本文介绍并描述了一种广泛可及的方法体系，利用一些多功能的线虫模型，包括由离子通道过度激活引起的细胞坏死和由蛋白质聚集物诱导的神经毒性模型，以监测并解析与年龄相关的神经退行性疾病的细胞与分子基础。
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本文内容
摘要
摘要
应对人类神经退行性疾病及其广泛的社会经济影响正成为全球优先事项。尽管这些疾病对人类生活质量及医疗体系造成严重损害，但大多数人类神经退行性疾病目前仍无法治愈且难以预防。因此，开发针对此类疾病的新型治疗干预手段已成为一项紧迫任务。神经回路和神经功能随年龄增长而衰退的现象在进化上具有保守性，从低等的线虫Caenorhabditis elegans到人类均存在这一特征，表明其背后存在相似的细胞与分子机制。C. elegans是一种遗传操作性极强的模式生物，具有结构明确的神经系统、通体透明的特点，以及丰富的遗传学和成像技术，可用于评估衰老过程中神经元的活动状态和质量控制机制。本文介绍并描述了一系列利用多功能线虫模型的研究方法，包括由离子通道过度激活引发的坏死（如deg-3(d)和mec-4(d)）以及由蛋白质聚集物（如α-突触核蛋白和多聚谷氨酰胺）诱导的神经毒性模型，用以监测和解析与年龄相关的神经元功能衰退的细胞与分子基础。结合这些动物神经退行模型，并通过遗传学和药理学筛选调控细胞死亡的因子，将前所未有地深化我们对年龄相关性神经功能衰退的理解，并为促进人类健康和提升生活质量提供关键性洞见。
引言
在过去的二十年中，C. elegans 被广泛用作研究坏死性细胞死亡分子机制的模式生物。C. elegans 具有特征明确且图谱清晰的神经系统、透明的身体结构，以及丰富的遗传学和成像方法，可用于在衰老过程中实时监测细胞功能和存活状态。因此，已有多种 C. elegans 遗传性神经退行性疾病模型被建立，用于评估神经元的存活性。其中，已被充分描述并广泛应用的线虫模型包括由高活性离子通道引发的坏死1,2,3，以及由蛋白质异常聚集增加所触发的细胞死亡4,5,6,7,8,9,10 和热射病诱导的细胞死亡11,12 等。
短期暴露于亚致死温度可使线虫和哺乳动物神经元对随后热应激引发的坏死性细胞死亡产生抗性11。有趣的是，每日以轻度升高的温度对线虫进行预处理，可抵御由多种刺激引起的神经退行性病变，这些刺激包括离子失衡（例如 mec-4(u231) 和/或 deg-3(u662)）以及蛋白质聚集（例如 α-synuclein 和 polyQ40）11,13。
本文介绍了利用秀丽隐杆线虫（C. elegans）在一些已建立的人类疾病模型中监测和评估年龄依赖性神经退行性变的多种通用方法，这些疾病模型包括兴奋性毒性诱导的细胞死亡、帕金森病和亨廷顿病。此外，我们强调了热预处理在多种神经退行性变模型中的神经保护作用。将这些技术与遗传学和/或药理学筛选相结合，将有助于发现和表征具有潜在治疗意义的新型细胞死亡调控因子。
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方案
1. 由过度活化离子通道诱导的坏死性细胞死亡
注意：包括 mec-4 和 deg-3 在内的去生成素（degenerin）基因家族的功能获得性突变，会导致超活性离子通道的形成，从而引发线虫中负责机械感知的六种触觉感受神经元发生坏死性细胞死亡3。由去生成素异常激活所诱导的坏死在机制和形态学上均表现出与哺乳动物兴奋性毒性相似的特征。在坏死过程中，能量代谢和钙稳态的维持对神经元存活具有关键作用11。以下菌株可用于监测由超活性离子通道引发的坏死性细胞死亡：mec-4(u231)X 和 deg-3(u662)V。
- 突变线虫的培养、同步化及坏死性细胞死亡检测前处理
- 第1天：挑选L4期幼虫 mec-4(u231) 或 deg-3(u662) 突变线虫转移到线虫生长培养基（NGM； 表1接种有细胞的培养板 大肠杆菌 （OP50）使用解剖立体显微镜。
