源自患者的异种移植（PDX）模型和可移植的基因工程小鼠模型能够真实地模拟人类疾病，是基础和转化性乳腺癌研究的首选模型。本文描述了一种将乳腺肿瘤组织片段原位移植至乳腺脂肪垫以研究肿瘤生物学特性并评估药物反应的方法。
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摘要
摘要
能够真实再现肿瘤异质性和治疗反应的临床前模型对于乳腺癌转化研究至关重要。永生化细胞系易于培养并进行遗传修饰，可用于研究分子机制，但长期细胞培养过程中的选择压力常导致基因和表观遗传的改变。患者来源的异种移植（PDX）模型能够真实再现人类乳腺肿瘤的异质性和药物反应特性。PDX模型在原位移植后具有相对较短的潜伏期，有利于乳腺肿瘤生物学特性和药物反应的研究。可移植的基因工程小鼠模型则可用于研究乳腺肿瘤的免疫特性。本实验方案描述了将乳腺肿瘤组织片段原位移植至乳腺脂肪垫并随后进行药物处理的方法。这些临床前模型为研究乳腺肿瘤生物学、药物反应、生物标志物发现以及耐药机制提供了重要的研究手段。
引言
大多数乳腺癌死亡可归因于对常规治疗耐药的复发性疾病1,2。乳腺癌的肿瘤间和肿瘤内异质性是导致治疗耐药的重要因素。此外，肿瘤异质性还会影响预后的准确判断，并给疾病管理带来挑战3,4。识别能够预测治疗反应的生物标志物将显著改善乳腺癌患者的临床结局。尽管大多数乳腺癌类型属于免疫学上的“冷肿瘤”，可能对免疫治疗无反应，但免疫检查点抑制剂在临床试验中已显示出潜力2,5。例如，一项III期临床试验表明，在PD-L1染色≥1%的肿瘤中，atezolizumab（抗PD-L1单克隆抗体）联合nab-紫杉醇治疗相比单用nab-紫杉醇可改善无病生存期（DFS），并初步显示出总体生存获益6。开发能够增强乳腺肿瘤对免疫治疗敏感性的疗法将彻底改变现有的治疗方案。
能够真实再现人类乳腺癌异质性和药物反应的临床前模型，对于研究肿瘤生物学以及识别靶向治疗的潜在生物标志物至关重要。由于永生化细胞系易于培养和进行遗传修饰以研究分子机制，因此被广泛用于乳腺癌研究。然而，由于长期体外细胞培养所造成的筛选压力，随着时间推移....
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方案
所有使用动物的实验方案均已通过机构动物护理和使用委员会（IACUC）的审查和批准。肿瘤碎片大小约为1−2 mm3，来源于贝勒医学院患者来源的异种移植和高级体内模型核心实验室提供的可存活冷冻储备样本。
1. 移植用冷冻保存乳腺肿瘤组织片段的制备
- 将装有肿瘤组织碎片的冻存管从液氮中转移至37 °C水浴中。
- 在解冻过程中，偶尔轻轻弹动冻存管以进行振荡。
- 组织完全解冻后，将冻存管从水浴中取出，并通过轻柔翻转混匀内容物。
- 擦干冻存管外壁，并用70%乙醇喷洒消毒，然后转移至生物安全柜中。
- 将解冻后的肿瘤组织转移至含有10 mL冷的达尔伯克改良伊格尔培养基（DMEM）的15 mL锥形管中，通过翻转管子充分混匀，静置使组织碎片沉降至管底。
- 吸除上清液，加入10 mL冷的DMEM重悬组织，通过翻转管子充分混匀，静置使组织碎片沉降至管底。
- 吸除上清液，加入10 mL冷的DMEM重悬组织，将管子置于冰上。
注意：组织现已准备好用于移植。
2. 移植用新鲜乳腺肿瘤的采集与制备
- 处死携带乳腺肿瘤的小鼠。
注意：PDX 宿主可采用 SCID/Beige、NSG 或 NRG 雌性小鼠，而本研究中使用的是 3−5 周龄的雌性....
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结果
图1展示了原位移植所用的设备（图1A）和关键操作步骤（图1B）。图2展示了移植后PDX肿瘤（MC1）的表征结果。将MC1模型的肿瘤组织块（1 mm3）移植至SCID/Beige小鼠的第4对脂肪垫中。一个月后，肿瘤平均体积达到约350 mm3。在一个月内每周监测两次肿瘤体积。通常情况下，使用1 mm3的肿瘤组织块移植后，约2至8周可触摸到明显的肿瘤，适用于多种PDX或GEMM模型（图2A）。可采集肿瘤样本用于形态学和信号通路分析（图2B−D.......
