需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

研究香烟烟雾对肺上皮细胞中Pseudomonas感染的影响

5.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61163

⸱

2020年5月11日

 ,  ,  , 
1Acute Lung Injury Center of Excellence, Pulmonary, Allergy, Critical Care Medicine, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

本文内容

摘要

本文介绍了一种研究香烟烟雾提取物如何影响肺上皮细胞中细菌定植的实验方案。

摘要

吸烟是肺气肿和慢性阻塞性肺疾病（COPD）的主要病因。吸烟还会增加呼吸系统对细菌感染的易感性。然而，吸烟对人肺上皮细胞中细菌感染的影响尚未得到充分研究。本文描述了一种制备香烟烟雾提取物（CSE）、处理人肺上皮细胞并进行细菌感染及感染检测的详细实验方案。CSE采用常规方法制备。肺上皮细胞用4% CSE处理3小时。随后，用感染复数（MOI）为10的Pseudomonas感染经CSE处理的细胞。通过三种不同方法测定细胞内的细菌载量。结果表明，CSE可增加肺上皮细胞中Pseudomonas的细菌载量。因此，该方案为研究香烟烟雾对肺上皮细胞细菌感染的影响提供了一种简单且可重复的方法。

引言

吸烟对全球数百万人的公共健康造成影响。据报道，许多有害疾病，包括肺癌和慢性阻塞性肺疾病（COPD），均与吸烟有关1,2。吸烟会增加呼吸系统对急性微生物感染的易感性3,4,5。此外，越来越多的证据表明，吸烟会加剧多种慢性疾病的发病过程6,7,8。例如，吸烟可能增加导致COPD急性加重的病毒或细菌感染风险9。在导致COPD急性加重的细菌病原体中，一种机会性革兰氏阴性杆菌病原体Pseudomonas aeruginosa所引起的感染与不良预后和更高的死亡率相关10,11。COPD急性加重通过加速病理进展而使病情恶化。目前除对症治疗外，尚无有效疗法可对抗COPD急性加重12。COPD急性加重会增加患者死亡率，降低生活质量，并加重社会经济负担13。

呼吸道是一个开放系统，持续暴露于外界存在的各种微生物病原体。机会性细菌病原体通常在上呼吸道被检测到，但有时也会出现在下呼吸道14,15。在动物模型中，感染后1小时即可在肺泡囊中检测到P. aeruginosa16。作为主要的防御机制，巨噬细胞或中性粒细胞等免疫细胞可清除呼吸道中的细菌。肺上皮细胞作为第一道生理屏障，在宿主抵御微生物感染过程中发挥独特作用。肺上皮细胞可在不依赖免疫细胞的情况下调节微生物的侵入、定植或复制17。上皮细胞中存在的一些分子（包括PPARg）具有抗菌功能，从而调控细菌在肺上皮细胞中的定植与复制18。吸烟可能改变这些分子并损害肺上皮细胞的正常防御功能19,20。近期研究报道，可使用机器人吸烟装置将香烟烟雾直接暴露于肺上皮细胞21,22。然而，烟雾暴露也可通过其他方式进行，包括应用香烟烟雾提取物（CSE）。制备CSE是一种可重复的方法，也可应用于其他细胞类型，例如间接暴露于香烟烟雾的血管内皮细胞。

本报告描述了一种制备香烟烟雾提取物以改变肺上皮细胞中细菌载量的实验方案。香烟烟雾提取物（CSE）可增加P. aeruginosa的细菌载量，这可能有助于解释慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性加重期间常见的细菌感染复发现象。CSE的制备采用常规方法。处于对数生长期的肺上皮细胞用4% CSE处理3小时。 alternatively，单层培养的肺上皮细胞也可在气液界面直接暴露于香烟烟雾中。经CSE处理的细胞随后以感染复数（MOI）为10的条件接种Pseudomonas。细菌在特定振荡速度下增殖，以确保其鞭毛形态完整，从而保持完全的侵袭能力。使用庆大霉素杀灭培养基中残留的细菌，从而减少后续测定细菌载量时可能发生的污染。该方案还使用了 荧光蛋白标记的Pseudomonas，该标记菌株已被 作为 研究不同模型中Pseudomonas感染的一种有力工具。代表性菌株为P. fluorescens Migula23。CSE处理后的感染程度或细菌载量通过三种方法测定：平板菌落计数法、采用Pseudomonas特异性16S rRNA引物的定量PCR，或对感染荧光标记Pseudomonas的细胞进行流式细胞术分析。该方案是一种简单且可重复的研究香烟烟雾对肺上皮细胞中细菌感染影响的方法。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 100% CSE 的制备