- 每块接种的NGM平板上放置10条L4期线虫，在20 °C标准温度下培养。
- 第5天：用1 mL M9缓冲液洗涤平板（表1）并将动物收集到1.5 mL离心管中。
- 在 10,000 x g 条件下离心 g 30 秒后去除上清液。
- 加入0.5 mL漂白液（7 mL H2O，1 mL 5 N NaOH 和 2 mL 漂白剂。
注意：漂白液会逐渐失去效用，因此应每日新鲜配制。 - 涡旋并定期观察，直至线虫完全溶解。
注意：避免漂白时间超过5分钟，否则会影响胚胎的活力。 - 在 10,000 x g 条件下离心 g 30 秒后去除上清液。
- 用1 mL M9缓冲液将沉淀（卵）洗涤两次。
- 洗涤后，将卵重悬于200 µL M9缓冲液中，置于34 °C水浴中孵育25分钟。
- 在20 °C下保存一组独立的对照样品（卵）。
- 用移液器吸取100 µL对照组或热激处理的卵，置于未接种的NGM平板上。每块平板含有至少100–200个卵。
- 将卵在20 °C条件下孵育至孵化。
- 使用微分干涉差（DIC；Nomarski）显微镜观察L1幼虫的制片方法
- 制备2%琼脂糖垫。
- 使用1 mL M9缓冲液冲洗平板，并将L1幼虫线虫收集至1.5 mL离心管中。
- 在 10,000 x g 条件下离心 g 30 秒。
- 移除上清液，保留沉淀（线虫）。
- 加入100 µL 20 mM M9/左旋咪唑缓冲液以麻醉线虫。
注意：避免使用叠氮化钠作为麻醉剂。叠氮化钠会引发线粒体损伤和氧化应激，最终导致细胞死亡的诱导 - 用移液器吸取含有L1线虫的M9/左旋咪唑缓冲液10 µL，将其接种到2%琼脂糖垫上（表1).
- 轻轻将盖玻片盖在样品上。
注意：用指甲油封固盖玻片，以在整个成像过程中保持湿度。 - 使用微分干涉差（DIC；Nomarski）显微镜观察线虫。
- 通过计数每条线虫中具有特征性空泡化形态的触觉受体神经元细胞，评估六条触觉受体神经元的神经退行性变程度。
2. 蛋白质聚集物诱导的神经退行性变
注意：以下品系可用于研究蛋白聚集物诱导的神经毒性：（A）在多巴胺能神经元中过表达人源α-突触核蛋白，UA44：Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]；以及（B）在全部神经元中过表达人源多聚谷氨酰胺蛋白（PolyQ），AM101：rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10。
- 用于神经退行性变检测的转基因线虫的培养、同步化及样品制备
- 使用解剖体视显微镜监测 C. elegans 的发育和生长。
- 第1天：通过挑取每种品系15–20只L4期幼虫，转移至新接种OP50的大肠杆菌NGM平板上，实现转基因线虫群体的同步化。
注：每种实验条件下，每种品系至少使用三个平板。 - 将线虫在标准温度20 °C下进行培养，使其正常生长。
- 第2天：将平板转移至设定为34 °C的培养箱中，进行为期30分钟的每日预处理；随后将经过预处理的线虫重新放回20 °C的标准培养温度中。
注：不同遗传背景的线虫可能对长时间高温暴露较为敏感。 - （A）若研究人源α-突触核蛋白在多巴胺能神经元中的过表达，使用品系UA44：Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]：在第9天，检测7日龄转基因线虫的多巴胺能神经元细胞死亡情况。
- （B）若研究人源聚谷氨酰胺蛋白（PolyQ）在全神经元中的过表达，使用品系AM101：rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]：在第5天，检测4日龄表达Q40::YFP的转基因动物头部区域的神经元PolyQ聚集体。
- 样品制片用于显微镜观察
- 制备2%琼脂糖垫（表1）。
