方法文章

为高浓度单分子显微镜制造零模式波导

DOI：

10.3791/61154

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2020年5月12日

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1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

本文内容

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摘要

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这里描述的是一种纳米球平板成像方法，用于平行制造零模式波导，这是金属包玻璃显微镜覆盖带中的纳米阵列，用于在纳米到微摩尔浓度的荧光素下进行单分子成像。该方法利用胶体晶体自组装创建波导模板。

摘要

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在单分子荧光酶学中，溶液中标记基材的背景荧光通常将荧光浓度限制在皮科至纳米摩尔范围内，其数量级小于许多生理配体浓度。称为零模式波导 （ZMWs） 的光学纳米结构，直径为 100 至 200 nm，由铝或金等薄导金属制造，通过将可见光激发限制在沸点有效体积中，从而允许在氟叶微摩尔浓度下对单个分子进行成像。然而，对昂贵和专门的纳米制造设备的需求已经排除了ZMW的广泛使用。 通常，ZMW等纳米结构是通过直接书写获得的，电子束光刻是连续的和缓慢的。在这里，胶体或纳米球，光刻学被用作替代策略，以创建纳米级的面罩，用于波导制造。本报告详细描述了该方法，并考虑到每个阶段的实际情况。该方法允许数千个铝或金ZMW并行制造，最终波导直径和深度为100-200纳米。只需要普通的实验室设备和用于金属沉积的热蒸发器。通过使ZMW更容易进入生化社区，这种方法可以促进细胞浓度和速率分子过程的研究。

引言

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单分子荧光共振能量转移（smFRET）或单分子荧光相关光谱（FCS）等单分子技术是分子生物物理学的有力工具，能够研究单个生物分子在转录1、2、3、翻译4、5、6等过程中的动态运动、构象和相互作用。对于 smFRET 来说，总内部反射荧光 （TIRF） 显微镜是一种常见方法，因为随着时间的推移，许多系绳分子可能会被跟踪，而 TIR 产生的消散波仅限于与盖唇8相邻的 100 至 200 nm 区域。然而，即使这种对激发体积的限制，感兴趣的荧光仍然需要稀释到pM或nM范围，以检测单分子信号以上的背景荧光9。由于细胞酶的Mi michaelis-Menten常数通常在μM到mM范围10之间，单分子研究中的生化反应通常比细胞中的生化反应慢得多。例如，蛋白质合成发生在大肠杆菌11，12中每秒15-20

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方案

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注:所有步骤都可以在一般实验室空间中完成。

1. 玻璃盖唇清洁

  1. 为了提供胶体颗粒蒸发沉积的清洁表面，将 24 x 30 mm 光学玻色硅酸盐玻璃盖片（0.16×0.19 毫米厚度）放置在 coplin 玻璃染色罐的凹槽插入件内进行清洁。
    注意:确保盖唇直立且分离良好，以便在清洁过程中所有表面都清晰暴露。
  2. 将足够的丙酮倒入染色罐中，以覆盖盖片、盖上盖子，并在 40 °C 下声波 10 分钟。
  3. 倒出丙酮，冲洗盖片，用蒸馏的H2O填充染色罐，倒出水。再重复 2 次。
  4. 再次重复丙酮声波（步骤 1.2 和 1.3）。
  5. 将足够的 200 mM KOH 倒入罐中，覆盖覆盖的覆盖唇和声波，在 40 °C 下浇灌 20 分钟。
    注:KOH 稍微蚀刻玻璃。
  6. 用蒸馏的 H2O 冲洗盖片 6 次。
  7. 添加乙醇覆盖盖片，添加盖子，并在40°C下声波10分钟。
  8. 用蒸馏的 H2O 冲洗盖片 3 次。
  9. 使用柔和的钳子在边缘拾取每个盖片，然后用 N2 气体干燥盖唇。只触摸盖片的边缘。将每个干燥、清洁的盖片放在单独清洁的 Petri 盘中。

