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方法文章

原位移植乳腺肿瘤作为乳腺癌的临床前模型

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DOI：

10.3791/61173

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2020年5月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine, 2Lester and Sue Smith Breast Center, Baylor College of Medicine, 3Dan L. Duncan Cancer Center, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

源自患者的异种移植（PDX）模型和可移植的基因工程小鼠模型能够真实地模拟人类疾病，是基础和转化性乳腺癌研究的首选模型。本文描述了一种将乳腺肿瘤组织片段原位移植至乳腺脂肪垫以研究肿瘤生物学特性并评估药物反应的方法。

摘要

能够真实再现肿瘤异质性和治疗反应的临床前模型对于乳腺癌转化研究至关重要。永生化细胞系易于培养并进行遗传修饰，可用于研究分子机制，但长期细胞培养过程中的选择压力常导致基因和表观遗传的改变。患者来源的异种移植（PDX）模型能够真实再现人类乳腺肿瘤的异质性和药物反应特性。PDX模型在原位移植后具有相对较短的潜伏期，有利于乳腺肿瘤生物学特性和药物反应的研究。可移植的基因工程小鼠模型则可用于研究乳腺肿瘤的免疫特性。本实验方案描述了将乳腺肿瘤组织片段原位移植至乳腺脂肪垫并随后进行药物处理的方法。这些临床前模型为研究乳腺肿瘤生物学、药物反应、生物标志物发现以及耐药机制提供了重要的研究手段。

引言

大多数乳腺癌死亡可归因于对常规治疗耐药的复发性疾病1,2。乳腺癌的肿瘤间和肿瘤内异质性是导致治疗耐药的重要因素。此外，肿瘤异质性还会影响预后的准确判断，并给疾病管理带来挑战3,4。识别能够预测治疗反应的生物标志物将显著改善乳腺癌患者的临床结局。尽管大多数乳腺癌类型属于免疫学上的“冷肿瘤”，可能对免疫治疗无反应，但免疫检查点抑制剂在临床试验中已显示出潜力2,5。例如，一项III期临床试验表明，在PD-L1染色≥1%的肿瘤中，atezolizumab（抗PD-L1单克隆抗体）联合nab-紫杉醇治疗相比单用nab-紫杉醇可改善无病生存期（DFS），并初步显示出总体生存获益6。开发能够增强乳腺肿瘤对免疫治疗敏感性的疗法将彻底改变现有的治疗方案。

能够真实再现人类乳腺癌异质性和药物反应的临床前模型，对于研究肿瘤生物学以及识别靶向治疗的潜在生物标志物至关重要。由于永生化细胞系易于培养和进行遗传修饰以研究分子机制，因此被广泛用于乳腺癌研究。然而，由于长期体外细胞培养所造成的筛选压力，随着时间推移可能发生遗传漂变，乳腺癌细胞系可能携带某些细胞系特异性的基因组改变，这些改变与原发性乳腺肿瘤中的异常存在差异7,8,9。

源自患者的异种移植（PDX）肿瘤组织块能够重现人类疾病的异质性，在组织学和免疫组织化学方面与原发肿瘤相似10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29。重要的是，PDX模型在多次移植过程中表型稳定，这一点已通过组织学、转录组、蛋白质组和基因组分析得到证实10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29。PDX模型的治疗反应与临床观察结果具有可比性10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29。目前已建立针对雌激素受体阳性（ER+）、孕激素受体阳性（PR+）、表皮生长因子受体2阳性（ERBB2+，HER2+）以及三阴性乳腺癌（TNBC）的PDX模型，为内分泌治疗、化疗和靶向治疗提供了优良的研究平台。然而，当前PDX模型的一个主要局限在于小鼠缺乏功能性免疫系统。

基因工程小鼠模型（GEMM），例如 Trp53 纯合性缺失、cMyc、Wnt1、PyMT 或 Her2 过表达模型，可在免疫系统完整的背景下研究肿瘤的自发性发生、进展和转移。然而，这些模型的肿瘤潜伏期较长，使得开展具有多个实验组的临床前试验变得困难30,31。不过，GEMM 可被移植到同源性宿主体内，从而产生数量充足的肿瘤，这些肿瘤能高度模拟人类肿瘤的特征32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55。例如，将 p53 缺失的 BALB/c 小鼠的乳腺上皮组织移植到同源性野生型受体小鼠的去脂肪垫中，可形成原发性肿瘤，这些原发性肿瘤可进一步移植至同源性宿主中56,57。p53 缺失的肿瘤能够模拟人类肿瘤的不同亚型。