- 在琼脂糖垫中央滴加10 µL 20 mM M9/左旋咪唑缓冲液。
- 挑取相应的转基因线虫，转移至M9/左旋咪唑液滴中。
注：每个液滴中放置20–30只线虫。 - 轻柔地将盖玻片覆盖在样品上方。
注：用指甲油密封盖玻片边缘，以在整个成像过程中保持湿度。 - 对相应样品进行显微镜观察。
- 在多巴胺能神经元中共表达α-突触核蛋白和胞质GFP的转基因线虫的图像采集与数据分析
- 使用落射荧光显微镜结合成像相机（例如EVOS FL Auto 2）。
- 以20倍放大倍数获取头部区域的z轴层扫图像。
- 保存并收集最大强度投影图像。
- 对所获取的图像进行后续分析。
- 通过评估以下细胞学特征，检查转基因蠕虫的神经退行性变：（i）在dat-1启动子驱动下表达GFP的神经元中荧光信号的丢失；（ii）神经元出现胞体和/或轴突出泡、异常突起或树突发育缺失。
- 导入数据并使用数据分析软件（例如Excel）进行分析。
3. 表达泛神经元型PolyQ40-YFP融合蛋白的转基因线虫的获取过程与数据分析
- 使用落射荧光显微镜结合相机（例如 EVOS FL Auto 2）。
- 以 20 倍放大倍数对头部区域进行 z 轴层扫成像并采集图像。
- 保存并收集最大强度投影图像。
- 使用 Fiji 软件对获取的图像进行分析。
- 用 Fiji 程序打开图像14。
- 通过 图像 和 颜色 下拉菜单选择 拆分通道 命令。
注意：保留绿色通道图像。 - 使用 自由手选择 工具手动设定感兴趣的荧光区域（ROI；例如头部）。
- 通过 分析 和 工具 下拉菜单，在 ROI 管理器 中添加相应的 ROI。
- 选择 处理 和 减去背景，将背景减去 50%。
- 通过菜单命令 图像 | 调整 | 阈值 设置并应用阈值。在整个实验的图像分析过程中保持并使用相同的阈值。
- 从 ROI 管理器 中选择相应的 ROI。
- 使用菜单命令 分析 和 分析颗粒 来分析蛋白质聚集体的数量。
- 对每张获取的图像重复步骤 3.5–3.12。
- 从独立的结果窗口中复制显示的数值。
- 粘贴/导入结果，并使用软件包进行分析。
4. 报告统计分析
- 每种实验条件下至少使用 30 条线虫。进行三次生物学重复。
- 使用统计分析软件进行学生 t-检验（两组之间的比较）或方差分析（多组之间的比较），显著性水平设为 p < 0.05。
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结果
由过度活化的离子通道诱导的坏死性细胞死亡
根据此处提供的实验步骤，将 mec-4(u231) 和 deg-3(u662) 突变体胚胎在 34 °C 下孵育 25 分钟，或在标准温度 20 °C 下培养。孵化后，在两种条件下幼虫的 L1 阶段统计神经元细胞的死亡数量。来自经热激预处理卵孵化的线虫中，坏死性细胞死亡数量减少（图 1A-1B）。
蛋白质聚集物诱导的神经退行性变
转基因线虫在多巴胺能神经元中过表达（A）人源α-突触核蛋白和细胞质GFP，以及在全部神经元中泛表达（B）与YFP融合的人源聚谷氨酰胺蛋白（PolyQ），每日在34 °C下暴露30分钟。热休克预处理可促进对7日龄成年雌雄同体线虫中α-突触核蛋白诱导的细胞死亡产生神经保护作用（图2A），并减少4日龄成年线虫头部区域Q40::YFP蛋白聚集物的形成（<...
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讨论
本文介绍并描述了一种广泛应用且易于获取的方法，用于培养、同步化及显微观察多种研究年龄依赖性神经退行性变的多功能 C. elegans 模型。特别是，我们通过利用离子通道过度激活诱导的坏死以及蛋白质聚集体诱导的神经毒性，来评估和解析与年龄相关的神经元损伤的细胞与分子基础1,2,3,4,5,7,9,10,11。
尽管体内细胞死亡评估的所述操作流程简单明了，可在任何实验室中...
