使用自动化冷冻研磨机通过冷冻研磨制备细胞提取物

摘要

我们介绍一种使用低温冷冻研磨机从酵母或其他细胞制备全细胞提取物的可靠方法，该方法可最大程度地减少蛋白质的降解和变性。所获得的细胞提取物适用于功能性蛋白复合物的纯化、蛋白质组学分析、共免疫沉淀实验以及不稳定蛋白质修饰的检测。

摘要

芽殖酵母中遗传操作的简便性及其真核细胞机制的高度进化保守性 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 使其成为一种重要的遗传学模式生物。然而，由于高效的蛋白质分离依赖于细胞的充分破碎，而酵母的细胞壁给其细胞蛋白的生化分析带来了困难：酶解法（使用溶壁酶或zymolyase）成本较高，机械破碎法（使用传统的玻璃珠震荡器、法国压或咖啡研磨机）则难以避免样品升温，进而导致蛋白质变性与降解。尽管在液氮（LN₂）中手动研磨酵母细胞₂) 使用研钵和研杵进行研磨虽可避免样品过热，但劳动强度大，且不同操作者之间的细胞裂解效果存在差异。多年来，我们一直通过在自动冷冻研磨仪中进行低温研磨来成功制备高质量的酵母提取物。使用液氮（LN₂）可达到 -196 °C 的低温环境，₂ 可保护生物材料免受蛋白酶和核酸酶的降解，从而能够回收完整的蛋白质、核酸及其他大分子。本文详细描述了适用于出芽酵母细胞的该技术，包括将细胞悬浮液在裂解缓冲液中逐滴加入液氮中进行冷冻的过程₂ 生成被称为“爆米花”的细胞冻滴，然后在液氮（LN）中将这种“爆米花”研磨成粉末₂ 使用冷冻研磨机将样品研磨成冷冻的“粉末状”提取物，随后缓慢融化，并通过离心澄清以去除不溶性残渣。所得提取物可直接用于后续实验，如蛋白质或核酸纯化、蛋白质组学分析或共免疫沉淀研究。该方法广泛适用于多种微生物、动植物组织、海洋样本（包括珊瑚）的细胞提取物制备，以及法医学和永久冻土化石样本中DNA/RNA的分离。

引言

酵母是蛋白质研究中常用的一种模式生物，作为一种结构简单的真核生物，研究人员可利用丰富的遗传学和生物化学工具对其进行研究¹。由于酵母具有坚固的细胞壁，研究人员面临的一个挑战是如何在不破坏细胞内含物的前提下高效裂解细胞。目前已有多种方法可用于通过裂解酵母细胞来获得蛋白质提取物，包括酶解法（如zymolyase）^2,3、化学裂解法⁴、冻融法等物理裂解法⁵、基于压力的方法（如French press）^6,7、机械法（如玻璃珠、咖啡研磨机）^8,9、超声处理法¹⁰以及低温研磨法^2,11。细胞裂解效率和蛋白质得率会因所采用技术的不同而存在显著差异，从而影响裂解液的最终结果或其在后续实验应用中的适用性。在研究那些不稳定的蛋白质、具有短暂翻译后修饰的蛋白质或对温度敏感的蛋白质时，尤其需要采用一种能够在样品制备过程中最大限度减少样品损失或降解的方法。

