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方法文章

监督式机器学习用于肾小球肾炎中细胞外DNA的半定量分析

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DOI：

10.3791/61180

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2020年6月18日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Monash University, 2Monash Micro Imaging, Monash University, 3Immunology Department, Monash Health

本文内容

摘要

细胞死亡过程中释放的细胞外DNA（ecDNA）具有促炎性，并参与炎症反应。在损伤部位检测ecDNA可评估靶器官中治疗干预的效果。本方案描述了利用机器学习工具对肾组织中ecDNA的定量进行自动化测量的方法。

摘要

肾小球细胞死亡是髓过氧化物酶抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎（MPO-AAV）的病理特征。在包括凋亡、坏死、坏死性凋亡、中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）和焦亡在内的多种细胞死亡形式中，均会释放细胞外脱氧核糖核酸（ecDNA）。目前对这类细胞死亡的检测耗时较长，且需要多种不同的生物标志物来识别不同生化形式的细胞死亡。ecDNA的检测通常在血清和尿液中进行，作为肾损伤的替代指标，而非在发生病理损伤的实际靶器官中检测。当前在肾脏中研究ecDNA的主要困难在于，无论是实验研究还是存档的人类肾活检样本，均缺乏针对福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）的有效检测方法。本方案概述了在FFPE组织（包括人和小鼠来源）中对ecDNA进行染色、淬灭自发荧光，并利用公开可用的开源ImageJ插件“可训练Weka分割”（trainable Weka segmentation）对所得图像中的ecDNA进行定量分析的步骤。该Weka可训练分割工具应用于肾小球内的ecDNA识别，程序可学习并分类ecDNA信号。训练所得的分类器可应用于后续获取的肾脏图像，从而减少对每张图像进行人工标注的需求。该可训练Weka分割方法的适应性进一步在实验性小鼠抗MPO肾小球肾炎（GN）的肾组织中得到验证，可用于识别NETs和细胞外MPO（ecMPO），这两者均为抗MPO GN常见的病理因素。本方法实现了对肾组织中ecDNA的客观分析，清晰展示了可训练Weka分割程序在区分健康正常肾组织与病变肾组织中ecDNA方面的有效性。该方案可轻松拓展应用于其他器官中ecDNA、NETs及ecMPO的识别。

引言

髓过氧化物酶抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎（MPO-AAV）是一种自身免疫性疾病，可导致肾功能衰竭，其病理特征为肾小球损伤，伴随大量细胞死亡和脱氧核糖核酸（DNA）释放1,2。DNA可通过作为危险信号激活免疫系统。在正常健康状态下，DNA位于细胞核内，从而避免与免疫系统接触。在病原过程或自身免疫状态下，细胞外释放的自身DNA会被免疫系统识别为一种强效的促炎性损伤相关分子模式（DAMP）3。细胞外DNA（ecDNA）可通过多种不同的生化通路介导的机制从死亡细胞中释放，例如凋亡、坏死性凋亡、中性粒细胞胞外诱捕网形成（NETs）、坏死或焦亡4,5,6,7,8。

本文描述了在实验性抗MPO GN的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肾脏组织切片以及MPO-AAV患者肾活检样本中，对来自死亡细胞所释放的细胞外DNA（ecDNA）进行染色和定量的方法9,10。目前已有多种方法可用于检测血清和尿液中的循环双链DNA（dsDNA）及DNA复合物，以及体外实验中的相关成分11,12。这些方法虽然能够准确测定ecDNA的含量，但无法确定ecDNA在解剖学上的释放位置。已有部分方法可特异性检测与细胞凋亡相关的ecDNA，例如TUNEL法，以及细胞碎片的检测方法13,14。然而，尚无一种方法可用于在发生病理损伤的FFPE肾脏组织中，对所有形式细胞死亡所累积的ecDNA进行定量检测。该技术的建立对于判断实验性治疗手段是否能够清除靶器官内病理损伤部位的ecDNA具有重要意义。

从肾脏样本获取的多幅图像会产生大量数据，通常由单个用户进行分析。这种分析方式耗费人力、耗时较长，且由于存在用户主观偏差，其他用户难以获得可靠且可重复的结果。Trainable Weka Segmentation 是 ImageJ 的一款开源软件插件，利用前沿的生物信息学工具，通过机器学习算法对像素进行分类。15,16. 该方法是 "可训练的" 通过学习用户对像素片段的分类，并将新学到的分类结果应用于其他图像。该方法依赖于 ImageJ 程序中常用的分析工具，这些工具被用于 "分类" 将每个像素归类为属于特定片段 "班级"程序一旦学会 "分类器"，可用于识别同一图像中其他类似的已分类区域。该模型随后会被保存，并应用于同一批实验中的其他图像组。

