使用自动化冷冻研磨机通过冷冻研磨制备细胞提取物

摘要

我们介绍一种使用低温冷冻研磨机从酵母或其他细胞制备全细胞提取物的可靠方法，该方法可最大程度地减少蛋白质的降解和变性。所获得的细胞提取物适用于功能性蛋白复合物的纯化、蛋白质组学分析、共免疫沉淀实验以及不稳定蛋白质修饰的检测。

摘要

芽殖酵母中遗传操作的简便性及其真核细胞机制的高度进化保守性 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 使其成为一种重要的遗传学模式生物。然而，由于高效的蛋白质分离依赖于细胞的充分破碎，而酵母的细胞壁给其细胞蛋白的生化分析带来了困难：酶解法（使用溶壁酶或zymolyase）成本较高，机械破碎法（使用传统的玻璃珠震荡器、法国压或咖啡研磨机）则难以避免样品升温，进而导致蛋白质变性与降解。尽管在液氮（LN₂）中手动研磨酵母细胞₂) 使用研钵和研杵进行研磨虽可避免样品过热，但劳动强度大，且不同操作者之间的细胞裂解效果存在差异。多年来，我们一直通过在自动冷冻研磨仪中进行低温研磨来成功制备高质量的酵母提取物。使用液氮（LN₂）可达到 -196 °C 的低温环境，₂ 可保护生物材料免受蛋白酶和核酸酶的降解，从而能够回收完整的蛋白质、核酸及其他大分子。本文详细描述了适用于出芽酵母细胞的该技术，包括将细胞悬浮液在裂解缓冲液中逐滴加入液氮中进行冷冻的过程₂ 生成被称为“爆米花”的细胞冻滴，然后在液氮（LN）中将这种“爆米花”研磨成粉末₂ 使用冷冻研磨机将样品研磨成冷冻的“粉末状”提取物，随后缓慢融化，并通过离心澄清以去除不溶性残渣。所得提取物可直接用于后续实验，如蛋白质或核酸纯化、蛋白质组学分析或共免疫沉淀研究。该方法广泛适用于多种微生物、动植物组织、海洋样本（包括珊瑚）的细胞提取物制备，以及法医学和永久冻土化石样本中DNA/RNA的分离。

引言

酵母是蛋白质研究中常用的一种模式生物，作为一种结构简单的真核生物，研究人员可利用丰富的遗传学和生物化学工具对其进行研究¹。由于酵母具有坚固的细胞壁，研究人员面临的一个挑战是如何在不破坏细胞内含物的前提下高效裂解细胞。目前已有多种方法可用于通过裂解酵母细胞来获得蛋白质提取物，包括酶解法（如zymolyase）^2,3、化学裂解法⁴、冻融法等物理裂解法⁵、基于压力的方法（如French press）^6,7、机械法（如玻璃珠、咖啡研磨机）^8,9、超声处理法¹⁰以及低温研磨法^2,11。细胞裂解效率和蛋白质得率会因所采用技术的不同而存在显著差异，从而影响裂解液的最终结果或其在后续实验应用中的适用性。在研究那些不稳定的蛋白质、具有短暂翻译后修饰的蛋白质或对温度敏感的蛋白质时，尤其需要采用一种能....

方案

1. 酵母爆米花的制备

1. 在 0.5 L YPD 培养基中培养酵母细胞至密度为 1 × 10⁶ CFU/mL⁷ 细胞/mL。使用库尔特计数器或其他任何方法进行细胞计数。
2. 离心细胞10分钟，2,400 g 4 °C.
3. 每个样品用500 mL冰冻的去离子18兆欧Milli-Q水洗涤一次。
4. 将沉淀重悬于15 mL预冷的裂解缓冲液中[20 mM HEPES-KOH pH 7.5, 110 mM KCl, 0.1% Tween, 10%甘油，加入新鲜配制的10 mM β-巯基乙醇、蛋白酶抑制剂混合物] 10 μM 蛋白酶体抑制剂 MG-132、1 mM 去乙酰化酶抑制剂丁酸钠以及磷酸酶抑制剂（1 mM 钒酸钠、50 mM 氟化钠、50 mM β-甘油磷酸钠）。参见 材料表 有关更多细节，请参见相关说明。将重悬的细胞置于冰上，直至样品准备好进行下一步操作。
   注意：根据下游应用，可使用含有多种非离子型去污剂的裂解缓冲液，并根据需要加入特定抑制剂。为防止蛋白质降解，尤其是提取物解冻后发生降解，必须加入蛋白酶和蛋白酶体抑制剂。
5. 使用预冷的血清移液管，将细胞悬液逐滴缓慢加入一个或多个置于干冰上并装有液氮的50 mL离心管中，制备速冻酵母爆米花₂ 直至液面接近管口下方。由于液氮会迅速蒸发，需频繁补充，以维持液面高度。操作时应在通风良好的区域进行，以避免氮气窒息风险。....