PDX 模型与可移植性 GEMM 的结合为研究乳腺肿瘤生物学、药物反应及抗肿瘤免疫提供了重要的临床前工具。本实验方案描述了一种将 PDX 和 GEMM 肿瘤组织片段原位移植至小鼠乳腺脂肪垫的方法。这些模型适用于连续传代，通常能够保持稳定的表型。为降低长期传代过程中发生遗传漂变或异质性丢失的风险，每次传代时应冻存多个组织片段，以便在后续观察到生物学或形态学变化时进行重新移植29,58。

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方案

所有使用动物的实验方案均已通过机构动物护理和使用委员会（IACUC）的审查和批准。肿瘤碎片大小约为1−2 mm3，来源于贝勒医学院患者来源的异种移植和高级体内模型核心实验室提供的可存活冷冻储备样本。

1. 移植用冷冻保存乳腺肿瘤组织片段的制备

  1. 将装有肿瘤组织碎片的冻存管从液氮中转移至37 °C水浴中。
  2. 在解冻过程中，偶尔轻轻弹动冻存管以进行振荡。
  3. 组织完全解冻后，将冻存管从水浴中取出，并通过轻柔翻转混匀内容物。
  4. 擦干冻存管外壁，并用70%乙醇喷洒消毒，然后转移至生物安全柜中。
  5. 将解冻后的肿瘤组织转移至含有10 mL冷的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）的15 mL锥形管中，通过翻转管子充分混匀，静置使组织碎片沉降至管底。
  6. 吸除上清液，加入10 mL冷的DMEM重悬组织，通过翻转管子充分混匀，静置使组织碎片沉降至管底。
  7. 吸除上清液，加入10 mL冷的DMEM重悬组织，将管子置于冰上。
    注意：组织现已准备好用于移植。

2. 移植用新鲜乳腺肿瘤的采集与制备

  1. 处死携带乳腺肿瘤的小鼠。
    注意：PDX 宿主可采用 SCID/Beige、NSG 或 NRG 雌性小鼠，而本研究中使用的是 3−5 周龄的雌性 Balb/c 小鼠。
  2. 用 70% 乙醇喷洒已处死小鼠的肿瘤区域。
    注意：应尽量避免毛发混入肿瘤样本，以免在冷冻保存或移植过程中造成肿瘤组织碎片污染。
  3. 使用有齿镊夹住并提起肿瘤周围皮肤，用剪刀做一小切口。
  4. 用剪刀将肿瘤与皮肤分离，完整取出肿瘤。修剪掉肿瘤外表面残留的鼠脂肪垫组织。将肿瘤置于装有 5 mL 冷 DMEM 的 15 mL 锥形管中。
    注意：应使用直径不超过 1 cm 的肿瘤，因为较大的肿瘤可能含有坏死核心。
  5. 在生物安全柜中，将分离的肿瘤转移至含有足量 DMEM 以防止干燥的无菌 10 cm 培养皿中。
  6. 在无菌条件下，用手术刀或刀片将肿瘤切成 1 mm3 大小的组织块。
    注意：手术刀或刀片应在使用前于生物安全柜内经紫外线照射至少 20 分钟。
  7. 将肿瘤组织块转移至装有冷 DMEM 的 15 mL 锥形管中，并将管子置于冰上。
    注意：组织现已可用于移植。步骤 2.4 中分离的肿瘤组织块可进行以下处理：1）在液氮中速冻，用于蛋白质和 RNA/DNA 提取；2）用 4% 多聚甲醛（PFA）或 10% 中性缓冲福尔马林（NBF）固定，用于苏木精-伊红（H&E）染色和免疫组织化学（IHC）分析；或 3）用 1.25 mL 冻存液（含 10% 二甲基亚砜 [DMSO]、40% DMEM 和 50% 胎牛血清 [FBS]）缓慢冷冻，在 -80 °C 冰箱中过夜，随后转移至液氮中长期保存。

3. 手术前准备动物

  1. 对于动物镇痛，在手术前60分钟皮下注射缓释布托啡诺，剂量为1 mg/kg，或根据机构指南提供持续72小时的镇痛覆盖。
  2. 根据机构关于无菌手术的指南设置手术室。
  3. 将一只4周龄雌性小鼠置于异氟烷麻醉机的诱导室中进行麻醉，异氟烷流速约为11.25 mL/h。将小鼠转移至操作区域，放置在无菌（硅胶橡胶）手术板上，并通过小型面罩持续给予麻醉。将小鼠仰卧位固定，用胶带将其四肢固定于自然位置。
    注意：SCID/Beige、NSG或NRG小鼠用于PDX模型，Balb/c小鼠用于GEMM移植模型。
  4. 在眼睛上涂抹眼用软膏以防止干燥。
  5. 通过脚趾夹捏法确认适当的镇静程度。
    注意：若动物无反应或无肢体活动，表明其已充分麻醉，可进行手术。
  6. 剃除小鼠下腹部的毛发，特别是围绕第四乳头区域（即手术部位）的区域。
  7. 以手术部位为中心，使用聚维酮碘外科 scrub 液采用环形动作由中心向外周擦拭；随后用70%异丙醇棉片去除聚维酮碘残留。重复此过程共三次。