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讨论
为了减少动物间肿瘤生长的差异，关键是要将肿瘤组织切成1 mm3的片段用于移植。生长较软组织的模型操作难度较大，肿瘤片段需稍大切至1−2 mm3。将组织放入乳腺脂肪垫口袋时，应注意不要将组织撕裂成多个碎片，否则会导致出现多个小肿瘤或形状异常的肿瘤。
此外，用于药物治疗研究的动物移植应使用新鲜的肿瘤组织。使用冻存后复苏的组织进行移植将导致成瘤率变异较大，且生长动力学略慢。一旦肿瘤从冻存材料中成功生长，第二代移植将恢复该模型典型的成瘤率和生长动力学特征。同时，应尽量选择无坏死或轻度坏死的肿瘤用于移植。对于大多数模型，适宜的肿瘤体积范围为 400−600 mm3。若观察到明显的坏死中心区域，则应取肿瘤外周组织进行移植，避免使用坏死区域。重要的是，肿瘤组织需始终保持在冰上，并防止干燥。
为了减少源自遗传工程小鼠模型（GEMM）肿瘤边缘或肿瘤核心（具有不同微环境）的瘤块之间可能存在的变异性，可采用另一种方法：制备原代细胞悬液，并根据肿瘤模型将约5,000−30,000个细胞.......
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披露
MTL 是 StemMed, Ltd. 的有限合伙人创始人，同时也是其普通合伙人 StemMed Holdings 的创始人和管理者。MTL 还是 Tvardi Therapeutics, Inc. 的创始人和股权持有者。LED 是 StemMed, Ltd. 的带薪雇员。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（R37CA228304 和 R01HL146642 资助 Xi Chen，CA148761 资助 Jeffrey M. Rosen）、美国国防部（W81XWH-19-1-0524 资助 Xi Chen，W81XWH-19-1-0035 资助 Xiangdong Lv）、美国癌症协会（RSG-18-181-01-TBE 资助 Xi Chen）以及德克萨斯州癌症预防与研究研究所（RR150009 CPRIT 癌症研究学者奖资助 Xi Chen）提供支持。此外，还获得了贝勒医学院患者来源异种移植瘤与先进体内模型核心设施的支持（经费来自 RP170691 CPRIT 核心设施奖和 NCI-CA125123 P30 癌症中心支持拨款）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mg/mL 缓释型布托啡诺 | ZooPharm (通过贝勒医学院兽医) | 无菌 | |
| 26G 注射器 | BD | 148232E | 无菌 |
| 聚维酮碘消毒液 | Fisher | 19-027132 | |
| 棉签 | VWR International Laboratory | 89031-272 | 无菌 |
| DMEM 培养基 | Fisher | MT 10-013-CM | 无菌 |
| 电动剃毛器 | Oster | 78005-050 | |
| 玻璃珠灭菌器（Germinator） | Roboz 外科商店 | DS-401 | |
| 润滑性眼用软膏 | Akorn 动物健康公司 | 17478-062-35 | |
| 显微解剖镊；带齿、角形（常规镊子） | Roboz 外科商店 | RS-5139 | 无菌 |
| 显微弹簧剪（脂肪垫切割剪） | Roboz 外科商店 | RS-5658BT | 无菌 |
| 微型镊（组织放置镊） | Roboz 外科商店 | RS-5069 | 无菌 |
| 培养皿 | Fisher | 08-757- 100D | 无菌 |
| 无菌手术巾 | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | 无菌 |
| 手术剪 | Roboz 外科商店 | RS-5960 | 无菌 |
| 组织镊（爪形镊） | Roboz 外科商店 | RS-5158 | 无菌 |
| 伤口夹施加器 | BD Autoclip 伤口系统 | 01-804 | 无菌 |
| 伤口夹移除器 | BD Autoclip 伤口系统 | 01-804-15 | 无菌 |
| 伤口夹 | BD Autoclip 伤口系统 | 01-804-5 | 无菌 |
参考文献
- Waks, A. G., Winer, E. P. Breast Cancer Treatment: A Review. JAMA. 321 (3), 288-300 (2019).
- Harbeck, N., et al. Breast cancer. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 66(2019).
- Harbeck, N., Salem, M., Nitz, U., Gluz, O., Liedtke, C.
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重印与许可