  1. 用60 mL注射器吸取10 mL无血清细胞培养基（BEAS-2B细胞使用DMEM/F12培养基；HSAEC细胞使用气道上皮细胞基础培养基）。
  2. 将适当修剪过的1 mL移液器吸头反向连接至注射器喷嘴，作为适配器以固定香烟（3R4F）。
  3. 移除香烟的滤嘴，将香烟连接至吸头适配器并点燃燃烧。
  4. 将40 mL含烟气的空气抽入10 mL无血清培养基中，通过剧烈震荡混合烟气与培养基（每次抽吸后震荡30秒）。
  5. 在约7分钟内重复步骤1.4约11次，直至香烟完全燃尽。
  6. 使用0.22 µm滤器过滤10 mL烟气处理过的培养基，以去除所有微生物和不溶性颗粒，转移至密闭无菌管中。CSE（香烟烟气提取物）应在后续实验前不超过30分钟内配制完成。

2. Pseudomonas 培养

  1. 接种冻存的 P. aeruginosa （菌株 PAO1）或 P. fluorescens Migula （菌株 PAO143）接种于胰蛋白胨大豆肉汤中 在37 °C下过夜培养的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）琼脂平板。
    注意：为了获得足够的细菌用于培养，应尽可能多地将细菌涂布于TSB琼脂平板上。
  2. 收集细菌涂片，加入含5%甘油作为碳源的20 mL TSB中孵育。
  3. 在37 °C摇床培养箱中以200 rpm振荡细菌悬液1小时，直至OD600 value = 0.6。
    注意：振荡速度不得超过 200 rpm。过高的振荡速度可能破坏细菌鞭毛的形态，并影响细菌对肺上皮细胞的侵袭能力。同样，振荡时间应限制在 1 h 内，以获得高侵袭性的细菌。测定 OD600 用于估算细菌数量的值。OD600 = 1 对应于约 109 菌落形成单位（CFU）/mL

3. 人肺上皮细胞培养及CSE处理

  1. 按照先前描述的方法24，在HITES培养基（500 mL DMEM/F12，2.5 mg胰岛素，2.5 mg转铁蛋白，2.5 mg亚硒酸钠，2.5 mg转铁蛋白，10 μM氢化可的松，10 μM β-雌二醇，10 mM HEPES和2 mM L-谷氨酰胺）中培养人 BEAS-2B细胞，并添加10%胎牛血清（FBS）。
  2. 在气道上皮细胞培养基（500 mL气道细胞基础培养基，500 µg/mL HSA，0.6 µM亚油酸，0.6 µg/mL卵磷脂，6 mM L-谷氨酰胺，0.4% P提取物，1.0 µM肾上腺素，5 µg/mL转铁蛋白，10 nM T3，1 µg/mL氢化可的松，5 ng/mL重组人EGF和5 µg/mL重组人胰岛素）中培养人原代小气道上皮细胞（HSAEC）。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下孵育。
  3. 加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化5分钟，直至细胞完全从培养板底部脱落。
  4. 加入10 mL完全HITES培养基以中和胰蛋白酶，并将细胞收集至15 mL离心管中。在4 °C、300 x g条件下离心5分钟。
    注意：需在显微镜下密切监测胰蛋白酶消化时间，过度消化可能导致细胞死亡。
  5. 弃去上清液，将细胞重悬于2 mL含10% FBS的HITES培养基中。
  6. 取上述细胞悬液10 µL滴加至培养板中，插入自动细胞计数仪，测定细胞浓度（单位：个/mL）。
  7. 将BEAS-2B细胞以3 × 105 个/mL的浓度接种于6孔板中，每孔总体积为2 mL，培养基为含10% FBS的HITES培养基，过夜培养。
  8. 当细胞融合度达到约80%，或细胞浓度为5 x 105 个/mL时，用4% CSE处理细胞3小时。CSE处理前，更换为含1% FBS的HITES培养基。

4. 细菌感染

  1. 向CSE处理的细胞各孔中加入P. aeruginosa或P. fluorescens Migula （约1 × 107 CFU/mL），在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。
  2. 吸除上清液，每孔加入2 mL新鲜HITES培养基，同时加入4% CSE和100 µg/mL庆大霉素。
    注：使用庆大霉素是因为其无法穿透人肺上皮细胞膜，因此可杀死培养基中的所有细菌，但不能杀死已侵入肺上皮细胞内的细菌。
  3. 在37 °C、5% CO2条件下经CSE/庆大霉素处理1小时后，吸除上清液，并用PBS洗涤细胞3次，用于后续细菌浓度测定。
    注：为确认细菌是否被细胞内化，使用荧光显微镜观察感染GFP标记的P. fluorescens Migula 的细胞。

