合成阿普塔默-PEI-g-PEG改性金纳米粒子装载多索鲁比辛用于靶向药物输送

癌症是世界性的主要公共卫生问题，其广泛特征是治愈率低、复发率高、死亡率高^。目前传统的抗癌方法包括手术、化疗和放疗³种，其中化疗^是4号诊所癌症患者的主要治疗方法。临床使用的抗癌药物主要包括帕利塔塞尔（PTX）5和多索鲁比辛（DOX）6，7。DOX，一种抗肿瘤药物，由于癌症细胞毒性和抑制癌细胞增殖^8，9的优点，已广泛应用于临床化疗。然而，DOX导致心毒性^10，11，和DOX的短半生限制其应用在诊所^12。因此，需要降解的药物携带者以可控的方式将 DOX 加载并以子等方式释放到目标区域。

纳米粒子已广泛应用于靶向药物输送系统，在癌症治疗方面具有若干优势（即表面与体积比大、体积小、封装各种药物的能力、可调谐表面化学等）。^13，14，15.特别是金纳米粒子（AuNPs）已广泛应用于生物和生物医学应用，如光热癌治疗^16，17。AuNPs的独特特性，如简体合成和一般表面功能化，在癌症治疗¹⁸的临床领域具有良好的前景。此外，AuNP已经被用来识别药物输送策略，诊断肿瘤，并克服阻力在许多研究^19，20。

尽管如此，AuNP 需要进一步定制，通过增强渗透和保留 （EPR）（如靶向和辅助功能）在肿瘤病变时高局部释放来克服耐药性。聚合物功能化 AuNP 具有独特的优势，如疏水抗癌药物水溶解性提高，循环时间延长^21、22。各种生物相容聚合物已用于 AuNP 涂料，如聚乙二醇 （PEG）、聚乙烯胺 （PEI）、透明质酸、肝素和黄豆胶。然后，AuNP的稳定性和有效载荷得到很好的改善^。具体来说，PEI是一种高度分支的聚合物，由许多重复单位的初级，二级和三级胺²⁴组成。PEI 具有极好的溶解度、低粘度和高功能性，适合涂在 AuNPs 上。

另一方面，抗癌药物需要直接输送到癌细胞，提高负荷效率，降低毒性，治疗原发性肿瘤和晚期转移性肿瘤^25。靶向配体具有巨大的潜力，抗癌药物靶向输送系统^26。其靶分子结合的选择性赋予抗癌药物针对特异性，并增加药物在病组织^{中的丰富性27。}更多的配体包括抗体、多肽和小分子。与其他配体相比，核酸贴合剂可以在体外合成，易于修改。AS1411是一种未经改性26b磷化物寡核苷酸，形成稳定的二元G-四聚氰胺结构，专门与癌细胞^28、29、30上过度表达的目标核蛋白受体结合。AS1411抑制许多癌细胞的增殖，但不影响健康细胞^31，32的生长。因此，AS1411 被用来制造理想的有针对性的药物输送系统。

在这项研究中，PEI-g-PEG共聚物通过阿米德反应合成，然后制造PEI-g-PEG共聚物涂层金纳米粒子（PEI-g-PEG@AuNPs）。此外，DOX 和 AS1411 与准备好的 PEI-g-PEG@AuNPs有顺序链接，如 图 1所示。此详细的协议旨在帮助研究人员避免与制造装有 DOX 和 AS1411 的新 PEI-g-PEG@AuNPs相关的许多常见陷阱。

注意:在使用所有化学品之前，请务必查阅所有相关材料安全数据表 （MSDS）。用于制备共聚物和纳米粒子的几种化学物质具有剧毒性。纳米粒子也有潜在的危害。确保使用所有适当的安全做法和个人防护设备，包括手套、实验室外套、头罩、全长裤子和近身鞋。

