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方法文章

零模波导的制备用于高浓度单分子显微镜观察

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DOI：

10.3791/61154

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2020年5月12日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

本文内容

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摘要

本文介绍了一种用于并行制备零模波导的纳米球光刻方法，该零模波导是在金属包覆的玻璃显微镜盖玻片上形成的纳米孔阵列，可用于在纳摩尔至微摩尔浓度的荧光染料条件下进行单分子成像。该方法利用胶体晶体的自组装特性来构建波导模板。

摘要

在单分子荧光酶学研究中，溶液中标记底物产生的背景荧光通常将荧光团浓度限制在皮摩尔至纳摩尔范围内，比许多生理配体浓度低数个数量级。一种称为零模波导（ZMWs）的光学纳米结构可将可见光激发限制在zeptoliter量级的有效体积内，从而实现微摩尔浓度荧光团条件下对单个分子的成像。零模波导是在铝或金等薄导电金属层上制备的直径为100−200 nm的微孔结构。然而，由于需要昂贵且专用的纳米加工设备，ZMWs的广泛应用受到限制。通常，此类纳米结构（如ZMWs）需通过电子束光刻进行直写加工，该方法为逐次加工，速度较慢。本文采用胶体光刻（又称纳米球光刻）作为替代策略，用于制备波导加工所需的纳米级掩模。本报告详细描述了该方法的各个步骤，并提供了各阶段的实用注意事项。该方法可并行制备数千个铝或金质零模波导，最终波导的直径和深度为100−200 nm，仅需常规实验室设备和用于金属沉积的热蒸发仪即可完成。通过降低ZMWs的制备门槛，该方法有助于推动在接近细胞内生理浓度和反应速率条件下对分子过程的研究。

引言

单分子技术（如单分子荧光共振能量转移（smFRET）或单分子荧光相关光谱法（FCS））是分子生物物理学的有力工具，可用于研究转录1,2,3、翻译4,5,6 以及其他许多过程中单个生物大分子的动态运动、构象变化和相互作用7。对于smFRET而言，全内反射荧光（TIRF）显微镜是一种常用方法，因为它能够长时间追踪大量固定分子，且TIR产生的隐逝波仅局限于盖玻片附近100−200 nm的区域8。然而，即使对激发体积有此限制，仍需将目标荧光染料稀释至皮摩尔（pM）或纳摩尔（nM）浓度范围，才能在背景荧光之上检测到单分子信号9。由于细胞内酶的米氏常数通常在微摩尔（μM）至毫摩尔（mM）范围内10，单分子研究中的生化反应速率通常远低于细胞内的反应速率。例如，在大肠杆菌（E. coli）中，蛋白质合成速率为每秒15−20  个氨基酸11,12，而在smFRET实验中，大多数原核核糖体的翻译速率为每秒0.1−1个氨基酸13。在蛋白质合成过程中，晶体结构和对停滞核糖体的smFRET研究表明，在tRNA-mRNA转位步骤之前，转运RNA（tRNA）在“杂合”状态与“经典”状态之间波动14,15。然而，当存在生理浓度的转位GTP酶因子EF-G时，smFRET观察到了一种介于杂合态与经典态之间的不同构象6。在与细胞内相似的反应速率和浓度条件下研究分子动态过程具有重要意义，但仍是技术上的挑战。

提高荧光底物浓度的一种策略是使用基于金属的亚可见光波长孔径，称为零模波导（zero mode waveguides, ZMWs），以产生受限的激发场，选择性地激发定位于孔径内的生物分子16（图1）。这些孔径的直径通常为100−200 nm，深度为100−150 nm17。当波长超过与孔径尺寸和形状相关的截止波长时（对于以水为介电介质的圆形波导，λc ≈ 直径的2.3倍18），波导中不再允许传播模式存在，因此称为零模波导。然而，一种振荡的电磁场（称为倏逝波）仍能以指数衰减的强度短距离穿透进入波导内部18,19。尽管此类倏逝波与全内反射（TIR）产生的倏逝波类似，但ZMW中的倏逝波具有更短的衰减常数，从而在波导内形成约10−30 nm的有效激发区域。在微摩尔浓度的荧光标记配体条件下，激发区域内同时存在的分子仅有一个或少数几个。这种对激发体积的限制以及随之而来的背景荧光降低，使得在生理相关浓度下实现单分子荧光成像成为可能。该技术已被应用于多种系统20，包括单个蛋白质扩散的FCS测量21、低亲和力配体-蛋白质22及蛋白质-蛋白质相互作用的单分子FRET测量23，以及单分子转化事件的光谱电化学测量24。