5. 采用涂布平板法测定细菌浓度

  1. 采用滴板法测定感染细胞中的细菌载量时，用 2 mL 冷 PBS 将经庆大霉素处理的细胞洗涤 2 次。
  2. 向每个孔中加入 1 mL 细胞裂解缓冲液（含 0.5% Triton X-100 的 PBS）。
  3. 将含有内化细菌的细胞裂解液进行梯度稀释（1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000），用于后续接种至 TSB 琼脂平板。
  4. 经 16 小时培养后，通过计数细菌菌落获得 CFU 结果。

6. 细菌16S rRNA的RT-qPCR检测

  1. 按照上述方法，用庆大霉素处理铜绿假单胞菌（Pseudomonas）感染的肺上皮细胞（约 1 × 106 个细胞/mL）。吸除培养基，并用 2 mL 冷 PBS 洗涤细胞 2 次。
  2. 向 6 孔板的每孔中加入 0.35 mL 异硫氰酸胍裂解缓冲液。用细胞刮收集细胞，将裂解液用移液器转移至微量离心管中，并轻轻吹打混匀。
  3. 向裂解液中加入等体积（0.35 mL）新配制的 70% 乙醇，充分混匀。将所有样品转移至置于 2 mL 收集管中的离心柱中，在 20–25 °C 下以 10,000 × g 离心 30 秒，随后弃去收集管中的废液。
  4. 用 0.7 mL 洗涤缓冲液 1 洗涤离心柱，在 10,000 × g 下离心 30 秒。再用 0.5 mL 洗涤缓冲液洗涤膜结合的 RNA 2 次，每次均在 10,000 × g 下离心 2 分钟。
  5. 将离心柱转移至新的 1.5 mL 收集管中，加入 30–50 µL 无 RNase 水，在 10,000 × g 下离心 1 分钟。收集穿流液并测定 RNA 浓度。
  6. 根据制造商说明书进行逆转录反应。将 1 µg 总 RNA 与 10 µL 反应缓冲液、1 µL 逆转录酶及无 RNase 水混合，总体积为 20 µL。在 37 °C 反应 1 小时，随后在 95 °C 反应 5 分钟。
  7. 将上述逆转录反应所得 cDNA 模板（各取 1 µL）、含 SYBR 染料的 Master Mix 5 µL、各 1 µL 的 200 nM 特异性引物以及水混合，总体积为 20 µL，用于后续 PCR 分析，具体操作遵循制造商推荐。
    注：以下为靶向铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）16S rRNA 的引物序列：上游引物 5′-CAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3′；下游引物 5′-TAAGATCTCAAGGATCCCAACGGC-3′。GAPDH 作为上样对照，引物序列为：上游引物 5′-GGCATGGACTGGTCATGA-3′；下游引物 5′-TTCACCATGGAGAAGGC-3′。
  8. 采用相对 CT 法（comparative CT method）确定基因表达水平。

7. 荧光检测 假单胞菌 通过流式细胞术

  1. 处理上述荧光 假单胞菌感染的肺上皮细胞（约 1 x 106 细胞/mL），并按先前所述加入庆大霉素。吸去培养基，用 2 mL 冷 PBS 洗涤细胞 2 次。
  2. 使用流式细胞仪在509 nm波长下检测GFP，每次检测以100,000次计数为终止点。使用相关软件分析所获得的数据。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

使用示意图来说明该实验方案 图1肺上皮BEAS-2B细胞经CSE处理后进行挑战 假单胞菌. 假单胞菌 培养基中的细菌被添加的庆大霉素杀死，随后细胞进行滴板法检测和RT-qPCR检测 假单胞菌 核糖体16S RNA，以及流式细胞术。与对照组相比，CSE处理在滴板法中显著增加了细菌感染图2）。相应地，CSE 影响了人小气道上皮细胞（HSAEC）中的细菌载量（图3）。细胞在4% CSE处理3小时后活力未发生显著变化，在1小时时 假单胞菌 感染，或经 1 h 的庆大霉素处理（图4 图5 图6）。以16S rRNA为靶标的RT-qPCR方法（图7）以及流式细胞术（...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