目前在肾组织切片中就地检测ecDNA的主要障碍是福尔马林固定引起的内源性自发荧光，以及图像分析过程的劳动强度较大。本文描述了如何淬灭这种自发荧光、检测ecDNA，并利用有监督的机器学习实现ecDNA的高通量定量分析。我们此前已发表过使用ImageJ宏程序测量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）和细胞外髓过氧化物酶（ecMPO）的方法，现进一步展示如何通过有监督的机器学习实现这些方法的半自动化1。我们还展示了该机器学习工具的可适应性，能够在同一图像中对NETs和ecMPO的替代染色进行分类识别。本文所述的ecDNA、NETs和ecMPO检测染色方法可推广至其他实体器官和疾病，例如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮，在这些疾病中ecDNA、NETs和ecMPO在推动疾病进展中发挥重要作用17,18。

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方案

该方法能够检测到各种细胞死亡形式中的泛ecDNA。人类肾活检组织（从第4步起）也采用相同的方法和抗体。所有动物和人类受试者均获得澳大利亚维多利亚州克雷顿市莫纳什大学及莫纳什医疗的伦理批准。

1. 使用 DAPI 和 β-肌动蛋白对 ecDNA 进行染色

  1. 在8至10周龄的C57/Bl6小鼠中诱导20天抗髓过氧化物酶肾小球肾炎（anti-MPO-GN）模型，并设置对照组9。
    1. 使用CO2麻醉舱以人道方式处死小鼠。
    2. 用剪刀沿皮肤前正中线切开，然后小心切开腹膜并将其固定在解剖板上。用镊子推开前肾筋膜和壁层腹膜，于肾盂处切断输尿管及血管（肾动脉和肾静脉），将肾脏完整取出。用镊子夹取肾脏，并用22号手术刀沿矢状面切成两半。
    3. 将肾脏置于固定液（4%磷酸盐缓冲甲醛）中，在室温（RT）下固定16小时。取出后，将固定好的肾脏在30%乙醇中浸泡24小时，再进行后续处理。
  2. 采用标准6小时程序处理肾脏：
    70%乙醇，15分钟
    90%乙醇，15分钟
    100%乙醇，15分钟
    100%乙醇，20分钟
    100%乙醇，25分钟
    100%乙醇，30分钟
    二甲苯，20分钟
    二甲苯，30分钟
    二甲苯，40分钟
    石蜡，30分钟
    石蜡，35分钟
    石蜡，40分钟
    注意：此步骤至关重要，因肾脏不宜在石蜡中长时间受热，否则可能破坏目标抗原。
  3. 使用切片机切取3 µm厚的切片，并将其贴附于市售的带正电荷的载玻片上。室温下过夜干燥。
  4. 将载玻片放入玻片架中，置于60 °C烘箱中加热60分钟。
    注意：步骤1.3和1.4对于防止切片在抗原修复过程中脱落至关重要。
  5. 在通风橱中，将载玻片浸入溶剂（二甲苯或替代品）中，更换两次，每次40分钟。
  6. 依次在100%乙醇、100%乙醇、70%乙醇中各再水化5分钟。随后用自来水冲洗5分钟。
  7. 将加热板置于通风橱中，在压力锅内预煮抗原修复液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 9.0）。一旦抗原修复液开始沸腾，立即用镊子将载玻片水平放入锅中，并锁紧锅盖。在高温下（相当于15 psi或103 kPa）煮沸10分钟。
    注意：此步骤至关重要，因其通过解蔽因甲醛固定而交联的抗原表位，恢复目标抗原的可识别性；若无此步骤，后续的抗体特异性结合染色将无法实现。
  8. 将压力锅从热源移开，并立即在水槽中用冷水冲洗锅盖以降温开盖。让载玻片在抗原修复液中平衡20分钟。
  9. 在旋转摇床上，用0.01 M磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）清洗载玻片两次，每次5分钟。
  10. 使用疏水性笔在肾组织周围画圈，注意在此过程中避免组织干燥。
  11. 用含10%鸡血清的5%牛血清白蛋白（BSA）/PBS（pH 7.4，0.01 M）对组织进行封闭，每张切片加60 µL，孵育30分钟。此步骤后无需清洗，用60 µL移液器小心吸除封闭液，注意防止切片干燥。
  12. 加入β-肌动蛋白（β-actin）一抗混合液，按1/1000比例用1% BSA/PBS（pH 7.4，0.01 M）稀释，每张切片加60 µL，在4 °C湿盒中过夜孵育。
  13. 在旋转摇床上，用PBS（pH 7.4，0.01 M）清洗载玻片两次，每次5分钟。
  14. 加入二抗（鸡抗兔488，1/200稀释），用1% BSA/PBS（pH 7.4，0.01 M）稀释，每张切片加60 µL，在室温下孵育40分钟。
  15. 在旋转摇床上，用PBS（pH 7.4，0.01 M）清洗载玻片两次，每次5分钟。
  16. 将载玻片浸入含0.3%苏丹黑的70%乙醇溶液中，在Coplin染色缸中处理30分钟。
    注意：此步骤至关重要，因其可淬灭由甲醛固定引起的自发荧光。
  17. 用自来水冲洗载玻片以去除沉淀物，随后浸入PBS（pH 7.4，0.01 M）中10分钟，防止进一步形成苏丹黑沉淀。
  18. 在共聚焦显微镜盖玻片上滴加三滴60 µL含DAPI的封片剂，将载玻片封固，并用指甲油沿盖玻片边缘密封。
  19. 室温下静置24小时使DAPI充分渗透，随后置于4 °C避光保存。
    注意：必须避光保存，以防荧光探针褪色。
  20. 使用配备共聚焦激光扫描头的显微镜对载玻片进行成像。使用405 nm激光激发DAPI，488 nm激光激发β-肌动蛋白。采用逐线扫描模式并进行4线平均，采集单层1024 × 1024像素图像，此设置对检测ecDNA至关重要。使用40倍、数值孔径1.0的油镜。
    1. 每份样本至少成像20个肾小球。图像保存为ND2格式文件。