零模波导（ZMW）的制备已通过直接使用离子束铣削25,26或电子束光刻（EBL）结合等离子体刻蚀技术实现16,27。这些无掩模光刻方法以串行方式制造波导，通常需要使用专业的纳米加工设施，从而限制了ZMW技术的广泛应用。另一种方法——紫外纳米压印光刻剥离法28，采用石英载玻片模具像印章一样将ZMW的反向模板压印到光刻胶薄膜上。尽管该方法流程更为简化，但仍需通过电子束光刻来制备石英模具。本文介绍了一种简单且低成本的模板化制备方案，该方法无需电子束光刻或离子束铣削，而是基于纳米微球的紧密堆积形成光刻掩模。

纳米球光刻或“自然”光刻技术由Deckman和Dunsmuir于1982年首次提出29,30，该方法利用单一分散的胶体颗粒自组装形成模板，通过材料的刻蚀和/或沉积实现表面图案化，胶体颗粒尺寸范围从几十纳米到几十微米31。这些被称为胶体晶体的二维（2D）或三维（3D）扩展周期性颗粒阵列，因散射和衍射而呈现出明显的虹彩32。尽管该掩模技术的应用不如电子束光刻或光刻技术广泛，但其操作简单、成本低，且易于缩小至特征尺寸低于100 nm。

引导胶体粒子的自组装过程决定了使用胶体晶体作为表面图案化掩模是否成功。如果粒子的尺寸和形状均一，胶体粒子可在熵驱动的耗尽作用下自发形成六方密堆积结构33。滴涂后通过水分蒸发是沉积胶体粒子的有效途径，其他方法还包括浸涂34、旋涂35、电泳沉积36以及在气-水界面处的聚集37。下文所述方案基于蒸发沉降法，因其实施最为简便。紧密排列的聚苯乙烯微球之间的三角形间隙可形成孔洞，用于电镀牺牲性金属，从而形成柱状结构（图2 和 补充图1）。在此步骤之前对微球进行短暂退火处理，可调节这些柱状结构的形状和直径。随后去除微球，在柱体周围沉积最终的金属层，再将柱体移除。在胶体纳米掩模上完成两次金属沉积、中间柱体的去除以及表面化学修饰以实现钝化和锚定后，零模波导（ZMW）阵列即可用于单分子成像。有关制备完成后ZMW光学特性的更详细表征，可参见相关文章38。除用于金属蒸镀的热蒸发仪外，无需其他专用设备。

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方案

注意：所有步骤均可在普通实验室环境中完成。

1. 玻璃盖玻片清洗

  1. 为了为胶体颗粒的蒸发沉积提供一个洁净的表面，将 24 × 30 mm 的光学硼硅酸盐玻璃盖玻片（厚度 0.16−0.19 mm）放入 Coplin 染色缸的槽状插件中进行清洗。
    注意：确保盖玻片直立放置并彼此分开，以便在清洗过程中所有表面均能充分暴露。
  2. 向染色缸中倒入足量丙酮以浸没盖玻片，盖上盖子，在 40 °C 下超声处理 10 分钟。
  3. 倒出丙酮，通过向染色缸中注满蒸馏 H2O 并倾倒出水的方式冲洗盖玻片。重复此步骤 2 次。
  4. 重复一次丙酮超声清洗（步骤 1.2 和 1.3）。
  5. 向染色缸中加入足量 200 mM KOH 溶液以浸没盖玻片，盖上盖子，在 40 °C 下超声处理 20 分钟。
    注意：KOH 会轻微腐蚀玻璃表面。
  6. 用蒸馏 H2O 冲洗盖玻片 6 次。
  7. 加入乙醇以浸没盖玻片，盖上盖子，在 40 °C 下超声处理 10 分钟。
  8. 用蒸馏 H2O 冲洗盖玻片 3 次。
  9. 使用镊子轻轻夹住每片盖玻片的边缘，用 N2 气体吹干。仅接触盖玻片边缘。将每片干燥且清洁的盖玻片分别放入独立的洁净培养皿中。

