在清醒小鼠中进行腹腔胰岛素耐受试验前的适应性处理以减轻应激诱导的高血糖

摘要

应激引起的血糖水平升高可能会干扰对小鼠清醒状态下腹腔胰岛素耐受试验所得数据的解读。本文介绍了一种方法，即在进行胰岛素耐受试验前，使小鼠适应抓取、注射和采血操作，以限制应激性高血糖的发生。

摘要

胰岛素耐受试验常用于代谢研究中评估啮齿类动物的整体胰岛素敏感性。该试验相对简单，通过单次腹腔注射胰岛素后，随时间测量血糖水平的变化。由于试验通常在动物清醒状态下进行，且血液常通过尾尖采血获取，因此在抓取和采血过程中可能因动物焦虑而引发应激反应。这种应激反应可导致血糖升高，从而干扰对主要终点指标——即胰岛素介导的血糖降低——的检测与解读。该现象已在多种小鼠品系中观察到，尤其在糖尿病db/db小鼠中较为常见，这些小鼠在注射胰岛素后血糖水平反而升高。本文介绍了一种在进行胰岛素耐受试验前使小鼠适应抓取、注射和采血操作的方法。我们发现，该方法可降低应激性高血糖，使所得数据更准确地反映整体胰岛素敏感性。

引言

在啮齿类动物中常规进行代谢检测，以评估调节葡萄糖稳态的各种参数¹。体内评估全身胰岛素作用的金标准是高胰岛素-正葡萄糖钳夹技术²。该检测通过输注胰岛素以升高循环胰岛素水平，同时输注葡萄糖以维持正常血糖水平。维持正常血糖所需的葡萄糖输注速率可反映胰岛素作用。尽管该技术在代谢研究中功能强大，但在小鼠中实施钳夹技术操作复杂且劳动强度大，因此不适合作为代谢表型初步筛选的工具。基于这些原因，通常选择更为简便的腹腔注射胰岛素耐量试验（ITT）。

胰岛素耐受试验（ITT）在动物禁食一段时间（通常为4-6小时）后，于清醒状态下进行。通过腹腔注射给予胰岛素推注剂量，随后在通常持续60分钟的时间内监测血糖水平。由于胰岛素能够促进葡萄糖进入胰岛素敏感组织，预期血糖水平会下降；血糖下降的程度反映了机体整体的胰岛素作用。在某些情况下，已有研究显示，给予胰岛素后血糖水平反而出现异常升高，而非下降。这一现象可能归因于应激反应。抓取、注射和采血等操作均可能引发应激^3,4,5，从而激活下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）和自主神经系统（ANS）^6,7,8。众所周知，HPA轴和ANS均可导致循环血糖水平升高^9,10,11。在ITT开始时若存在应激性高血糖，将会影响胰岛素给药后血糖下降的速度和幅度¹²，可能导致对是否存在胰岛素抵抗得出错误结论。因此，为了减轻应激对ITT期间血糖水平的干扰影响，我们建立了一种在进行ITT之前使小鼠适应抓取、注射和采血操作的方法。

方案

本文所述所有方法均已获得美国退伍军人普吉特湾医疗保健系统机构动物护理和使用委员会的批准。

注意：监测和/或干预低血糖动物的本地要求可能与此处所述的不同。

1. 禁食（t = -210 分钟）

1. 暗周期结束后，将小鼠转移至装有非营养性垫料（如纤维素或纸垫料）的新笼子中（不可使用玉米芯垫料，因其若被小鼠摄入会影响代谢终点指标¹³）。在整个禁食期间，始终为小鼠提供自由饮水。不同组小鼠的禁食时间点和持续时间应保持一致。本研究所示数据中，食物移除时间为0700至0800时，即暗周期结束后的1-2小时内。
2. 将笼子转移至准备进行胰岛素耐量试验（ITT）的地点。该区域应保持安静，尽量减少温度、噪音、光照或移动等应激因素。

2. 适应阶段（t = -150 至 -60 分钟）

重要提示：应尽可能轻柔地处理小鼠。如有可能，避免使用固定装置。

1. 在 -150 分钟时，测量小鼠体重。该数值将用于计算胰岛素耐量试验（ITT）中所需注射的胰岛素体积。
2. 轻轻抓住小鼠尾巴，将其放在平坦的台面上，同时继续保持对尾巴的轻柔握持。使用 20 G 针头（或手术剪刀）在尾尖处做一个小切口，切口处应开始形成一滴血液。
3. 将小鼠置于光滑坚硬的表面上，并用手指轻柔地固定其尾巴。
   1. 如需记录此时的血糖值，可将尾尖处的血液滴加到手持式血糖仪的试纸上。如有必要，可非常轻柔地按摩尾部以获取血滴。
4. 用胰岛素注射器抽取 100 µL 无菌生理盐水。通过轻柔抓取颈部皮肤的方式拿起小鼠，并进行腹腔注射。记录生理盐水注射的时间。
   1. 若同时处理多只小鼠，应以每分钟一只的间隔注射生理盐水，以便为后续步骤留出时间。
5. 在生理盐水注射后 15 分钟，轻轻抓住小鼠尾巴。使用纱布轻轻清除尾尖可能形成的血凝块。
   1. 可选： 此时可按照步骤 2.3 所述方法再次记录血糖值。
6. 在生理盐水注射后 30 分钟，轻轻抓住小鼠尾巴。如需要，可按照步骤 2.3 所述方法再次获取血糖测量值。
7. 将小鼠放回笼中，并根据需要对其他小鼠重复上述操作。从此时起保持小鼠不受干扰，直至 -90 分钟。
8. 在 -90 分钟时，重复步骤 2.3 至 2.6，如需要可包括血糖水平的测量。
9. 将小鼠放回笼中，并根据需要对其他小鼠重复操作。保持小鼠不受干扰，直至进行胰岛素耐量试验（ITT）（该试验的基线血糖测量在 -5 分钟时进行）。