提取物制备技术	细节	优势	缺点	下游分析	参考文献
French press：使用Zymolyase进行酶预处理的高压均质器（又称Microfluidizer）	Zymolyase-20T，一种Microfluidizer高压均质器。该破碎仪由气动高压泵（比例1:250；所需气压0.6–1 MPa）和带有附加背压装置的专用破碎室组成。处理样品时最小体积需20 mL。	采用联合方案在95 MPa压力下经过4次处理，最终总破碎率接近100%，而仅使用均质化处理（不加Zymolyase）在相同条件下4次处理的破碎率仅为32%。	不适用于小规模实验。大规模制备时酶的成本可能较高。	蛋白质纯化	6
珠磨破碎仪：经zymolyase处理的细胞在FastPrep仪器中使用玻璃珠进行裂解	向一定体积的裂解缓冲液中的细胞沉淀中加入大致等体积的冰冷、干燥、酸洗过的0.5 mm玻璃珠，通过剧烈的手动振荡破碎细胞。	当需要制备多种不同小型酵母培养物的提取物用于检测分析而非蛋白质纯化时，该方法尤为适用。	在玻璃珠法操作过程中，蛋白质会受到剧烈处理，导致严重起泡，进而引起蛋白质变性。细胞破碎程度不一，同时由于提取物温度超过4 °C可能导致蛋白质发生蛋白水解及修饰。°C，在机械破碎过程中。	主要是 DNA & RNA 分析，以及通过变性凝胶电泳进行的蛋白质分析（无论是否结合蛋白质印迹法）。	8
Zymolyase 处理   随后通过渗透压休克与Dounce匀浆相结合的方法进行裂解	经酶消化细胞壁后，使用贴壁紧密的研杵（间隙1至3）研磨15至20次以裂解原生质球 µm) 在Dounce匀浆器中进行匀浆。	使用蛋白酶缺陷型菌株（如BJ926或EJ101）具有优势。这是破碎酵母细胞最温和的方法，因此最适合制备能够执行复杂酶促功能（如翻译、转录、DNA复制）的提取物，同时可维持大分子结构（如核糖体、剪接体）的完整性。该方法也适用于分离完整的细胞核，可用于染色质研究（Bloom和Carbon，1982）或制备核蛋白提取物（Lue和Kornberg，1987）。	原生质球裂解法的主要缺点是操作相对繁琐且成本较高，尤其对于大规模制备而言（>10 升），且长时间的孵育可能导致蛋白质降解或蛋白质修饰。  对于染色质制备，其质量似乎参差不齐或低于差速离心法所获得的结果（基于核小体梯状条带的完整性）。	分离完整的细胞核用于染色质研究，获取能够执行复杂酶促功能的提取物，以及需要保持完整性的提取物 大分子结构，核蛋白提取物	2
使用研钵/研杵或匀浆器在液氮中研磨速冻细胞以实现细胞破碎	细胞立即在液氮中冷冻，然后在液氮存在下通过研钵和研杵手动研磨，或使用Waring搅拌器进行裂解。	该方案快速简便，可处理不同量的酵母细胞，包括大量培养物。其主要优势在于可将处于活跃生长状态的细胞立即投入液氮（−196 °C）中，从而迅速冷冻，有效防止蛋白质降解和核酸酶活性，确保获得完整且具有生物活性的蛋白质、核酸及其他大分子。°C），可降低蛋白酶、核酸酶以及修饰蛋白质的酶类（如磷酸酶和激酶）的活性。该方法特别适用于从单个酵母培养物制备全细胞提取物，用于大规模蛋白质纯化。	对粗心的研究人员而言，该方法可能较为混乱且存在潜在危险。小样本（即10至100毫升酵母培养物）难以有效处理，因为冻结的细胞团质量不足，无法在搅拌器中有效破碎。逐个处理样本耗时较长，且每次使用后设备清洗繁琐。	用于大规模蛋白质纯化的单次酵母培养物全细胞提取物	2
自溶，珠磨机	pH 5.0，50 °24小时，200转/分钟，4°C Ø 0.5 毫米，5 × 3 分钟/3 分钟	快速高效的裂解，尤其适用于小规模提取物的制备	热量产生会导致大分子变性与降解。需要使用珠磨破碎设备。	小规模分析。	10
自溶，超声处理	pH 5.0，50 °℃，24 小时，200 转/分钟，4 × 5分钟/2分钟，脉冲80%，功率80%	超声波破碎仪通常在大多数机构中都有配备。	产热会导致大分子变性与降解。需要使用超声破碎设备。缓慢裂解可能耗时超过24小时。	酵母细胞壁制备
煮沸与冻融过程	除了标准冷冻机以及加热块或热水浴外，无需其他特殊设备。	高效、可重复、简便且经济。	热量的产生会导致大分子的变性与降解。	通过PCR进行DNA分析。	5

表1： 酵母提取物制备方法的比较。

低温研磨（又称冷冻研磨/冷冻粉碎）是一种常用方法，可可靠地从温度敏感样品中提取核酸、蛋白质或化学物质，用于定量或定性分析。该方法已成功应用于生物技术、毒理学、法医学等多个领域的多种研究。^12,13环境科学，植物生物学¹⁴ 以及食品科学。完整生物大分子的分离通常高度依赖于温度。极低的温度可确保蛋白酶和核酸酶保持非活性状态，从而可靠地分离出完整的蛋白质、核酸及其他大分子，用于后续分析。事实上，冷冻研磨仪通常将样品温度维持在 -196 °C °C（LN₂的沸点）₂从而最大限度地减少DNA/RNA或蛋白质的变性与降解。