细菌侵入肺上皮细胞是细菌感染致病过程中的关键步骤。细菌侵入细胞的过程可分为以下三个步骤：首先，细菌利用其鞭毛接触并黏附于上皮细胞表面；其次，细菌通过内吞作用或直接穿透细胞膜进入细胞内；最后，若细菌成功逃逸细胞防御机制，则可在细胞内复制并定植25,26。尽管针对肺泡巨噬细胞中细菌感染的观察方法已发展多年，但对肺上皮细胞的相关研究仍较为有限27,28。本研究通过三种方法测定肺上皮细胞内的细菌载量：倾注平板法、针对Pseudomonas核糖体16S RNA的RT-qPCR检测，以及流式细胞术。这三种方法均具有相似的灵敏度且效果良好。选择何种方法测定肺上皮细胞中的细菌载量，取决于实验设备的可及性和时间因素。在这些实验中，保持细菌鞭毛的完整性和未受损状态对于成功感染肺上皮细胞至关重要29。较短时间且有限速度的振荡处理可能有助于进一步增强细菌的侵袭能力...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作部分由美国国立卫生研究院R01基金HL125435和HL142997（资助对象：CZ）支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
50 mL 注射器BD Biosciences
气道上皮细胞基础培养基ATCCPCS-300-030
细菌摇床ThermoFisher Scientific
支气管上皮细胞生长试剂盒ATCCPCS-300-040
细胞计数仪Bio-Rad
CFX96 实时荧光定量 PCR 系统Bio-Rad
高容量 RNA 反转录为 DNA 试剂盒ThermoFisher Scientific4387406
HITES 培养基ATCCATCC 30-2004
人 BEAS-2B 细胞ATCCATCC CRL-9609
人原代小气道上皮细胞ATCCATCC PCS-300-030
LSRII 流式细胞仪BD Biosciences
Nikkon 共聚焦显微镜Nikkon
OD 读数仪USA Scientific
PCR 引物ITD
Pseudomonas aeruginosaATCCATCC 47085PAO1-LAC
Pseudomonas fluorescens MigulaATCCATCC 27853P.aeruginosa GFP
科研级香烟 (3R4F)肯塔基大学TP-7-VA
RNeasy Mini 试剂盒Qiagen74106
透明 PET Transwell 小室Corning Costar
胰蛋白胨大豆肉汤BD Biosciences

参考文献

  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. Risk factors for lung cancer worldwide. European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).
  3. Lugade, A. A., et al. Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection. Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).
  4. Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review. International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).
  5. Zuo, L., et al. Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).
  6. Morse, D., Rosas, I. O. Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema. Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).
  7. Rigotti, N. A., Clair, C. Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor. European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).
  8. Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).
  9. Papi, A., et al. Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).
  10. Garcia-Vidal, C., et al. Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study. European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).
  11. Murphy, T. F., et al. Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).
  12. Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).
  13. Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. Exacerbations of COPD. International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).
  14. Sethi, S. Bacterial infection and the pathogenesis of COPD. Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).
  15. Weinreich, U. M., Korsgaard, J. Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease. Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).
  16. Hook, J. L., et al. Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury. Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).
  17. Ross, K. F., Herzberg, M. C. Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection. Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).
  18. Bedi, B., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa. FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).
  19. Tomita, K., et al. Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).
  20. Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection. PLoS One. 8 (1), 51784(2013).
  21. Thorne, D., Adamson, J. A review of in vitro cigarette smoke exposure systems. Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).
  22. Keyser, B. M., et al. Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system. Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).
  23. Del Arroyo, A. G., et al. NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils. EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).
  24. Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron. Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).
  25. Bauman, S. J., Kuehn, M. J. Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells. BMC Microbiology. 9, 26(2009).
  26. Ichikawa, J. K., et al. Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).
  27. Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays. Microbiologyopen. 7 (2), 00588(2018).
  28. Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).
  29. Feldman, M., et al. Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection. Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).
  30. Zhou, Y., et al. Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient. Molecules. 23 (1), 125(2018).
  31. Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. Aminoglycosides: activity and resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).
  32. Chen, Y., et al. Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats. European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).
  33. Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. Animal models for anti-emphysema drug discovery. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).
  34. Wang, Q., et al. A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells. Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).
  35. Amatngalim, G. D., et al. Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence. European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009(2018).
  36. Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling. Biomaterials. 113, 118-132 (2017).
  37. Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

PCR RNA
研究香烟烟雾对肺上皮细胞中Pseudomonas感染的影响
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。