3. 胰岛素耐受试验（t = -5 至 +60 分钟）

1. 用无菌生理盐水配制常规胰岛素（CAUTION）工作液，使所需剂量可按每克体重 4 µL 的体积注射。
   注意：操作胰岛素时应格外小心，因意外注射可能导致低血糖。
2. 用无菌生理盐水配制 25%（v/v）葡萄糖溶液，以备小鼠出现需干预的低血糖时使用。
3. 在 -5 分钟时，轻轻抓住小鼠尾巴将其提起。通过将尾尖血滴加到手持式血糖仪的试纸上，测定此时的基础血糖水平。如有必要，可非常轻柔地按摩尾巴以获得血滴。
4. 用胰岛素注射器抽取胰岛素工作液（按每克体重 4 µL，典型剂量范围为 0.5–2.0 U/kg）。轻轻抓起小鼠颈部皮肤，进行腹腔注射。记录胰岛素注射时间。
   1. 若同时处理多只小鼠，应以 1 分钟间隔依次注射胰岛素，以便为后续的采血和数据记录留出时间。
5. 胰岛素注射后 15 分钟，轻轻抓住小鼠尾巴将其提起。用纱布轻轻清除尾尖可能存在的血凝块。参照步骤 3.3 的方法再次测定血糖水平。
6. 将小鼠放回笼中，并观察其是否出现低血糖症状（如过度嗜睡）。若小鼠出现低血糖症状，应按步骤 5 所述方法测定血糖，并在必要时给予葡萄糖。接受葡萄糖干预的小鼠此时应退出胰岛素耐量试验（ITT）流程。
7. 在胰岛素注射后 30 分钟，重复步骤 3.5 和 3.6。
8. 在胰岛素注射后 45 分钟，重复步骤 3.5 和 3.6。
9. 在胰岛素注射后 60 分钟，重复步骤 3.5 和 3.6。
10. 将小鼠放回其饲养笼中，笼内地面放置少量食物颗粒，以帮助其从胰岛素耐量试验（ITT）中恢复。继续观察 30 分钟，若小鼠仍未恢复正常的活动/行为，则按步骤 3.6 所述程序处理。
    注意：图 1 总结了上述适应性处理及胰岛素耐量试验（ITT）流程。

结果

图2A 和 图3A 分别为典型数据（个体数据和平均数据），显示在注射胰岛素后15分钟内，糖尿病 db/db 小鼠的血糖水平出现反常升高，这与应激诱导的高血糖现象一致。值得注意的是，在接受相同操作的非糖尿病对照小鼠（db/+ 或 +/+）中，并未观察到血糖升高。为了确定对胰岛素耐量试验（ITT）操作的适应性训练是否能有效减轻这种血糖升高，同一批小鼠接受了上述适应性训练方案。图中每条垂直线代表一个主要操作步骤（图2B），每次处理小鼠时均采集血样。在 -150 分钟时进行抓取和/或生理盐水注射，导致4只 db/db 小鼠中的3只血糖升高（红色圆圈）；第四只小鼠的血糖水平>600 mg/dL。由于所用血糖仪的检测上限为600 mg/dL，因此无法确定第四只小鼠的血糖是否进一步升高。在 -90 分钟时再次抓取小鼠，导致其中2只血糖升高。对照组小鼠（蓝色三角形）的血糖水平在抓取过程中未受影响，但在 t = 0 时，其血糖水平较 -60 分钟时降低（150 ± 6 v...

讨论

高胰岛素-正常血糖钳夹技术被认为是评估体内胰岛素作用的金标准。对钳夹技术操作方法的改进使得该技术可在清醒、无束缚的小鼠中实施²，这些小鼠此前已通过双导管系统进行手术植入¹⁴，以便经由颈动脉采血和经由颈外静脉输注。这种方法限制了实验过程中对小鼠的抓取和束缚，从而减少了应激反应²。众所周知，应激可能干扰代谢研究中的多种终点指标^1,3。除抓取操作外，多种因素均可诱发应激，包括采血、嗅觉刺激、噪音、光照以及麻醉^3,4,5。下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）和自主神经系统（ANS）的继发性激活可对血糖水平产生显著影响^9,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50%葡萄糖	Pfizer Injectables	00409-6648-16	小鼠发生低血糖时使用。
纱布垫	Fisher Scientific	22037907	用于清除尾尖血凝块。
血糖仪	Accu-Chek	M001_us	用于测量血糖水平。
电子天平			用于测量体重。
胰岛素（诺和灵R）	Novo Nordisk	0169-1833-11	用于注射。
胰岛素注射器	VWR	BD-329461	用于注射。
计时器
无菌20 G针头	VWR	BD-305175	用于断尾取血。
无菌生理盐水	Lifeshield	1261699	用于注射。
手术剪	Fine Science Tools	14088-10	用于断尾取血。
血糖试纸	Accu-Chek	06908217001_us	用于测量血糖水平。