1. 双碳水化合物聚乙二醇（CT-PEG）^合成33

1. 将 1 . 46 克（ 14 . 6 mmol ）的氢化物（ SA ）和 209 毫克（ 1 . 71 mmol ）的 4 二甲基甲基二胺（ DMAP ）添加到 100 mL 圆形底部烧瓶中。
2. 将 15 毫升的无水四氢氢素 （THF） 添加到步骤 1.1 中使用的烧瓶中，并安装玻璃塞。将烧瓶保持在 0 °C 30 分钟。
3. 将 4.28 克（4.28 mmol） 聚乙二醇 （PEG） 和 1.8 mL （12.8 mmol） 添加到新的烧瓶中。
4. 将 15 毫升的无水 THF 添加到步骤 1.3 中使用的烧瓶中，并安装玻璃塞。使用氮气下的注射器，将溶液缓慢地转移到步骤 1.2 中使用的烧瓶中。
5. 在 0 °C 搅拌溶液 2 小时，然后在室温 （RT） 下持续反应过夜。
6. 使用旋转蒸发器（40 °C，0.1 MPa），浓缩反应溶液并去除THF溶剂。
7. 在RT，溶解步骤1.6在1.325克/毫升二氯甲烷（DCM）的15毫升反应溶液，然后加入15毫升的冷二乙醚（Et₂O）以获得降水产品（聚乙二醇二恶英）。通过滤纸去除溶剂。
   注:降水步骤可重复 3 倍。
8. 在RT的真空下干燥沉淀物48小时。

2. PEI-g-PEG共聚体的合成

1. 将 305.47 毫克 CT-PEG 从步骤 1.8 和 5 mL 的二甲基硫化物 （DMSO） 添加到烧瓶中，并在 RT 搅拌，以确保 CT-PEG 在 DMSO 中完全溶解。
2. 在 5 mL DMSO 中溶解 49.46 毫克 1-（3-二甲基丙烯酸丙基）-3-乙基二氧化硫 （EDC），然后将溶液添加到步骤 2.1 中使用的烧瓶中，并在 RT 搅拌 30 分钟。
3. 在 5 mL DMSO 中溶解 29.69 毫克的 N-羟基硫酰胺 （NHS），并将溶液添加到步骤 2.1 中使用的烧瓶中。继续在RT搅拌3小时。
4. 在 DMSO 的 10 mL 中溶解 28.6 μL 聚乙烯 （PEI），并将溶液顺向添加到步骤 2.1 中使用的烧瓶中。至少搅拌3天。
5. 将反应溶液从步骤 2.4 转移到透析袋（1，000 分子重量截止 [MWCO]）。将透析袋放入 1 升烧嘴中，并放入 500 毫升超纯水作为透析剂。每12小时更换一次超纯水3天。
6. 将第 2.5 步的溶液转移到另一个透析袋 （10，000 MWCO）。将透析袋放入 1 升烧嘴中，并放入 500 毫升超纯水作为透析剂。每12小时更换一次超纯水3天。
7. 使用旋转蒸发器（40 °C，0.1 MPa）浓缩步骤2.6的溶液，并冷冻干燥样品以获得PEI-g-PEG粉末。

3. PEI-g-PEG@AuNPs综合

1. 将5毫克准备好的PEI-g-PEG（步骤2.7）溶解在5毫升的超纯水中，放入新的烧瓶中，并配有玻璃塞。
2. 将 100 mL 的 0.3 mM HAuCl₄ 溶液添加到烧瓶中，并在 RT 搅拌解决方案 3 小时。
   注意:溶液的颜色应立即从黄色更改为橙色。
3. 在烧瓶中加入 1 毫克/mL NaBH₄ 溶液，在 RT 搅拌溶液 3 小时。
   注意:反应解决方案应立即变成酒红色。
4. 使用透析袋 （1，000 MWCO） 对反应产品进行透析，为期 3 天，如步骤 2.5 所述，以获得 PEI-g-PEG@AuNPs 解决方案。

4. 多克斯-格-爱德华-格-PEG@AuNPs综合

1. 将 1 毫升 2.2 毫克/毫升 DOX 解决方案和 20 mL 的 PEI-g-PEG@AuNPs 溶液添加到新的烧瓶中，并配有玻璃塞子。
2. 在 1 mL 的超纯水中溶解 0.727 毫克 EDC，并将 EDC 解决方案添加到步骤 4.1 中使用的烧瓶中。
3. 在 1 mL 的超纯水中溶解 0.437 毫克 NHS。将 NHS 解决方案添加到烧瓶中，在 RT 搅拌 1 小时。
4. 通过使用透析袋（1，000 MWCO）对反应产品进行透析，为期3天，如第2.5步所述，以获得DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs解决方案。

5. AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs综合

1. 将 20 mL 的 DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs 溶液和 4OD AS1411 （OD = 光学密度;1OD ≈ 33 μg） 添加到新的烧瓶中。
2. 在 1 mL 的超纯水中溶解 28.76 毫克 EDC，并将 EDC 解决方案添加到步骤 5.1 中使用的烧瓶中。
3. 在 1 mL 的超纯水中溶解 17.27 毫克 NHS。将 NHS 解决方案添加到步骤 5.1 中使用的烧瓶中，并在 RT 中搅拌反应 1 小时。
4. 通过使用透析袋（1，000 MWCO）对反应产品进行透析3天，如步骤2.5所述，获得AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs。

6. 样本特征

1. 分别在核磁共振（NMR）管中溶解氯仿中的CT-PEG聚合物（步骤1.8）和PEI-g-PEG共聚物（步骤2.7）。使用配备 14.09 T 超导磁体和 5.0 mm 600 MHz 宽带 Z 梯度高分辨率探头的 600 MHz NMR 光谱仪分析样品，以确认化学结构³⁴。
2. 分散 AuNP、DOX 和 AS1411，并在超纯水中分别准备 PEI-g-PEG@AuNPs（步骤 3.4）、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs（第 4.4 步）和 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs（步骤 5.4）。然后，转移到紫外线，并使用紫外线-维斯光谱仪记录紫外线可见光谱（UV-vis）。
3. 在铝箔上附加双面胶粘剂（~2 mm x 2 mm），并将样品溶液（PEI-g-PEG@AuNPs、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs和AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs）均匀地浸入整个磁带上。使用 X 射线光电子光谱分析仪分析样品。
4. 分别在超纯水中分散 PEI-g-PEG@AuNPs、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs和 AS1411-g-DOX-g-PEI-PEG@AuNPs解决方案。然后，转移到小面包，并使用动态光散射来评估大小分布。
5. 将 PEI-g-PEG@AuNPs、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs和 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs溶液分散在超纯水中（每个样品每 5 mL 超纯水一滴样品）。声波2小时。将铜网格浸入样品溶液中，并在红外灯下干燥。使用传输电子显微镜描述形态。
6. 将 1 毫克 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs注入 20 kDa MWCO 透析盒中，然后放入 80 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中，加入 5% 牛血清白蛋白 （BSA）。在37°C搅拌。
7. 在预先确定的时间点，收集 100 μL 别名，代之以新鲜的 PBS。使用紫外线光谱仪测量音素的 DOX 荧光强度。

7. CCK-8 对AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs纳米粒子的检测

1. 在杜尔贝科改良的鹰介质 （DMEM） 中生长 A549 细胞，在 95% 空气和 5% CO₂ 在 37 °C 的潮湿大气中补充 10% 胎儿牛血清、100 U/mL 青霉素和 100μg/mL 链霉素。 每 2 天更换一次文化介质。使用通道 5 中的细胞进行细胞增殖和细胞毒性检测，定量评估制备 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs纳米粒子的细胞毒性。
2. 将 100 μL 的纳米粒子溶液添加到每口井中，其中含有 1 mL 的细胞介质。培养 24 小时和 48 小时后，从细胞培养板中去除培养介质，然后立即向每口井添加 300 μL 的新鲜培养介质和 30 μL 的细胞计数套件-8 （CCK-8） 套件解决方案。在 37 °C 的 CO₂ 孵化器中孵化 4 小时。
3. 将 200 μL 的反应解决方案从步骤 7.2 转移到 96 井板中。用微板读取器阅读每口井的光学密度 （OD）在 570 nm。
4. 在显微镜下以24小时和48小时观察细胞的形态。

1H NMR光谱学用于确认CT-PEG聚合物和PEI-g-PEG共聚合物（图2）的成功合成。图2a显示，δ的甲基质子信号=3.61ppm，δ=2.57ppm的纸箱质子信号确认CT-PEG聚合物的成功合成。图2b显示PEG的乙烯质子信号在δ=2.6ppm，PEI的质子信号在δ=1.66ppm确认PEI-g-PEG共聚物的合成。