2. 聚苯乙烯微球的蒸发沉积

  1. 为制备ZMW阵列的胶体晶体掩模，将50 µL直径为1 µm、未功能化的聚苯乙烯微球（水中质量体积浓度2.5%）在25 °C条件下以15,000 × g离心5分钟。
    注意：在移液前，应短暂涡旋震荡原液，以防微球沉降至瓶底。
  2. 弃去上清液，尽可能减少残留水分。
    注意：残留水分可能改变乙醇重悬液的蒸发特性39，因此为彻底去除水分而损失少量微球是可以接受的。
  3. 将步骤2.2中的微球用50 µL体积比为1:400的TritonX-100:乙醇溶剂重悬。反复吹打数次，确保微球与溶剂充分混合。
    注意：TritonX-100:乙醇溶剂使用后应以封口膜密封，且每月需新鲜配制一次。微球容易粘附在塑料容器（如微量离心管）壁上，因此吹打时应沿管壁操作，确保所有微球均被重悬。
  4. 为建立用于沉积的湿度室，将6个培养皿依次排放在实验台上，每个培养皿内放置一片盖玻片，皿盖略微打开。将每个培养皿中的盖玻片移至开口区域，以便在下一步增加湿度时使盖玻片暴露于环境中。
  5. 将湿度计和一个小型电风扇置于培养皿后方中央位置。
  6. 记录实验室初始相对湿度（RH）。取一个200 mL烧杯，加入150−200 mL约75 °C的热水，并将其放置在风扇后方。
  7. 开启风扇，并用一个倒置的透明塑料收纳箱（66 cm × 46 cm × 38 cm）将培养皿、风扇、烧杯和湿度计全部罩住。
  8. 使湿度室内相对湿度升至70−75%，通常需要5−10分钟。
    注意：若实验室环境相对湿度较低（低于约50%），可使湿度室达到更高的相对湿度，但不得超过80%，以补偿沉积过程中湿度的损失（见下文）。
  9. 当相对湿度达到70−75%时，记录湿度值，并略微抬起塑料收纳箱，迅速盖上各培养皿的皿盖，以防止盖玻片过度湿润。
    注意：由于加湿作用，湿度室内的温度会略高于室温，通常为25−26 °C。若在盖玻片表面观察到明显水汽，则表明玻璃表面过湿。使用商用手套箱可能简化本步骤操作。
  10. 继续使湿度室内的相对湿度升至85%。达到后，记录湿度室内的相对湿度，并将5 µL微球悬液滴加至每片盖玻片的中心位置。
  11. 每次沉积后立即关闭湿度室和培养皿，以尽量减少湿度损失。目标是在2分钟内完成全部6次沉积。
  12. 沉积完成后记录湿度室内的相对湿度。
    注意：沉积后的相对湿度有助于评估沉积过程中湿度损失的速度，该速度取决于实验室环境条件。在典型的成功实验中，沉积前湿度室的相对湿度为85%，沉积后降至70−75%。
  13. 让微球液滴铺展并干燥5分钟。
    注意：若胶体晶体中存在大量孔洞或多层区域，则分别表明湿度室可能过于潮湿或过于干燥。应调整关闭培养皿并开始沉积时的相对湿度（优化方法详见结果部分讨论）。

3. 通过珠粒退火减小胶体晶体模板的孔径

  1. 为了在聚苯乙烯微球退火过程中提供均匀的温度表面，从而缩小微球之间的孔隙并使孔隙的角落变圆，将一块平整的铣削铝板放置在标准陶瓷加热板上。
  2. 将加热板的温度设定为107 °C，即聚苯乙烯的玻璃化转变温度40。
    注意：为获得稳定且准确的温度，将热电偶探头插入铝板中一个宽2−3 mm、深4−5 mm的孔内。
  3. 将带有微球模板的盖玻片放置在加热的铝板上，退火20秒（退火时间的解释见讨论部分）。
  4. 加热后，立即将盖玻片从铝板上取下，并迅速放置在另一块室温铝板表面以进行冷却。
    注意：为便于取用盖玻片，可使盖玻片略微悬出铝板边缘，或在铝板上铣出浅槽（参见配套视频）。