2. 聚苯乙烯珠的蒸发沉积

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结果

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通过蒸发沉积（步骤 2.1+2.13）自组装聚苯乙烯胶体颗粒可以产生一系列结果，因为它需要控制溶剂蒸发率。但是，由于沉积速度很快（每轮 10-15 分钟），因此可以针对不同的环境实验室条件快速优化该过程。 图3A 显示沉积和蒸发后形成良好的胶体模板。从宏观上讲，珠子区域是圆形的，边界由不透明的多层珠环定义。图像中的半透明区域，但不是白色区域是所需的单层区域。 图 3B 显示了一个胶体模板，该模板在过于潮湿的环境中包装（当 Petri 菜肴关闭时为 80% RH）。这些模板往往没有干净的圆形边界，并且有向外延伸的多层肌腱。沉积是可以接受的，可用于后续阶段，但晶格中的孔减少了用于单分子成像的可使用 ZMW 阵列区域的数量。 图 3C 显示了一个胶体模板，该模板在过于干燥的环境中包装（当 Petri 菜肴关闭时为 65% RH）。与理想的、分布良好的模板相比，这些模板的直径通常较小。可以使用沉积，但多层白色区域向内条纹，减少了可用于成像的区域。因此，我们不建议一次进.......

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讨论

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对于胶体自组装（协议第2节），使用乙醇而不是水作为悬浮溶剂加速蒸发过程，使模板在沉积后2~3分钟准备好，而不是像以前的方法48，49那样在1~2小时。这里提出的蒸发沉降协议也比以前的沉降协议简单，需要控制悬浮层49、50、51以上的表面倾斜、温度和空气体积。本协议中使用的颗粒体积分数为2.4%，高于之前沉积方法48中使用的0.2+0.5%，该方法将胶体重新用于水甘油混合物的沉积时间尺度更长。然而，沉积的质量是强大的粒子体积分数的变化，与过去的研究发现，它可以在2-10%49，50，51之间变化。从本协议的.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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这项工作得到了国家卫生研究院授予R01GM080376、R35GM118139和NSF工程机械生物学中心CMMI:15-48571至Y.E.G.的支持，以及国家艾滋病规划署博士前NRSA研究金F30AI114187对R.M.J.的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.玻璃盖玻片清洁
丙酮Sigma322011 L
Coplin 玻璃染色罐Fisher Scientific08-817带 8 个凹槽和模制玻璃盖的染色罐
盖玻片VWR48404-46724 mm x 30 mm （No.1½， 矩形）
乙醇SigmaE70231 L
KOHSigma30603氢氧化钾
培养皿Fisher ScientificR80115TS直径 100 mm，深 15
mmSonicatorBransonZ245143台式超声波清洗机，5510
2。聚苯乙烯珠子的蒸发沉积
透明储存容器Fisher Scientific50-110-822226 x 18 x 15 英寸。
台扇O2CoolFD05001A任何小的桌扇（~5 英寸）都可以工作
玻璃烧杯Fisher Scientific02-555-25B250 mL
湿度计Fisher Scientific11-661-19
微量离心管Fisher Scientific21-402-9031.5 mL
聚苯乙烯微球Polysciences18602-151.00 和微;m 直径，非功能化
Triton X-100 deturgentSigmaX100100 mL
3。用于减小胶体晶体模板中孔径的珠子退火
铝板Fisher ScientificAA11062RY内部定制至 14 cm x 14 cm
陶瓷热板Fisher ScientificHP8885710013 x 8.2 x 3.8 英寸。
温度控制器McMaster-Carr38615K71用热电偶探头读取温度
热电偶探头McMaster-Carr9251T93K型，表面探头
4/5。使用胶体晶体模板
铝蚀刻剂TranseneA
Kurt J. LeskerEVMAL40QXHB用于电子束蒸发
氯仿Sigma2883061 L
铜蚀刻剂Transene49-1
铜颗粒Kurt J. LeskerEVMCU40QXQA用于电子束蒸发
金颗粒Kurt J. LeskerEVMAUXX40G用于电子束蒸发
透镜纸ThorlabsMC-5
等离子清洗剂Harrick 等离子PDC-32G
透明胶带订书钉MMM119
薄膜沉积系统Kurt J. LeskerPVD-75台式热蒸发系统也可以工作
钛颗粒Kurt J. LeskerEVMTI45QXQA用于电子束蒸发
甲苯Sigma2445111 升
<强>代表结果
COMSOL Multiphysics 建模软件COMSOL， Inc.
双视图光谱分流器Photometrics， Inc.
型铝颗粒的零模式波导的纳米制造 体

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Confor....

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勘误

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Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 8/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Colloidal crystal patterns, optical micrographs, grain structure, diffraction patterns, scale bars.
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Colloidal crystal diffraction patterns and SEM images; microscopy analysis of photonic structures.
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

标签

FRET

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