冷冻研磨机采用电磁研磨室，通过电磁场快速往复移动研磨罐内的实心金属杆或圆柱体，使样品在不锈钢端塞之间被粉碎。该仪器在研磨室内产生并快速反转磁场。随着磁场来回切换，磁力驱动金属杆将样品反复撞击端塞，从而实现“冷冻研磨”，将细胞“爆米花”粉碎成粉末。冷冻研磨机取代了传统的研钵和研杵，可依次处理多个样品（或同时处理最多4个较小样品），具有高度可重复性，并避免了人工研磨带来的操作者间差异。样品处理完成后，所得细胞提取物可用于多种下游实验应用。

方案

1. 酵母爆米花的制备

1. 在 0.5 L YPD 培养基中培养酵母细胞至密度为 1 × 10⁶ CFU/mL⁷ 细胞/mL。使用库尔特计数器或其他任何方法进行细胞计数。
2. 离心细胞10分钟，2,400 g 4 °C.
3. 每个样品用500 mL冰冻的去离子18兆欧Milli-Q水洗涤一次。
4. 将沉淀重悬于15 mL预冷的裂解缓冲液中[20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, 0.1% Tween, 10%甘油，加入新鲜配制的10 mM β-巯基乙醇、蛋白酶抑制剂混合物] 10 μM 蛋白酶体抑制剂 MG-132、1 mM 去乙酰化酶抑制剂丁酸钠以及磷酸酶抑制剂（1 mM 钒酸钠、50 mM 氟化钠、50 mM β-甘油磷酸钠）。参见 材料表 有关更多细节，请参见相关说明。将重悬的细胞置于冰上，直至样品准备好进行下一步操作。
   注意：根据下游应用，可使用含有多种非离子型去污剂的裂解缓冲液，并根据需要加入特定抑制剂。为防止蛋白质降解，尤其是提取物解冻后发生降解，必须加入蛋白酶和蛋白酶体抑制剂。
5. 使用预冷的血清移液管，将细胞悬液逐滴缓慢加入一个或多个置于干冰上并装有液氮的50 mL离心管中，制备速冻酵母爆米花₂ 直至液面接近管口下方。由于液氮会迅速蒸发，需频繁补充，以维持液面高度。操作时应在通风良好的区域进行，以避免氮气窒息风险。
   1. 使用多个绑在一起的50 mL离心管（或任何具有大口径且可耐受低温的容器，例如大塑料离心瓶）代替单个50 mL离心管，用于爆米花制备。图1A）。容器及其开口越大，越有利于爆米花的制备，因为这可以防止爆米花结块形成大的聚集体。爆米花粒径在0.3–0.5 cm范围内，最适合使用冷冻研磨机进行充分的研磨/粉碎。图1B).
   2. 确保 LN₂ 在将装有爆米花的离心管于 - 储存之前，其中的溶剂已完全蒸发80 °C. 在制备完酵母爆米花后即可停止操作，因其在 -80 °C 下可稳定保存数年80 °C.

图1酵母爆米花制备。（A） 酵母“爆米花”是通过将细胞悬液逐滴加入液氮（LN）中冷冻制备的₂. 我们使用一个至三个用橡皮筋固定在一起的50 mL离心管，置于装有干冰的冰桶中。将离心管中装满液氮（LN）₂ 直至液面接近罐口边缘，并需频繁补充液氮以保持液面接近满溢状态，直至所有细胞悬液均形成爆米花状颗粒B) 爆米花的尺寸是决定最佳研磨效率的重要因素。爆米花的直径应在0.3至0.5 cm之间。 请点击此处以查看此图的放大版本。

