阿霉素负载的适配体-PEI-g-PEG修饰金纳米颗粒的合成用于靶向药物递送

摘要

在本实验方案中，通过三步酰胺反应合成载有阿霉素的AS1411-g-PEI-g-PEG修饰金纳米颗粒。随后，阿霉素被负载并递送至靶向癌细胞，用于癌症治疗。

摘要

由于药物耐药性及对正常细胞的毒性，多柔比星（DOX）在临床癌症治疗中的应用受到限制。本实验方案描述了一种通过酰胺反应制备负载适配体（AS1411）和DOX的功能化金纳米颗粒（AuNPs）的方法，该纳米颗粒由聚乙二醇接枝的聚乙烯亚胺（PEI-g-PEG）共聚物修饰而成。AS1411可特异性结合癌细胞表面的靶向核仁素受体，从而使DOX靶向癌细胞而非正常细胞。首先，将聚乙二醇（PEG）羧基化，再将其接枝至支化聚乙烯亚胺（PEI）上，得到PEI-g-PEG共聚物，并通过¹H NMR分析确认其结构。随后，合成由PEI-g-PEG包覆的金纳米颗粒（PEI-g-PEG@AuNPs），并通过逐步酰胺反应将DOX和AS1411共价连接至AuNPs上。所制备的AS1411-g-DOX-g-PEI-g-PEG@AuNPs粒径约为39.9 nm，zeta电位为-29.3 mV，表明该纳米颗粒在水和细胞培养基中具有良好的稳定性。细胞毒性实验表明，新设计的负载DOX的AuNPs能够有效杀伤癌细胞（A549）。该合成方法展示了通过分步酰胺反应在AuNPs表面精确组装PEI-g-PEG共聚物、适配体和DOX的策略。此类适配体-PEI-g-PEG功能化的AuNPs为癌症治疗中的靶向药物递送提供了有前景的平台。

引言

癌症是全球主要的公共卫生问题，其特征是治愈率低、复发率高和死亡率高^1,2。目前常规的抗癌方法包括手术、化疗和放疗³，其中化疗是临床上治疗癌症患者的主要手段⁴。临床上使用的抗癌药物主要包括紫杉醇（PTX）⁵和多柔比星（DOX）^6,7。多柔比星（DOX）作为一种抗肿瘤药物，因其具有杀伤癌细胞和抑制癌细胞增殖的优点，已广泛应用于临床化疗^8,9。然而，DOX会引起心脏毒性^10,11，且其半衰期较短，限制了其在临床上的应用¹²。因此，需要可降解的药物载体来负载DOX，并在目标区域以可控的方式释放药物。

纳米颗粒已广泛应用于靶向药物递送系统，在癌症治疗中具有多种优势（例如较大的比表面积、尺寸小、可包载多种药物以及可调控的表面化学性质等）....

方案

警告：使用所有化学品前，务必查阅相关的材料安全数据表（MSDS）。用于制备共聚物和纳米颗粒的多种化学品具有急性毒性。纳米颗粒也存在潜在危害。务必采取所有适当的安全操作规范，并佩戴个人防护装备，包括手套、实验服、通风橱、长裤和封闭式鞋履。

1. 双羧基聚乙二醇（CT-PEG）的合成³³

1. 将1.46 g（14.6 mmol）丁二酸酐（SA）和209 mg（1.71 mmol）4-二甲氨基吡啶（DMAP）加入100 mL圆底烧瓶中。
2. 向步骤1.1所用的烧瓶中加入15 mL无水四氢呋喃（THF），塞上玻璃塞。将烧瓶在0 °C下保持30分钟。
3. 在另一个新烧瓶中加入4.28 g（4.28 mmol）聚乙二醇（PEG）和1.8 mL（12.8 mmol）三乙胺（TEA）。
4. 向步骤1.3所用的烧瓶中加入15 mL无水THF，塞上玻璃塞。在氮气氛围下，用注射器将溶液缓慢转移至步骤1.2所用的烧瓶中。
5. 在0 °C下搅拌反应液2小时，随后在室温（RT）继续反应过夜。
6. 使用旋转蒸发仪（40 °C，0.1 MPa）浓缩反应液并除去THF溶剂。
7. 在室温下，将步骤1.6所得反应物溶于15 mL密度为1.325 g/mL的二氯甲烷（DCM）中，然后加入15 mL冷的乙醚（Et₂O），得到沉淀产物（....

