本文介绍并描述了一种广泛可及的方法体系，利用一些多功能的线虫模型，包括由离子通道过度激活引起的细胞坏死和由蛋白质聚集物诱导的神经毒性模型，以监测并解析与年龄相关的神经退行性疾病的细胞与分子基础。
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本文内容
摘要
摘要
应对人类神经退行性疾病及其广泛的社会经济影响正成为全球优先事项。尽管这些疾病对人类生活质量及医疗体系造成严重损害，但大多数人类神经退行性疾病目前仍无法治愈且难以预防。因此，开发针对此类疾病的新型治疗干预手段已成为一项紧迫任务。神经回路和神经功能随年龄增长而衰退的现象在进化上具有保守性，从低等的线虫Caenorhabditis elegans到人类均存在这一特征，表明其背后存在相似的细胞与分子机制。C. elegans是一种遗传操作性极强的模式生物，具有结构明确的神经系统、通体透明的特点，以及丰富的遗传学和成像技术，可用于评估衰老过程中神经元的活动状态和质量控制机制。本文介绍并描述了一系列利用多功能线虫模型的研究方法，包括由离子通道过度激活引发的坏死（如deg-3(d)和mec-4(d)）以及由蛋白质聚集物（如α-突触核蛋白和多聚谷氨酰胺）诱导的神经毒性模型，用以监测和解析与年龄相关的神经元功能衰退的细胞与分子基础。结合这些动物神经退行模型，并通过遗传学和药理学筛选调控细胞死亡的因子，将前所未有地深化我们对年龄相关性神经功能衰退的理解，并为促进人类健康和提升生活质量提供关键性洞见。
引言
在过去的二十年中，C. elegans 被广泛用作研究坏死性细胞死亡分子机制的模式生物。C. elegans 具有特征明确且图谱清晰的神经系统、透明的身体结构，以及丰富的遗传学和成像方法，可用于在衰老过程中实时监测细胞功能和存活状态。因此，已有多种 C. elegans 遗传性神经退行性疾病模型被建立，用于评估神经元的存活性。其中，已被充分描述并广泛应用的线虫模型包括由高活性离子通道引发的坏死1,2,3，以及由蛋白质异常聚集增加所触发的细胞死亡4,5,6,7,8,9,10 和热射病诱导的细胞死亡11,12 等。
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方案
1. 由过度活化离子通道诱导的坏死性细胞死亡
注意：包括 mec-4 和 deg-3 在内的去生成素（degenerin）基因家族的功能获得性突变，会导致超活性离子通道的形成，从而引发线虫中负责机械感知的六种触觉感受神经元发生坏死性细胞死亡3。由去生成素异常激活所诱导的坏死在机制和形态学上均表现出与哺乳动物兴奋性毒性相似的特征。在坏死过程中，能量代谢和钙稳态的维持对神经元存活具有关键作用11。以下菌株可用于监测由超活性离子通道引发的坏死性细胞死亡：mec-4(u231)X 和 deg-3(u662)V。
- 突变线虫的培养、同步化及坏死性细胞死亡检测前处理
- 第1天：挑选L4期幼虫 mec-4(u231) 或 deg-3(u662) 突变线虫转移到线虫生长培养基（NGM； 表1接种有细胞的培养板 大肠杆菌 （OP50）使用解剖立体显微镜。
- 每块接种的NGM平板上放置10条L4期线虫，在20 °C标准温度下培养。
- 第5天：用1 mL M9缓冲液洗涤平板（表1）并将动物收集到1.5 mL离心管中。 ....
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结果
由过度活化的离子通道诱导的坏死性细胞死亡
根据此处提供的实验步骤，将 mec-4(u231) 和 deg-3(u662) 突变体胚胎在 34 °C 下孵育 25 分钟，或在标准温度 20 °C 下培养。孵化后，在两种条件下幼虫的 L1 阶段统计神经元细胞的死亡数量。来自经热激预处理卵孵化的线虫中，坏死性细胞死亡数量减少（图 1A-1B）。
蛋白质聚集物诱导的神经退行性变
转基因线虫在多巴胺能神经元中过表达（A）人源α-突触核蛋白和细胞质GFP，以及在全部神经元中泛表达（B）与YFP融合的人源聚谷氨酰胺蛋白（PolyQ），每日在34 °C下暴露30分钟。热休克预处理可促进对7日龄成年雌雄同体线虫中α-突触核蛋白诱导的细胞死亡产生神经保护作用（图2A），并减少4日龄成年线虫头部区域Q40::YFP蛋白聚集物的形成（<.......
