本文介绍了一种研究香烟烟雾提取物如何影响肺上皮细胞中细菌定植的实验方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
吸烟是肺气肿和慢性阻塞性肺疾病（COPD）的主要病因。吸烟还会增加呼吸系统对细菌感染的易感性。然而，吸烟对人肺上皮细胞中细菌感染的影响尚未得到充分研究。本文描述了一种制备香烟烟雾提取物（CSE）、处理人肺上皮细胞并进行细菌感染及感染检测的详细实验方案。CSE采用常规方法制备。肺上皮细胞用4% CSE处理3小时。随后，用感染复数（MOI）为10的Pseudomonas感染经CSE处理的细胞。通过三种不同方法测定细胞内的细菌载量。结果表明，CSE可增加肺上皮细胞中Pseudomonas的细菌载量。因此，该方案为研究香烟烟雾对肺上皮细胞细菌感染的影响提供了一种简单且可重复的方法。
引言
吸烟对全球数百万人的公共健康造成影响。据报道，许多有害疾病，包括肺癌和慢性阻塞性肺疾病（COPD），均与吸烟有关1,2。吸烟会增加呼吸系统对急性微生物感染的易感性3,4,5。此外，越来越多的证据表明，吸烟会加剧多种慢性疾病的发病过程6,7,8。例如，吸烟可能增加导致COPD急性加重的病毒或细菌感染风险9。在导致COPD急性加重的细菌病原体中，一种机会性革兰氏阴性杆菌病原体Pseudomonas aeruginosa所引起的感染与不良预后和更高的死亡率相关10,11。COPD急性加重通过加速病理进展而使病情恶化。目前除对症治疗外，尚无有效疗法可对抗COPD急性加重12。COPD急性加重会增加患者死亡率，降低生活质量，并加....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 100% CSE 的制备
- 用60 mL注射器吸取10 mL无血清细胞培养基（BEAS-2B细胞使用DMEM/F12培养基；HSAEC细胞使用气道上皮细胞基础培养基）。
- 将适当修剪过的1 mL移液器吸头反向连接至注射器喷嘴，作为适配器以固定香烟（3R4F）。
- 移除香烟的滤嘴，将香烟连接至吸头适配器并点燃燃烧。
- 将40 mL含烟气的空气抽入10 mL无血清培养基中，通过剧烈震荡混合烟气与培养基（每次抽吸后震荡30秒）。
- 在约7分钟内重复步骤1.4约11次，直至香烟完全燃尽。
- 使用0.22 µm滤器过滤10 mL烟气处理过的培养基，以去除所有微生物和不溶性颗粒，转移至密闭无菌管中。CSE（香烟烟气提取物）应在后续实验前不超过30分钟内配制完成。
2. Pseudomonas 培养
- 接种冻存的 P. aeruginosa （菌株 PAO1）或 P. fluorescens Migula （菌株 PAO143）接种于胰蛋白胨大豆肉汤中 在37 °C下过夜培养的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）琼脂平板。
注意：为了获得足够的细菌用于培养，应尽可能多地将细菌涂布于TSB琼脂平板上。 - 收集细菌涂片，加入含5%甘油作为碳源的20 mL T....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
使用示意图来说明该实验方案 图1肺上皮BEAS-2B细胞经CSE处理后进行挑战 假单胞菌. 假单胞菌 培养基中的细菌被添加的庆大霉素杀死，随后细胞进行滴板法检测和RT-qPCR检测 假单胞菌 核糖体16S RNA，以及流式细胞术。与对照组相比，CSE处理在滴板法中显著增加了细菌感染图2）。相应地，CSE 影响了人小气道上皮细胞（HSAEC）中的细菌载量（图3）。细胞在4% CSE处理3小时后活力未发生显著变化，在1小时时 假单胞菌 感染，或经 1 h 的庆大霉素处理（图4 图5 图6）。以16S rRNA为靶标的RT-qPCR方法（图7）以及流式细胞术（.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
细菌侵入肺上皮细胞是细菌感染致病过程中的关键步骤。细菌侵入细胞的过程可分为以下三个步骤：首先，细菌利用其鞭毛接触并黏附于上皮细胞表面；其次，细菌通过内吞作用或直接穿透细胞膜进入细胞内；最后，若细菌成功逃逸细胞防御机制，则可在细胞内复制并定植25,26。尽管针对肺泡巨噬细胞中细菌感染的观察方法已发展多年，但对肺上皮细胞的相关研究仍较为有限27,28。本研究通过三种方法测定肺上皮细胞内的细菌载量：倾注平板法、针对Pseudomonas核糖体16S RNA的RT-qPCR检测，以及流式细胞术。这三种方法均具有相似的灵敏度且效果良好。选择何种方法测定肺上皮细胞中的细菌载量，取决于实验设备的可及性和时间因素。在这些实验中，保持细菌鞭毛的完整性和未受损状态对于成功感染肺上皮细胞至关重要29。较短时间且有限速度的振荡处理可能有助于进一步增强细菌的侵袭能力.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作部分由美国国立卫生研究院R01基金HL125435和HL142997（资助对象：CZ）支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 50 mL 注射器 | BD Biosciences | ||
| 气道上皮细胞基础培养基 | ATCC | PCS-300-030 | |
| 细菌摇床 | ThermoFisher Scientific | ||
| 支气管上皮细胞生长试剂盒 | ATCC | PCS-300-040 | |
| 细胞计数仪 | Bio-Rad | ||
| CFX96 实时荧光定量 PCR 系统 | Bio-Rad | ||
| 高容量 RNA 反转录为 DNA 试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES 培养基 | ATCC | ATCC 30-2004 | |
| 人 BEAS-2B 细胞 | ATCC | ATCC CRL-9609 | |
| 人原代小气道上皮细胞 | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII 流式细胞仪 | BD Biosciences | ||
| Nikkon 共聚焦显微镜 | Nikkon | ||
| OD 读数仪 | USA Scientific | ||
| PCR 引物 | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| 科研级香烟 (3R4F) | 肯塔基大学 | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini 试剂盒 | Qiagen | 74106 | |
| 透明 PET Transwell 小室 | Corning Costar | ||
| 胰蛋白胨大豆肉汤 | BD Biosciences |
参考文献
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