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
感谢 Chaniotakis M. 和 Kounakis K. 进行视频录制与编辑。K.P. 的研究由希腊研究与创新基金会（Hellenic Foundation for Research and Innovation，HFRI）和研究与技术总秘书处（General Secretariat for Research and Technology，GSRT）的资助项目支持。N.T. 的研究由欧洲研究理事会（European Research Council，ERC – GA695190 – MANNA）、欧盟委员会框架计划以及希腊教育与宗教事务部的资助项目支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂 | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| 琼脂糖 | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101: rmsIs110在应对人类神经退行性疾病及其广泛的社会经济影响方面，全球正日益重视这一挑战。尽管这些疾病对人类生活质量及医疗体系造成了严重损害，但大多数人类神经退行性疾病目前仍无法治愈且难以预防。因此，开发针对此类疾病的新型治疗干预手段已成为一项紧迫任务。与年龄相关的神经回路及功能衰退在从低等生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）到人类等多种生物中具有进化上的保守性，表明其潜在的细胞与分子机制存在相似之处。C. elegans 是一种遗传操作性极强的模式生物，具有结构明确的神经系统、通体透明的体型，以及丰富的遗传学与成像技术，可用于评估衰老过程中神经元活动及其质量控制。本文介绍并描述了一系列利用多种多功能线虫模型的方法，包括离子通道过度激活引发的坏死（如 deg-3(d) 和 mec-4(d)）以及蛋白质聚集物（如 α-突触核蛋白和多聚谷氨酰胺）诱导的神经毒性模型，以监测和解析与年龄相关的神经元功能衰退的细胞与分子基础。结合这些动物神经退行模型与针对细胞死亡调控因子的遗传学和药理学筛选，将前所未有地深化我们对年龄相关神经功能衰退的理解，并为促进人类健康与生活质量提供关键洞见。rgef-1Q40::YFP | 秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC） | ||
| 氯化钙二水合物（CaCl₂）2?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| 胆固醇 | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V 或 deg-3(d) | 秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC） | 在 20 ℃ 培养动物 °C | |
| 微分干涉差显微镜（诺马尔斯基） | Zeiss | Axio Vert A1 | |
| 解剖体视显微镜 | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| 荧光显微镜 | Thermo Fisher Scientific | EVOS 细胞成像系统 | |
| Escherichia coli OP50 菌株 | 秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC） | ||
| Greiner 培养皿（60 mm × 15 mm） | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| 图像分析软件 | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2人类表型本体4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| 硫酸镁（MgSO₄）4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X 或 mec-4(d) | 秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC） | 在20℃条件下培养动物 °C | |
| 显微镜载玻片（75 mm × 25 mm × 1 mm） | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| 显微镜盖玻片（18 mm × 18 mm） | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Excel 软件包 | Microsoft Corporation，雷德蒙德，美国 | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| 线虫生长培养基（NGM）琼脂平板 | |||
| 制霉菌素储备液 | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| 蛋白胨 | BD，Bacto | 211677 | |
| 磷酸盐缓冲液 | |||
| 氯化钠（NaCl） | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| 制备琼脂平板的标准设备（高压灭菌器、培养皿等） | |||
| 维持线虫的标准设备（铂金丝挑针、培养箱等） | |||
| 统计分析软件 | GraphPad Software Inc.，美国加利福尼亚州圣地亚哥 | GraphPad Prism 软件包 | |
| 链霉素 | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| 盐酸四咪唑 | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44: 是[baIn1; pdat-1αα-突触核蛋白，pdat-1GFP | 应要求联系：G. Caldwell（阿拉巴马大学，塔斯卡卢萨 AL） |
参考文献
- Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology. Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).
- Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans. Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).
- Berkowitz, L. A., et al. Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
- Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model. Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).
- Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).
- Gitler, A. D., et al. The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).
- Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. Pathways of cellular proteostasis in aging and disease. Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).
- Labbadia, J., Morimoto, R. I. The biology of proteostasis in aging and disease. Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).
- Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans. Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).
- Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments. BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).
- Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans. Nature Communications. 8, 14337(2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
- Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans. Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).
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