2. 冷冻研磨

1. 首先，确保有足够的液氮₂ 可用于冷却冷冻研磨仪、研磨瓶、耗材，并为所有样品的运行提供支持。若样品少于五个，需要 30–35 L 的 LN₂ 应已足够。用液氮（LN₂）填充冷冻研磨机腔室₂ 至刻度线。
   警告：所有涉及LN的步骤₂ 应在通风良好的区域进行操作，冷冻研磨仪本身也应置于该类区域，以避免窒息风险。操作时应穿戴个人防护装备，包括合适的鞋具、实验服、护目镜、内层丁腈手套、外层隔热手套，以及最外层的另一副丁腈手套。处理液氮（LN₂）时需格外小心₂.
2. 缓慢关闭冷冻研磨机盖子，避免液氮飞溅₂ 并让机器冷却几分钟。可能需要向腔室中补充液氮（LN）₂ 以补偿在进行下一步操作前因蒸发造成的损失。
   注意：补充液氮₂ 仅加至液面线为止。切勿过量填充，以免对设备造成损害并引发危险。冷冻研磨机可配备自动补液系统，可根据需要直接从与冷冻研磨机相连的储罐中补充蒸发的液氮（LN2）。
3. 将大型研磨管和磁力撞击杆浸入液氮中进行预冷₂ 保存在单独的小型杜瓦瓶中。将所有液氮倾倒出₂ 当LN₂ 停止冒泡后，将样品/酵母爆米花加入研磨管中，并用两个不锈钢端塞 tightly 密封。
   1. 样品体积不得超过研磨罐容积的三分之一，否则会降低研磨效率。较大的样品可通过分装至两个或多个研磨罐中依次研磨处理。较小的样品（不超过3 mL）可使用较小的研磨罐。
4. 将研磨罐放入冷冻研磨机腔室内并固定到位，盖上盖子。
5. 对于酿酒酵母，以破碎速率为14，总共进行3个循环的研磨，每个循环2分钟（循环间间隔2分钟以冷却）。当仪器完成研磨循环停止运行后，缓慢打开冷冻研磨仪的盖子，小心解锁含有冻干细胞裂解物粉末的离心管，并将其从冷冻研磨仪中取出。若使用多个小离心管，应快速依次取出每个离心管，并立即置于干冰中。
   注意：使用相同类型样品但不同规格的研磨管时，通常无需调整研磨参数。然而，针对不同类型的样品，需根据其裂解难易程度，通过实验经验确定研磨参数，例如循环次数和研磨速率。大多数哺乳动物细胞和软组织在研磨速率为10的条件下，经过1–2个循环即可裂解。较难裂解的样品，如细菌、酵母、果蝇幼虫和成虫，通常需要在最大速率下进行3–6个循环；而骨、牙齿等硬组织可能需要多达10个循环。可在研磨前后，在显微镜下观察少量解冻后的样品，计数完整未裂解细胞的数量，以评估裂解效率。此前已有研究对低温研磨参数对芽殖酵母蛋白质和DNA释放的影响进行了详尽分析。¹⁵.
6. 操作需迅速，以免样品解冻，使用开启工具小心拧开一端的端盖（选择在研磨过程中显得略微松动的一端）。然后，用一对预先在干冰桶中冷却的长镊子取出撞击杆。将研磨管倒置并轻敲，使粉碎后的样品落入已用液氮预冷的聚苯乙烯称量皿中₂ 并置于干冰上保存。
7. 一旦从研磨瓶中回收全部冻干细胞裂解粉末，立即将称量皿中的粉末倒回50 mL离心管中，并立即进行下一步所述的缓慢解冻操作，以获得最佳结果。或者，可将冻存的粉末裂解物在-80 °C下保存过夜80 °C，尽管这可能导致一定程度的降解。
8. 准备一个装有冰水混合物（冰与水体积比为50%）的冰桶，置于磁力搅拌器上。将金属丝网架或其他合适的支架浸入冰水混合物中，用于放置样品。
   1. 然后，将样品置于冰浴中，使用磁力搅拌器持续搅动冰浆，缓慢融化。根据需要添加更多冰块以替换已融化的冰（可能需要丢弃部分水，以防冰桶溢出）。由于多种抑制剂在水相缓冲液中的半衰期较短，需补充蛋白酶抑制剂混合物（参见 材料列表）和 10 μM 在样品开始解冻后（约30分钟后）向裂解液中加入蛋白酶体抑制剂MG-132。
   2. 每5分钟清除试管外壁形成的冰，以加快解冻过程。注意，样品在室温或更高温度下快速解冻可能导致显著降解。
9. 待样本完全解冻后（根据样本量不同，可能需要超过一小时），在预冷的台式离心机中以约 3,220 g 离心 20 分钟 4 °C 去除裂解液中的大部分细胞碎片。
10. 将上清液转移至预冷于冰上的50 mL聚碳酸酯离心管中，在4 °C下以16,000 g离心20 min 4 °C （参见 材料表).
11. 仅缓慢而小心地转移管中液体柱中心的澄清上清液，即澄清的全细胞提取物，避免扰动浑浊的脂质层（图2)，使用预冷的血清移液管转移至预冷的15 mL离心管中。避免完全吸尽离心管中的裂解液，以防止脂质和碎片的转移。离心管中残留的裂解液可多次离心以在每次离心后回收少量提取物。
    注意：脂质以及任何变性的蛋白质会呈现浑浊/乳白色，位于液体/空气界面的顶部，有时会出现在由不溶性细胞碎片组成的沉淀物上方。图2).