2. DAPI 和 β-肌动蛋白分析

  1. 安装 ImageJ：https://imagej.net/Fiji/Downloads。
  2. 检查 插件 | 分割 | 可训练的 Weka 分割 菜单下是否提供了可训练的 Weka 分割功能。
  3. 将图像拖放到 ImageJ 工具栏中。点击 图像 | 颜色 | 拆分通道。将出现一幅显示 DAPI 蓝色染色的所有细胞核的图像，以及一幅显示 β-肌动蛋白绿色染色的图像，后者用于界定肾小球。
    1. 通过点击 颜色 | 合并通道，创建单个图像的合并文件，以绘制肾小球的兴趣区域（ROI）。弹出窗口将提示为每个通道分配颜色。为每个通道分配颜色后，勾选 创建复合图像 和 保留源图像 选项，然后点击 确定。将出现一幅合并的复合图像。
    2. 以 β-肌动蛋白染色为参考，围绕肾小球毛细血管丛绘制一个兴趣区域（ROI）。将此图像单独保存，以便在本实验方案结束时使用该 ROI。
  4. 对单独的蓝色 DAPI 图像执行高斯模糊。点击 处理 | 滤波器 | 高斯模糊，输入 1–2.00。图像将略微模糊，但细胞核变得平滑，背景也得到柔化。
    注意：此步骤旨在去除噪声，清除可能妨碍相关图像特征检测的人工伪影。
  5. 点击 插件 | 分割 | 可训练的 Weka 分割。
  6. 使用 ImageJ 工具栏中的线条工具，首先使用自由手绘工具（可选择线条、圆形或方形工具）描出完整细胞核的轮廓，然后将其添加至 添加类别 1 框中。
  7. 使用 ImageJ 工具栏中的线条工具，将背景区域划分至 类别 2 框中。
  8. 点击 Weka 分割窗口中的 创建新类别 按钮，并命名为 "ecDNA"。使用 ImageJ 工具栏中的线条工具，勾勒出被 DAPI 染色的核外 DNA 区域。
  9. 点击可训练 Weka 分割窗口中训练菜单下的 训练分类器 按钮。
    注意：停止 按钮将取代 训练分类器 按钮并保持显示，直到训练完成。训练过程中请勿点击此按钮，否则将中断流程。
  10. 点击 生成结果 按钮，生成一幅包含所有已分类成分的图像，包括完整细胞核、背景以及识别出的 ecDNA。
  11. 点击 获取概率 按钮。移动鼠标以获得一幅黑白图像，其中所选对象以白色高亮显示。
  12. 通过点击 图像 | 复制 来复制该图像。
  13. 使用鼠标切换至包含 ecDNA 的画面。应用阈值，仅保留被识别为 ecDNA 的区域。当阈值设置合适后，点击 应用。
  14. 如果在阈值处理后仍存在非 ecDNA 的 DNA 区域，请返回原始训练图像，添加更多分类器，并重复步骤 2.1–2.13。
  15. 点击 图像 | 图像调整 | 转为二值图像。复制步骤 2.3 中创建的肾小球 ROI，然后按 Ctrl+Shift+E。通过 编辑 | 选择 | 恢复 激活 Weka 窗口以恢复选择区域。点击 分析颗粒，该操作将仅测量肾小球内的 ecDNA 颗粒。
    注意：系统将生成一个结果表格，包含颗粒数量、面积、平均像素值以及含有 ecDNA 的肾小球区域百分比。这些结果可导出至电子表格并保存，供后续统计分析使用。
  16. 通过点击选项菜单中的 保存分类器，将分类器保存为 ecDNA.classifier，保存位置为桌面上的 ImageJ 应用程序文件夹。然后在选项菜单中点击 保存数据，将文件保存为 ecDNA.arff，存入 ImageJ 文件夹。由于肾小球的大小和形状每次都会变化，因此每次需手动添加 ROI，但程序已学习识别 ecDNA 的特征。
  17. 若要将模型重新应用于后续图像，请使用新图像重复步骤 2.1–2.5。在选项菜单中点击 加载分类器，然后选择步骤 2.16 中保存在 ImageJ 文件夹中的 ecDNAmodel.classifier。日志窗口将弹出并运行模型。
  18. 模型运行完成后，在选项菜单中点击 加载数据，选择步骤 2.16 中保存在 ImageJ 文件夹中的 ecDNA.arff 文件。点击 生成结果。如果生成的图像未能识别出全部细胞核、背景或 ecDNA，请点击重新训练分类器，添加更多分类器，并保存新模型。通过重复步骤 2.9–2.16 完成分析流程。
    注意：可使用多幅图像生成最终用于检测 ecDNA 的模型。该过程通过将模型应用于后续图像、添加更多分类器并将新模型和数据保存至 ImageJ 文件夹来实现。当不同样本背景较高时，此方法尤为重要。Weka 分割程序还兼容 ImageJ 宏语言，使得许多命令可通过宏记录实现部分步骤的自动化。