4. 将肿瘤组织片段移植至第四对（腹股沟）乳腺脂肪垫

  1. 使用无菌手术巾覆盖动物身体，仅暴露手术切口部位。
    注意：在切开前，通过脚趾夹捏确认动物已达到适当的镇静水平。
  2. 使用有齿镊夹住第4乳头处的皮肤并轻轻提起。
  3. 将剪刀钝面朝下，从第4乳头向头部方向做一个短的（约1 cm）旁矢状切口。
  4. 使用棉签从切口内侧将皮肤与腹膜分离。
  5. 在固定切口外侧的同时，用同一棉签轻轻将第4乳腺脂肪垫从皮肤上剥离。
  6. 脂肪垫分离后，用27 G针头靠近动物身体处将皮肤固定。
  7. 若实验需要清除脂肪垫中的内源性小鼠乳腺上皮细胞，请执行以下步骤。
    1. 使用有齿镊轻轻将脂肪垫从身体向外拉伸，并定位腹股沟淋巴结，该淋巴结位于腺体主要血管交叉点下方（靠近镊子夹持腺体的位置）。
    2. 仔细烧灼淋巴结内侧的血管以及连接第4和第5脂肪垫的脂肪组织，形成一个三角区域。
      注意：此步骤期间暂时关闭氧气源。
    3. 使用显微解剖剪逐一切断已烧灼的血管（每次切割后确认无出血），直至包含淋巴结的脂肪垫部分被完全切除。
    4. 丢弃"清除"后的脂肪垫组织。
  8. 使用钝性分离镊夹持第4乳腺脂肪垫。另一只手将弯头精细镊的闭合尖端插入脂肪垫中部，位置位于残留血管上方且靠近腹膜壁。缓慢张开镊尖以形成一个小囊腔。随后将弯头精细镊从脂肪垫中退出。
  9. 使用弯头精细镊夹取一块肿瘤组织碎片，并将其插入囊腔内。
  10. 缓慢张开镊尖，将肿瘤碎片释放至乳腺脂肪垫的囊腔中。
  11. 小心撤出弯头精细镊。
    注意：撤出镊子时观察囊腔，确认肿瘤碎片仍保留在乳腺脂肪垫囊腔内。当实验或保种需要较多肿瘤组织时，可将肿瘤同时植入双侧对侧脂肪垫。不建议对双侧移植动物进行治疗研究，因已知对侧肿瘤之间存在相互作用。此外，也可使用套管针装置进行植入操作。
  12. 从切口基部开始，使用爪形镊和有齿镊分别夹住切口两侧皮肤，将两侧皮肤对合并轻微提起，为伤口夹固定做准备。用爪形镊展平切口边缘，并将边缘捏合在一起，形成连续的上表面。
  13. 用有齿镊固定两侧皮肤后，使用伤口夹施加器在切口中央放置一个伤口夹。如有必要，在切口末端涂抹组织粘合剂，以确保切口闭合并固定。
  14. 将动物放入置于加热表面的清洁笼盒中。术后期间密切监测出血、切口裂开及疼痛迹象。动物应在术后数分钟内恢复活动。
  15. 术后至少3天内密切观察切口部位及动物整体健康状况。遵循机构关于疼痛管理的指导原则。
  16. 在进行下一个移植操作前，将手术器械在玻璃珠灭菌器中消毒10秒。使用前等待器械冷却。
  17. 重复步骤4.1−4.15，直至完成所有小鼠的移植。
    注意：ER+肿瘤需要补充雌激素，可通过饮水或缓释颗粒剂提供59。

5. 监测药物治疗后肿瘤的生长情况

注意：可触及的已建立的可移植PDX肿瘤和p53缺失肿瘤在手术后需要2至8周的时间发展，具体时间取决于肿瘤固有的生长速率。

  1. 每周使用游标卡尺测量肿瘤两个维度两次。使用以下公式计算体积：
    肿瘤体积 (mm3) = W2 × L/2
    其中 W 为肿瘤的宽度，L 为肿瘤的长度。
  2. 当肿瘤体积达到 150−300 mm3 时开始药物治疗。
    注意：根据药物的性质，可通过口服灌胃或腹腔注射给药。
  3. 采集肿瘤样本，进行免疫组化染色60、蛋白质和 RNA/DNA 提取以及免疫表型分析61，用于不同目的。采集血液样本，进行免疫表型分析，或用于药代动力学/药效学研究。