图2：离心管中的提取物分层。 显示了细胞在16,000 g条件下离心20分钟后，离心管中全细胞提取物的主要可见特征。各组分的相对丰度取决于样本类型、细胞生长阶段（对数期 versus 稳定期）、用于重悬细胞的裂解缓冲液体积以及裂解效率。请点击此处查看此图的放大版本。

12. 将剩余的裂解液离心5分钟，以回收更多的提取物。如有需要，可重复进行5分钟离心，尽可能回收澄清的提取液。弃去靠近管底沉淀物附近含有脂质的浑浊裂解液。
13. 将这些提取物用于后续应用，如蛋白质复合物纯化、免疫沉淀和蛋白质组学分析。

结果

我们比较了两种不同的酵母细胞裂解方法，即在 4 °C 下进行玻璃珠研磨和在 -196 °C 下进行自动冷冻研磨，以评估两种方法制备的细胞提取物中蛋白质回收率的差异。本研究选用芽殖酵母菌株 YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221])¹⁶，该菌株携带一个高拷贝质粒，可表达串联的 HIS-MYC 标记泛素（HIS-MYC-Ub），以便通过亲和纯化后评估提取物中带标签泛素化蛋白的回收效率。

我们测试了一种快速方案，该方案采用玻璃珠研磨法在 4 °C 下裂解酵母细胞⁹，以及使用冷冻酵母细胞（酵母爆米花）在液氮（LN₂）中...

讨论

研究酵母天然蛋白的一个局限性是由于酵母细胞裂解效率低下所致 其坚固的细胞壁。尽管已开发出多种方法，但在我们实践中最稳定且高效的方法是将酵母细胞快速冷冻成爆米花状后进行冷冻研磨。与其它裂解方法相比，该方法能够可靠地制备出高质量的芽殖酵母全细胞提取物。代表性结果表明，冷冻研磨在裂解酵母细胞方面优于一种常用的机械法——珠磨法（4 °C 下进行）图3A 和 3B）。在液氮（LN）中于 -196 °C 条件下处理样品时，冷冻研磨可高效裂解酵母细胞₂ 因此，通过极大限度地减少其他多种提取方法中常见的热诱导蛋白质变性和降解，该方法可有效维持蛋白质的完整性。这使得样品中高度不稳定的生物大分子得以分析，并可实现功能性蛋白质复合物的纯化。此外，冷冻研磨机的使用取代了传统上耗时费力的 mortar 手工研磨酵母“爆米花”的方法，使样品处理更加快速高效。最后，该方法无需使用任何昂贵的酶即可实现酵母细胞裂解，从而在长期应用中显著节约成本。

冷冻研磨机的主要缺点是购买设备的初始成本较高...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 mL 聚碳酸酯螺口管	贝克曼	357002	离心管
BD Bacto 蛋白胨	BD生物科学	211677	酵母 YPD 培养基组分
BD Bacto 酵母提取物	BD生物科学	212750	酵母 YPD 培养基组分
Beckman Avanti 离心机	贝克曼	B38624	高速离心机
Beckman JLA-9.1000	贝克曼	366754	转子
D-(+)-无水葡萄糖	MP Biomedicals	901521	酵母 YPD 培养基组分
Eppendorf A-4-44	Eppendorf	22637461	水平转子
Eppendorf 冷冻离心机 5810 R	Eppendorf	22625101	冷藏离心机
甘油	SIGMA-ALDRICH	G5150-1GA	排阻剂与冷冻保护剂
HEPES	FisherBiotech	BP310-100	缓冲液
HIS6 抗体	Novagen	70796	HIS标签抗体
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541-1KG	用于维持离子强度的盐
MG-132	CALBIOCHEM	474790	蛋白酶体抑制剂
磷酸酶抑制剂混合物	赛默飞世尔科技	A32957	磷酸酶抑制剂混合物
Ponceau S	SIGMA	P7170-1L	蛋白质染色
蛋白酶抑制剂混合物	赛默飞世尔科技	A32963	蛋白酶抑制剂混合物
转子 JLA 25.500	贝克曼	JLA 25.500	转子
丁酸钠	EM Science	BX2165-1	组蛋白去乙酰化酶抑制剂
氟化钠	Sigma-Aldrich	S6521	磷酸酶抑制剂
钒酸钠	MP Biomedicals	159664	磷酸酶抑制剂
钠 β-甘油磷酸盐	Alfa Aesar	13408-09-8	磷酸酶抑制剂
Spex Certiprep 6850 冷冻研磨机	SPEX样品制备	6850	冷冻研磨机
TALON金属亲和树脂	BD生物科学	635502	用于下拉HIS标签蛋白
Tween 20	VWR International	VW1521-07	非离子型去污剂
β-巯基乙醇	AMRESCO	M131-250ML	还原剂