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讨论
本文介绍并描述了一种广泛应用且易于获取的方法，用于培养、同步化及显微观察多种研究年龄依赖性神经退行性变的多功能 C. elegans 模型。特别是，我们通过利用离子通道过度激活诱导的坏死以及蛋白质聚集体诱导的神经毒性，来评估和解析与年龄相关的神经元损伤的细胞与分子基础1,2,3,4,5,7,9,10,11。
尽管体内细胞死亡评估的所述操作流程简单明了，可在任何实验室中.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
感谢 Chaniotakis M. 和 Kounakis K. 进行视频录制与编辑。K.P. 的研究由希腊研究与创新基金会（Hellenic Foundation for Research and Innovation，HFRI）和研究与技术总秘书处（General Secretariat for Research and Technology，GSRT）的资助项目支持。N.T. 的研究由欧洲研究理事会（European Research Council，ERC – GA695190 – MANNA）、欧盟委员会框架计划以及希腊教育与宗教事务部的资助项目支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| 琼脂糖 | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110在应对人类神经退行性疾病及其广泛的社会经济影响方面，全球正日益重视这一挑战。尽管这些疾病对人类生活质量及医疗体系造成了严重损害，但大多数人类神经退行性疾病目前仍无法治愈且难以预防。因此，开发针对此类疾病的新型治疗干预手段已成为一项紧迫任务。与年龄相关的神经回路及功能衰退在从低等生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）到人类等多种生物中具有进化上的保守性，表明其潜在的细胞与分子机制存在相似之处。C. elegans 是一种遗传操作性极强的模式生物，具有结构明确的神经系统、通体透明的体型，以及丰富的遗传学与成像技术，可用于评估衰老过程中神经元活动及其质量控制。本文介绍并描述了一系列利用多种多功能线虫模型的方法，包括离子通道过度激活引发的坏死（如 deg-3(d) 和 mec-4(d)）以及蛋白质聚集物（如 α-突触核蛋白和多聚谷氨酰胺）诱导的神经毒性模型，以监测和解析与年龄相关的神经元功能衰退的细胞与分子基础。结合这些动物神经退行模型与针对细胞死亡调控因子的遗传学和药理学筛选，将前所未有地深化我们对年龄相关神经功能衰退的理解，并为促进人类健康与生活质量提供关键洞见。rgef-1Q40::YFP | 秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC） | ||
| 氯化钙二水合物（CaCl₂）2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| 胆固醇 | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V 或 deg-3(d) | 秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC） | 在 20 ℃ 培养动物 °C | |
| 微分干涉差显微镜（诺马尔斯基） | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| 解剖体视显微镜 | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| 荧光显微镜 | Thermo Fisher Scientific | EVOS 细胞成像系统 | |
| Escherichia coli OP50 菌株 | 秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC） | ||
| Greiner 培养皿（60 mm × 15 mm） | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| 图像分析软件 | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2人类表型本体4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| 硫酸镁（MgSO₄）4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X 或 mec-4(d) | 秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC） | 在20℃条件下培养动物 °C | |
| 显微镜载玻片（75 mm × 25 mm × 1 mm） | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| 显微镜盖玻片（18 mm × 18 mm） | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel 软件包 | Microsoft Corporation，雷德蒙德，美国 | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| 线虫生长培养基（NGM）琼脂平板 | |||
| 制霉菌素储备液 | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| 蛋白胨 | BD，Bacto | 211677 | |
| 磷酸盐缓冲液 | |||
| 氯化钠（NaCl） | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| 制备琼脂平板的标准设备（高压灭菌器、培养皿等） | |||
| 维持线虫的标准设备（铂金丝挑针、培养箱等） | |||
| 统计分析软件 | GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | GraphPad Prism 软件包 | |
| 链霉素 | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| 盐酸四咪唑 | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: 是[baIn1; pdat-1αα-突触核蛋白，pdat-1GFP | 应要求联系：G. Caldwell（阿拉巴马大学，塔斯卡卢萨 AL） |
参考文献
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003....
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