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结果

图1展示了原位移植所用的设备（图1A）和关键操作步骤（图1B）。图2展示了移植后PDX肿瘤（MC1）的表征结果。将MC1模型的肿瘤组织块（1 mm3）移植至SCID/Beige小鼠的第4对脂肪垫中。一个月后，肿瘤平均体积达到约350 mm3。在一个月内每周监测两次肿瘤体积。通常情况下，使用1 mm3的肿瘤组织块移植后，约2至8周可触摸到明显的肿瘤，适用于多种PDX或GEMM模型（图2A）。可采集肿瘤样本用于形态学和信号通路分析（图2B−D...

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讨论

为了减少动物间肿瘤生长的差异，关键是要将肿瘤组织切成1 mm3的片段用于移植。生长较软组织的模型操作难度较大，肿瘤片段需稍大切至1−2 mm3。将组织放入乳腺脂肪垫口袋时，应注意不要将组织撕裂成多个碎片，否则会导致出现多个小肿瘤或形状异常的肿瘤。

此外，用于药物治疗研究的动物移植应使用新鲜的肿瘤组织。使用冻存后复苏的组织进行移植将导致成瘤率变异较大，且生长动力学略慢。一旦肿瘤从冻存材料中成功生长，第二代移植将恢复该模型典型的成瘤率和生长动力学特征。同时，应尽量选择无坏死或轻度坏死的肿瘤用于移植。对于大多数模型，适宜的肿瘤体积范围为 400−600 mm3。若观察到明显的坏死中心区域，则应取肿瘤外周组织进行移植，避免使用坏死区域。重要的是，肿瘤组织需始终保持在冰上，并防止干燥。

为了减少源自遗传工程小鼠模型（GEMM）肿瘤边缘或肿瘤核心（具有不同微环境）的瘤块之间可能存在的变异性，可采用另一种方法：制备原代细胞悬液，并根据肿瘤模型将约5,000−30,000个细胞...

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披露

MTL 是 StemMed, Ltd. 的有限合伙人创始人，同时也是其普通合伙人 StemMed Holdings 的创始人和管理者。MTL 还是 Tvardi Therapeutics, Inc. 的创始人和股权持有者。LED 是 StemMed, Ltd. 的带薪雇员。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（R37CA228304 和 R01HL146642 资助 Xi Chen，CA148761 资助 Jeffrey M. Rosen）、美国国防部（W81XWH-19-1-0524 资助 Xi Chen，W81XWH-19-1-0035 资助 Xiangdong Lv）、美国癌症协会（RSG-18-181-01-TBE 资助 Xi Chen）以及德克萨斯州癌症预防与研究研究所（RR150009 CPRIT 癌症研究学者奖资助 Xi Chen）提供支持。此外，还获得了贝勒医学院患者来源异种移植瘤与先进体内模型核心设施的支持（经费来自 RP170691 CPRIT 核心设施奖和 NCI-CA125123 P30 癌症中心支持拨款）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mg/mL 缓释型布托啡诺ZooPharm (通过贝勒医学院兽医)无菌
26G 注射器BD148232E无菌
聚维酮碘消毒液Fisher19-027132
棉签VWR International Laboratory89031-272无菌
DMEM 培养基FisherMT 10-013-CM无菌
电动剃毛器Oster78005-050
玻璃珠灭菌器（Germinator）Roboz 外科商店DS-401
润滑性眼用软膏Akorn 动物健康公司17478-062-35
显微解剖镊；带齿、角形（常规镊子）Roboz 外科商店RS-5139无菌
显微弹簧剪（脂肪垫切割剪）Roboz 外科商店RS-5658BT无菌
微型镊（组织放置镊）Roboz 外科商店RS-5069无菌
培养皿Fisher08-757- 100D无菌
无菌手术巾Sai Infusion TechnologyPSS-SD1无菌
手术剪Roboz 外科商店RS-5960无菌
组织镊（爪形镊）Roboz 外科商店RS-5158无菌
伤口夹施加器BD Autoclip 伤口系统01-804无菌
伤口夹移除器BD Autoclip 伤口系统01-804-15无菌
伤口夹BD Autoclip 伤口系统01-804-5无菌

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