结果

我们比较了两种不同的酵母细胞裂解方法，即在 4 °C 下进行玻璃珠研磨和在 -196 °C 下进行自动冷冻研磨，以评估两种方法制备的细胞提取物中蛋白质回收率的差异。本研究选用芽殖酵母菌株 YAG 1177 (MAT a lys2-810 leu2-3,-112 ura3-52 his3-Δ200 trp1-1[am] ubi1-Δ1::TRP1 ubi2-Δ2::ura3 ubi3-Δub-2 ubi4-Δ2::LEU2 [pUB39] [pUB221])¹⁶，该菌株携带一个高拷贝质粒，可表达串联的 HIS-MYC 标记泛素（HIS-MYC-Ub），以便通过亲和纯化后评估提取物中带标签泛素化蛋白的回收效率。

我们测试了一种快速方案，该方案采用玻璃珠研磨法在 4 °C 下裂解酵母细胞⁹，以及使用冷冻酵母细胞（酵母爆米花）在液氮（LN₂）中.......

讨论

研究酵母天然蛋白的一个局限性是由于酵母细胞裂解效率低下所致 其坚固的细胞壁。尽管已开发出多种方法，但在我们实践中最稳定且高效的方法是将酵母细胞快速冷冻成爆米花状后进行冷冻研磨。与其它裂解方法相比，该方法能够可靠地制备出高质量的芽殖酵母全细胞提取物。代表性结果表明，冷冻研磨在裂解酵母细胞方面优于一种常用的机械法——珠磨法（4 °C 下进行）图3A 和 3B）。在液氮（LN）中于 -196 °C 条件下处理样品时，冷冻研磨可高效裂解酵母细胞₂ 因此，通过极大限度地减少其他多种提取方法中常见的热诱导蛋白质变性和降解，该方法可有效维持蛋白质的完整性。这使得样品中高度不稳定的生物大分子得以分析，并可实现功能性蛋白质复合物的纯化。此外，冷冻研磨机的使用取代了传统上耗时费力的 mortar 手工研磨酵母“爆米花”的方法，使样品处理更加快速高效。最后，该方法无需使用任何昂贵的酶即可实现酵母细胞裂解，从而在长期应用中显著节约成本。

冷冻研磨机的主要缺点是购买设备的初始成本较高.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 mL 聚碳酸酯螺口管	贝克曼	357002	离心管
BD Bacto 蛋白胨	BD生物科学	211677	酵母 YPD 培养基组分
BD Bacto 酵母提取物	BD生物科学	212750	酵母 YPD 培养基组分
Beckman Avanti 离心机	贝克曼	B38624	高速离心机
Beckman JLA-9.1000	贝克曼	366754	转子
D-(+)-无水葡萄糖	MP Biomedicals	901521	酵母 YPD 培养基组分
Eppendorf A-4-44	Eppendorf	22637461	水平转子
Eppendorf 冷冻离心机 5810 R	Eppendorf	22625101	冷藏离心机
甘油	SIGMA-ALDRICH	G5150-1GA	排阻剂与冷冻保护剂
HEPES	FisherBiotech	BP310-100	缓冲液
HIS6 抗体	Novagen	70796	HIS标签抗体
KCl	SIGMA-ALDRICH	P9541-1KG	用于维持离子强度的盐
MG-132	CALBIOCHEM	474790	蛋白酶体抑制剂
磷酸酶抑制剂混合物	赛默飞世尔科技	A32957	磷酸酶抑制剂混合物
Ponceau S	SIGMA	P7170-1L	蛋白质染色
蛋白酶抑制剂混合物	赛默飞世尔科技	A32963	蛋白酶抑制剂混合物
转子 JLA 25.500	贝克曼	JLA 25.500	转子
丁酸钠	EM Science	BX2165-1	组蛋白去乙酰化酶抑制剂
氟化钠	Sigma-Aldrich	S6521	磷酸酶抑制剂
钒酸钠	MP Biomedicals	159664	磷酸酶抑制剂
钠 β-甘油磷酸盐	Alfa Aesar	13408-09-8	磷酸酶抑制剂
Spex Certiprep 6850 冷冻研磨机	SPEX样品制备	6850	冷冻研磨机
TALON金属亲和树脂	BD生物科学	635502	用于下拉HIS标签蛋白
Tween 20	VWR International	VW1521-07	非离子型去污剂
β-巯基乙醇	AMRESCO	M131-250ML	还原剂