结果

¹H 核磁共振（NMR）谱用于确认 CT-PEG 聚合物和 PEI-g-PEG 共聚物的成功合成（图2）。图2a 显示，在 δ = 3.61 ppm 处的亚甲基质子信号和在 δ = 2.57 ppm 处的羧基质子信号证实了 CT-PEG 聚合物的成功合成。图2b 显示，PEG 在 δ = 2.6 ppm 处的亚甲基质子信号和 PEI 在 δ = 1.66 ppm 处的质子信号证实了 PEI-g-PEG 共聚物的合成。

采用紫外-可见光谱法（UV-vis）检测所制备的共聚物在金纳米颗粒（AuNPs）上成功实现功能化的结果（图3）。在紫外-可见光谱中，位于约523 nm、507 nm和260 nm处的吸收峰分别对应于AuNPs、DOX和AS1411的表面等离.......

讨论

通过¹H NMR 谱图（图2）可确认 CT-PEG 共聚物和 PEI-g-PEG 共聚物的成功合成。PEG 和 PEI 的分子量分别为 1,000 和 1,200。此外，采用 EDC/NHS 催化体系通过酰胺反应合成 PEI-g-PEG 共聚物。需要注意的是，若在合成 PEI-g-PEG 共聚物时改变了 PEG 和 PEI 的分子量，则反应时间及催化体系需重新评估。同时，PEI-g-PEG 共聚物在金纳米颗粒（AuNPs）上的包覆反应条件也需进一步调整，主要原因在于 PEG-g-PEI 共聚物的分子量和结构会影响 AuNPs 的包覆效率及其直径。随后，共聚物功能化的 AuNPs 形貌也可能发生变化。PEI 聚合物提供的氨基数量会影响最终 PEI-g-PEG 共聚物的结构，且 PEI 与 CT-PEG 之间不可避免地会发生交联反应。因此，步骤 2.4 需谨慎操作，PEI 溶液需缓慢逐滴加入。反应完成后，需进行透析（步骤 2.5 和 2.6），以去除交联的共聚物及未反应的聚合物。

此外，通过酰胺反应将DO.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-二甲氨基吡啶	Macklin	D807273
A549 细胞		ATCC CCL-185TM
AS1411	BBI 生命科学公司		5'-d (TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG) FL-AS1411（荧光标记 AS1411）
无水四氢呋喃（THF）	国药集团化学试剂有限公司
细胞计数试剂盒-8（CCK-8）	Sigma Aldrich	96992-500TESTS-F
二氯甲烷	中药控股	80047318
乙醚（Et₂O）	国药集团化学试剂有限公司
二甲基亚砜	Macklin	D806645
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Sigma Aldrich
盐酸多柔比星	Rhawn	R017518
无水乙醚	中药控股	80059618
场发射透射电子显微镜	FEI 公司	Tecnai G2 F 20
三水合氯化金（III）	Rhawn	R016035
激光粒度分析仪	Malvern 仪器有限公司	Zetasizer Nano ZS/Mastersizer 3000E
酶标仪	Molecular Devices	SpectraMax 190
N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐	Macklin	N808856
N-羟基琥珀酰亚胺	Macklin	H6231
NMR 软件	Delta 5.2.1
核磁共振波谱仪	JEOL	JNM-ECZ600R/S3
Origin 8.5	OriginLab
青霉素	Sigma Aldrich	V900929-100ML
磷酸盐缓冲液	Sigma Aldrich	P4417-100TAB
聚乙二醇	Sigma Aldrich	81188	BioUltra，平均 Mn ~ 1000
聚乙烯亚胺溶液	Sigma Aldrich	482595	平均 Mn ~ 1200，50 wt.% 水溶液 H2O
硼氢化钠，粉末	Acros	C18930
链霉素	Sigma Aldrich	85886-10ML
琥珀酸酐	中药控股	30171826
四氢呋喃	中药控股	40058161
三乙胺	中药控股	80134318
紫外-可见-近红外分光光度计	Lambda950	Lambda950
X 射线光电子能谱仪	Thermo Fisher Scientific	K-ALPHA 0.5EV