4. 利用胶体晶体模板进行铝零模波导的纳米制造

  1. 采用热蒸发或电子束蒸发沉积法，在胶体晶体模板上以2 Å/s的速率沉积300 nm厚的铜，使铜在微球之间的间隙处形成柱状结构。
  2. 用胶带轻轻按压珠子表面，去除珠子上方多余的金属。缓慢揭下胶带，以带走金属。
    注意：贴附剥离后，可能仍残留少量反光的多余金属小斑块，这些斑块通常可用氮气流去除2 气体。如果撕去胶带后仍有大量反光的多余金属残留，可尝试将模板浸泡在甲苯中2小时，以部分溶解聚苯乙烯微球。用蒸馏水清洗盖玻片，并用N₂吹干2，并重复胶带剥离步骤。额外的浸泡时间不应完全溶解微珠，因为微珠可在胶带剥离过程中保护微柱免受损伤。
  3. 将聚苯乙烯微球模板放入甲苯中，浸泡过夜以溶解微球。
    警告：甲苯蒸气可能具有毒性。使用甲苯时应在通风良好的通风橱中操作，并佩戴个人防护装备，包括手套、护目镜和实验服。甲苯应储存于专用于易燃液体的通风柜中。
  4. 甲苯孵育后，先用氯仿冲洗模板一次，再用乙醇冲洗两次。此时需小心操作盖玻片，因为已暴露出高度为200−300 nm的精细金属柱结构。用N₂吹干模板2 并在氧气等离子清洗机中处理30分钟，以去除残留的聚合物和污染物。
    警告：氯仿蒸气可能有毒。使用氯仿时应在通风良好的通风橱中操作，并佩戴个人防护装备，包括手套、护目镜和实验服。氯仿应储存于通风柜中，远离其他易燃溶剂。
  5. 采用热蒸发或电子束蒸发沉积法，在铜柱及其周围表面先以1 Å/s的速率沉积3 nm的钛粘附层，再以4 Å/s的速率沉积100−150 nm的铝层。
    注意：可以使用更厚的包层以获得更深的导光通道和更优的背景荧光衰减效果，但这也会降低后续步骤中曝光并溶解支柱后的产率（见讨论部分）。
  6. 为了溶解金属柱，将盖玻片浸泡在铜蚀刻剂（基于柠檬酸）中 材料表2小时。
    警告：金属蚀刻剂可导致皮肤灼伤。使用蚀刻剂时应在通风良好的通风橱中操作，并穿戴防护装备。接触后需彻底清洗双手。金属蚀刻剂应储存于专用于腐蚀性液体的通风柜中。
  7. 用蒸馏水冲洗盖玻片，然后用 N 干燥2，用镜头纸轻轻擦拭金属包层表面，以暴露仍被包层覆盖的微柱。将盖玻片重新放入铜蚀刻液中处理2小时，随后再次用蒸馏水冲洗，并用N₂吹干2.
    注意：ZMW 载玻片应存放于带盖的洁净培养皿中，以避免污染。

5. 利用胶体晶体模板进行金零模波导的纳米制造

注意：本节提供了制造金ZMWs的方法（补充图1），该方法与制造铝ZMWs的方案类似。

  1. 使用热蒸发或电子束蒸发沉积方法，以 1 Å/s 的速率沉积 3 nm 的钛粘附层，随后以 4 Å/s 的速率沉积 300 nm 的铝层。
  2. 用胶带轻轻按压表面以去除珠子顶部多余的金属，然后缓慢剥离胶带，将金属拉下。
  3. 为溶解聚苯乙烯珠子，将珠子模板放入甲苯中，浸泡过夜。
  4. 甲苯孵育后，用氯仿冲洗模板一次，再用乙醇冲洗两次。用 N2 吹干模板，并在氧气等离子体清洗仪中处理 30 分钟，以去除残留的聚合物污染物。
  5. 使用热蒸发或电子束蒸发沉积方法，以 5 Å/s 的速率在铝柱周围及顶部沉积 100−150 nm 的金层。
  6. 为溶解金属柱，将盖玻片浸泡于铝刻蚀液（基于磷酸；材料表）中 1 小时。
  7. 用去离子水冲洗盖玻片，用 N2 吹干，然后用镜头纸轻轻擦拭金属包覆层表面，以暴露仍被包覆的柱体。将盖玻片再次放入铝刻蚀液中 1 小时，然后用去离子水冲洗并用 N2 吹干。
    注意：ZMW 载片应存放于带盖的洁净培养皿中。

