  3. 在另一个新烧瓶中加入4.28 g（4.28 mmol）聚乙二醇（PEG）和1.8 mL（12.8 mmol）三乙胺（TEA）。
  4. 向步骤1.3所用的烧瓶中加入15 mL无水THF，塞上玻璃塞。在氮气氛围下，用注射器将溶液缓慢转移至步骤1.2所用的烧瓶中。
  5. 在0 °C下搅拌反应液2小时，随后在室温（RT）继续反应过夜。
  6. 使用旋转蒸发仪（40 °C，0.1 MPa）浓缩反应液并除去THF溶剂。
  7. 在室温下，将步骤1.6所得反应物溶于15 mL密度为1.325 g/mL的二氯甲烷（DCM）中，然后加入15 mL冷的乙醚（Et2O），得到沉淀产物（聚乙二醇二酸）。通过滤纸除去溶剂。
    注意：沉淀步骤可重复3次。
  8. 将沉淀物在室温下真空干燥48小时。

2. PEI-g-PEG 共聚物的合成

  1. 将步骤 1.8 中得到的 305.47 mg CT-PEG 和 5 mL 二甲基亚砜（DMSO）加入烧瓶中，在室温下搅拌，确保 CT-PEG 完全溶解于 DMSO 中。
  2. 将 49.46 mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）溶于 5 mL DMSO 中，然后将该溶液加入步骤 2.1 使用的烧瓶中，在室温下继续搅拌 30 分钟。
  3. 将 29.69 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶于 5 mL DMSO 中，并将该溶液加入步骤 2.1 使用的烧瓶中。在室温下继续搅拌 3 小时。
  4. 将 28.6 μL 聚乙烯亚胺（PEI）溶于 10 mL DMSO 中，并将该溶液逐滴加入步骤 2.1 使用的烧瓶中。至少搅拌 3 天。
  5. 将步骤 2.4 中反应完成的溶液转移至透析袋（1,000 分子量截留值 [MWCO]）中。将透析袋放入盛有 500 mL 超纯水作为透析液的 1 L 烧杯中。每 12 小时更换一次超纯水，持续 3 天。
  6. 将步骤 2.5 中的溶液转移至另一个透析袋（10,000 MWCO）中。将透析袋放入盛有 500 mL 超纯水作为透析液的 1 L 烧杯中。每 12 小时更换一次超纯水，持续 3 天。
  7. 使用旋转蒸发仪（40 °C，0.1 MPa）浓缩步骤 2.6 中的溶液，并将样品冷冻干燥，得到 PEI-g-PEG 粉末。

3. PEI-g-PEG@AuNPs 的合成

  1. 取5 mg已制备的PEI-g-PEG（步骤2.7）溶于5 mL超纯水中，置于新烧瓶中，并配玻璃塞。
  2. 向烧瓶中加入100 mL 0.3 mM的HAuCl4溶液，在室温下搅拌反应3小时。
    注意：溶液颜色应立即由黄色变为橙色。
  3. 向烧瓶中加入1 mL浓度为1 mg/mL的NaBH4溶液，在室温下继续搅拌3小时。
    注意：反应液应立即变为深红褐色。
  4. 将反应产物按步骤2.5所述方法，使用截留分子量为1,000的透析袋透析3天，得到PEI-g-PEG@AuNPs溶液。

4. DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 的合成

  1. 取1 mL浓度为2.2 mg/mL的DOX溶液和20 mL PEI-g-PEG@AuNPs溶液，加入一个新烧瓶中，并用玻璃塞密封。
  2. 将0.727 mg EDC溶于1 mL超纯水中，并将EDC溶液加入第4.1步所用的烧瓶中。
  3. 将0.437 mg NHS溶于1 mL超纯水中，将NHS溶液加入烧瓶中，在室温下搅拌1小时。
  4. 使用截留分子量为1,000的透析袋，按照第2.5步所述方法对反应产物透析3天，得到DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs溶液。

5. AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 的合成

  1. 向一个新烧瓶中加入 20 mL DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 溶液和 4OD 的 AS1411（OD = 光密度；1OD ≈ 33 μg）。
  2. 将 28.76 mg EDC 溶解于 1 mL 超纯水中，并将 EDC 溶液加入步骤 5.1 中使用的烧瓶中。
  3. 将 17.27 mg NHS 溶解于 1 mL 超纯水中，将 NHS 溶液加入步骤 5.1 中使用的烧瓶中，并在室温下搅拌反应 1 小时。
  4. 使用透析袋（1,000 MWCO）按照步骤 2.5 的方法对反应产物透析 3 天，以获得 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs。

6. 样品表征

  1. 分别将CT-PEG聚合物（步骤1.8）和PEI-g-PEG共聚物（步骤2.7）溶解于核磁共振（NMR）管中的氘代氯仿中。使用配备14.09 T超导磁体和5.0 mm 600 MHz宽带Z梯度高分辨率探头的600 MHz NMR波谱仪分析样品，以确认其化学结构34。
  2. 分别将AuNPs、DOX和AS1411，以及制备的PEI-g-PEG@AuNPs（步骤3.4）、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs（步骤4.4）和AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs（步骤5.4）分散于超纯水中。然后转移至比色皿中，使用紫外-可见（UV-vis）分光光度计记录紫外-可见吸收光谱。
  3. 将双面胶带（约2 mm × 2 mm）粘附于铝箔上，均匀地将样品溶液（PEI-g-PEG@AuNPs、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs和AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs）涂布在整个胶带上。使用X射线光电子能谱仪分析样品。
  4. 分别将PEI-g-PEG@AuNPs、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs和AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs溶液分散于超纯水中。然后转移至比色皿中，利用动态光散射法评估粒径分布。
  5. 将PEI-g-PEG@AuNPs、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs和AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs溶液分别分散于超纯水中（每5 mL超纯水中加入一滴样品）。超声处理2小时。将铜网浸入样品溶液中，并在红外灯下干燥。使用透射电子显微镜表征其形貌。
  6. 将1 mg AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs注入20 kDa截留分子量（MWCO）透析盒中，随后置于含5%牛血清白蛋白（BSA）的80 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中。在37 °C下搅拌。
  7. 在预定时间点，收集100 µL等分试样，并补充等量新鲜PBS。使用紫外-可见分光光度计测定各等分试样中DOX的荧光强度。

7. AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 纳米粒子的 CCK-8 检测

  1. 在37 °C、含95%空气和5% CO2的湿润环境中，将A549细胞培养于添加了10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。每2天更换一次培养基。使用第5代细胞进行细胞增殖和细胞毒性实验，以定量评估所制备的AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs纳米粒子的细胞毒性。
  2. 向每孔含有1 mL细胞培养基的孔中加入100 μL纳米粒子溶液。培养24小时和48小时后，移除细胞培养板中的培养基，立即向每孔加入300 μL新鲜培养基和30 μL细胞计数试剂盒-8（CCK-8）溶液。在37 °C的CO2培养箱中孵育4小时。
  3. 将步骤7.2中的200 μL反应溶液转移至96孔板中。使用酶标仪在570 nm波长下测定各孔的光密度（OD）值。
  4. 在24小时和48小时后，在显微镜下观察细胞形态。

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结果

1H 核磁共振（NMR）谱用于确认 CT-PEG 聚合物和 PEI-g-PEG 共聚物的成功合成（图2）。图2a 显示，在 δ = 3.61 ppm 处的亚甲基质子信号和在 δ = 2.57 ppm 处的羧基质子信号证实了 CT-PEG 聚合物的成功合成。图2b 显示，PEG 在 δ = 2.6 ppm 处的亚甲基质子信号和 PEI 在 δ = 1.66 ppm 处的质子信号证实了 PEI-g-PEG 共聚物的合成。

采用紫外-可见光谱法（UV-vis）检测所制备的共聚物在金纳米颗粒（AuNPs）上成功实现功能化的结果（图3）。在紫外-可见光谱中，位于约523 nm、507 nm和260 nm处的吸收峰分别对应于AuNPs、DOX和AS1411的表面等离...

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讨论

通过1H NMR 谱图（图2）可确认 CT-PEG 共聚物和 PEI-g-PEG 共聚物的成功合成。PEG 和 PEI 的分子量分别为 1,000 和 1,200。此外，采用 EDC/NHS 催化体系通过酰胺反应合成 PEI-g-PEG 共聚物。需要注意的是，若在合成 PEI-g-PEG 共聚物时改变了 PEG 和 PEI 的分子量，则反应时间及催化体系需重新评估。同时，PEI-g-PEG 共聚物在金纳米颗粒（AuNPs）上的包覆反应条件也需进一步调整，主要原因在于 PEG-g-PEI 共聚物的分子量和结构会影响 AuNPs 的包覆效率及其直径。随后，共聚物功能化的 AuNPs 形貌也可能发生变化。PEI 聚合物提供的氨基数量会影响最终 PEI-g-PEG 共聚物的结构，且 PEI 与 CT-PEG 之间不可避免地会发生交联反应。因此，步骤 2.4 需谨慎操作，PEI 溶液需缓慢逐滴加入。反应完成后，需进行透析（步骤 2.5 和 2.6），以去除交联的共聚物及未反应的聚合物。

此外，通过酰胺反应将DO...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由国家自然科学基金（31700840）和河南省高等学校重点科研项目（18B430013，18A150049）资助。本研究得到信阳师范学院南湖青年学者计划的支持。作者感谢信阳师范学院生命科学学院本科生曲泽博的有益工作。作者谨此致谢分析 & 信阳师范学院测试中心，感谢其提供设备使用支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4-二甲氨基吡啶MacklinD807273
A549 细胞ATCC CCL-185TM
AS1411BBI 生命科学公司5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411（荧光标记 AS1411）
无水四氢呋喃（THF）国药集团化学试剂有限公司
细胞计数试剂盒-8（CCK-8）Sigma Aldrich96992-500TESTS-F
二氯甲烷中药控股80047318
乙醚（Et₂O）国药集团化学试剂有限公司
二甲基亚砜MacklinD806645
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）Sigma Aldrich
盐酸多柔比星RhawnR017518
无水乙醚中药控股80059618
场发射透射电子显微镜FEI 公司Tecnai G2 F 20
三水合氯化金（III）RhawnR016035
激光粒度分析仪Malvern 仪器有限公司Zetasizer Nano ZS/Mastersizer 3000E
酶标仪Molecular DevicesSpectraMax 190
N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐MacklinN808856
N-羟基琥珀酰亚胺MacklinH6231
NMR 软件Delta 5.2.1
核磁共振波谱仪JEOLJNM-ECZ600R/S3
Origin 8.5OriginLab
青霉素Sigma AldrichV900929-100ML
磷酸盐缓冲液Sigma AldrichP4417-100TAB
聚乙二醇Sigma Aldrich81188BioUltra，平均 Mn ~ 1000
聚乙烯亚胺溶液Sigma Aldrich482595平均 Mn ~ 1200，50 wt.% 水溶液 H2O
硼氢化钠，粉末AcrosC18930
链霉素Sigma Aldrich85886-10ML
琥珀酸酐中药控股30171826
四氢呋喃中药控股40058161
三乙胺中药控股80134318
紫外-可见-近红外分光光度计Lambda950Lambda950
X 射线光电子能谱仪Thermo Fisher ScientificK-ALPHA 0.5EV

参考文献

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