紫外线光谱学的进行，以确定在AuNPs（图3）上制备的共聚合体的成功功能化。在紫外线-维斯光谱中，波段在约523纳米、507纳米和260纳米的存在与AuNPs、DOX和AS1411的表面质子共振（SPR）峰值（图3a）相对应。紫外线-g-PEG@AuNPs的紫外线波段为约360纳米， DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs紫外线谱约532纳米，AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs紫外线-546纳米-546纳米，确认与AuNPs相连的PEI-g-PEG共聚物的成功合成。他们还确认，DOX和AS1411已逐步加载到功能化的AuNPs（图3b）。

X射线光电子光谱 （XPS） 用于研究共聚合体在 AuNP 上的化学键 （图4）。PEI-g-PEG@AuNPs的XPS频谱显示C1、O1、N1和Au4f峰值表明AuNPs和PEI-g-PEG共聚物（图4a）之间的连接。DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs的XPS频谱略有变化，因为DOX在PEI-g-PEG@AuNPs（图4b）上进一步嫁接。此外，AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs P2p峰值的出现，主要是因为AS1411在DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs（图4c）上成功嫁接。使用 DLS （图 5） 分析制备纳米粒子的大小分布。与 PEI-g-PEG@AuNPs 相比，DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs的平均水化直径略有增加，一旦进行 AS1411 嫁接，水化直径将进一步增加。

TEM用于确定纳米粒子的形态，图像显示所有纳米粒子均匀而不聚合（图6）。由于在 AuNP 表面的共聚物之间的相互作用，AuNP 的距离逐渐增加。使用细胞生存能力测试来确定已准备好的 DOX 交付系统的目标属性（图 7 和 图 8）。CCK-8结果显示，1）A549细胞数量随着时间的推移随着时间的增加而减少，A549细胞数量随着AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs而减少，2）细胞数量随着纳米粒子浓度的增加而减少。与免费DOX组相比，细胞数量增加，表明毒性降低。

与光学显微镜图像（图8）一起，结果显示，与不添加纳米粒子（图8e，f）相比，使用AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs（图8a−d）进行培养后，细胞数量减少。此外，还调查了 PBS 中已编制的 AS1411-g-DOX-PEI-g-PEG@AuNPs的 DOX 发布配置文件（图 9）。结果表明，DOX从功能化纳米粒子中持续释放导致A549细胞减少，而DOX的累计释放率约为63.5%，±72小时时为3.2%。

图1:PEI-g-PEG@AuNP、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP和AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNP综合的示意图图。请单击此处查看此图的较大版本。

图2:1H NMR光谱（a）合成CT-PEG聚合物和（b）PEI-g-PEG共聚合物。请单击此处查看此图的较大版本。

图3:（a） AuNPs、DOX 和 AS1411 的紫外线-维斯光谱，以及 （b） PEI-g-PEG@AuNPs、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs和 AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs。请单击此处查看此图的较大版本。

图4:XPS光谱（a）PEI-g-PEG@AuNPs，（b）DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs，和（c）AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs。请单击此处查看此图的较大版本。

图5:PEI-g-PEG@AuNPs、DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs和AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs的大小分布。
d.nm=纳米粒子的平均直径。 请单击此处查看此图的较大版本。

图6:（a） PEI-g-PEG@AuNPs的 TEM 图像，（b） DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs和（c） AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs。
比例杆 =50 纳米。 请单击此处查看此图的较大版本。

图7:使用AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs（220微克/mL和110微克/mL）分别以24小时和48小时培养后，A549细胞的光学密度值为570微米（OD 570）。
具有自由DOX的细胞和不添加纳米粒子的细胞作为对照组包括在内。 请单击此处查看此图的较大版本。

图8:A549细胞在220微克/毫升（a，b）和1 PEG@AuNPs 10微克/毫升（c，d）的培养下，在24小时（上面板）和48小时（下面板）下不添加纳米粒子作为对照组（e，f）进行培养后，以光学微观图像。请单击此处查看此图的较大版本。

图9:PBS中DOX的发布配置文件，以72小时的速度发布来自AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs的DOX。请单击此处查看此图的较大版本。

作者没有什么可透露的。