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结果

通过蒸发沉降法使聚苯乙烯胶体微粒自组装（步骤 2.1−2.13）可能产生多种结果，因其需要控制溶剂的蒸发速率。然而，由于沉积过程较快（每轮 10−15 分钟），该方法可快速针对不同的实验室环境条件进行优化。 图3A 显示沉积和蒸发后形成的良好胶体模板。宏观上，微球区域呈圆形，边界由不透明的多层微球环界定。图像中半透明但非白色的区域即为理想的单层区域。 图3B 显示在过湿环境（培养皿密闭时相对湿度为80% RH）中制备的胶体模板。此类模板通常边界不规则，呈非圆形，且向外延伸出多层须状结构。虽然沉积效果尚可，可用于后续步骤，但晶格中的孔洞会减少可用于单分子成像的零模波导（ZMW）阵列区域数量。 图 3C 显示的是在过于干燥的环境（培养皿密闭时为65%相对湿度）中制备的胶体模板。与理想的、充分铺展的模板相比，这些模板通常直径较小。虽然仍可用于沉积，但其向内延伸的多层白色条纹区域会减少可用于成像的有效面积。因此，我们不建议一次进行超过6次沉积，因为在沉积过程后期，由于...

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讨论

在胶体自组装（方案第2部分）中，使用乙醇而非水作为悬浮溶剂可加快蒸发过程，使模板在沉积后2−3分钟内即可完成，而此前方法则需1−2小时48,49。本文所介绍的蒸发沉降方案也比以往需要控制表面倾斜度、温度及悬浮液上方空气体积的沉降方案更为简便49,50,51。本方案中使用的颗粒体积分数为2.4%，高于以往沉降方法中使用的0.2−0.5%，后者通常将胶体重新悬浮于水-甘油混合物中以实现更长的沉降时间尺度48。然而，沉积质量对颗粒体积分数的变化具有较强耐受性，已有研究发现该参数可在2−10%范围内变动49,50,51

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了以下资助：NIH 基金 R01GM080376、R35GM118139 以及 NSF 机械生物学工程中心 CMMI: 15-48571（授予 Y.E.G.），以及 NIAID 预博士 NRSA 奖学金 F30AI114187（授予 R.M.J.）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1. 盖玻片清洗
丙酮Sigma322011 L
Coplin 玻璃染色缸Fisher Scientific08-817带8个凹槽并配有模制玻璃盖的染色缸
盖玻片VWR48404-46724 mm × 30 mm（No.1½，矩形）
乙醇SigmaE70231 L
KOHSigma30603氢氧化钾
培养皿Fisher ScientificR80115TS直径100 mm，深度15 mm
超声波清洗仪BransonZ245143台式超声波清洗器，5510
2. 聚苯乙烯微球的蒸发沉积
透明储存容器Fisher Scientific50-110-822226 × 18 × 15 英寸
桌面风扇O2CoolFD05001A任何小型桌面（约5英寸）风扇均可使用
玻璃烧杯Fisher Scientific02-555-25B250 mL
湿度计Fisher Scientific11-661-19
微量离心管Fisher Scientific21-402-9031.5 mL
聚苯乙烯微球Polysciences18602-15直径1.00 µm，未功能化
Triton X-100 去污剂SigmaX100100 mL
3. 胶体晶体模板中微球退火以减小孔径
铝板Fisher ScientificAA11062RY自行定制为14 cm × 14 cm
陶瓷加热板Fisher ScientificHP8885710013 × 8.2 × 3.8 英寸
温度控制器McMaster-Carr38615K71使用热电偶探头读取温度
热电偶探头McMaster-Carr9251T93K型，表面探头
4/5. 利用胶体晶体模板进行零模波导的纳米制造
铝蚀刻剂TranseneType A
铝颗粒Kurt J. LeskerEVMAL40QXHB用于电子束蒸发
氯仿Sigma2883061 L
铜蚀刻剂Transene49-1
铜颗粒Kurt J. LeskerEVMCU40QXQA用于电子束蒸发
金颗粒Kurt J. LeskerEVMAUXX40G用于电子束蒸发
镜头纸ThorlabsMC-5
等离子清洗仪Harrick PlasmaPDC-32G
透明胶带StaplesMMM119
薄膜沉积系统Kurt J. LeskerPVD-75台式热蒸发系统也可使用
钛颗粒Kurt J. LeskerEVMTI45QXQA用于电子束蒸发
甲苯Sigma2445111 L
代表性结果
COMSOL Multiphysics 建模软件COMSOL, Inc.
双视图光谱分光器Photometrics, Inc.

参考文献

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勘误


Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 8/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Colloidal crystal patterns, optical micrographs, grain structure, diffraction patterns, scale bars.
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Colloidal crystal diffraction patterns and SEM images; microscopy analysis of photonic structures.
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

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