3. 中性粒细胞胞外诱捕网和ecMPO的检测

注意：该方法通过细胞外DNA、瓜氨酸化组蛋白肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）和髓过氧化物酶（MPO）的共定位来鉴定中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。

  1. 在8-10周龄的C57/Bl6小鼠中诱导20天抗髓过氧化物酶肾小球肾炎（anti-MPO-GN）模型，并设置对照组9。
    1. 使用CO2麻醉舱以人道方式处死小鼠。
    2. 用剪刀沿皮肤前正中线切开，然后小心切开腹膜并将其固定在解剖板上。用镊子推开前肾筋膜和壁层腹膜，于肾盂处切断输尿管及血管（肾动脉和肾静脉），将肾脏完整取出。用镊子夹取肾脏，并用22号手术刀沿矢状面切成两半。
    3. 将肾脏置于固定液（4%磷酸盐缓冲甲醛）中，室温（RT）固定16小时。取出后，将固定好的肾脏在30%乙醇中浸泡24小时，再进行后续处理。
  2. 采用标准6小时程序处理肾脏：
    70%乙醇，15分钟
    90%乙醇，15分钟
    100%乙醇，15分钟
    100%乙醇，20分钟
    100%乙醇，25分钟
    100%乙醇，30分钟
    二甲苯，20分钟
    二甲苯，30分钟
    二甲苯，40分钟
    石蜡，30分钟
    石蜡，35分钟
    石蜡，40分钟
    注意：肾脏组织不应在石蜡中长时间受热，以免破坏目标抗原。
  3. 使用切片机切取3 µm厚的切片，并将其贴附于市售的带正电荷的载玻片上。室温下过夜干燥。
  4. 将载玻片放入玻片架中，置于60 °C烘箱中加热60分钟。
    注意：步骤3.3–3.4至关重要，可确保切片在抗原修复步骤中不会脱落。
  5. 在通风橱中，将载玻片浸入两次新鲜溶剂（二甲苯或替代品）中，每次40分钟。
  6. 在100%乙醇、100%乙醇、70%乙醇中依次各5分钟，进行脱蜡复水。
  7. 用自来水冲洗5分钟。
  8. 将加热板置于通风橱中，于压力锅内预煮抗原修复液（10 mM Tris-1 mM EDTA，pH 9.0）。一旦修复液开始沸腾，立即用镊子将载玻片水平放入锅中，盖紧锅盖。在高温下（相当于15 psi或103 kPa）煮沸10分钟。
    注意：此步骤通过解蔽因甲醛固定而交联的抗原表位，恢复目标抗原的可识别性；若无此步骤，后续染色将无法有效进行。
  9. 将压力锅从热源移开，并立即在水槽中用冷水冲洗锅盖以快速降温开盖。让载玻片在抗原修复液中平衡20分钟。
  10. 在旋转摇床上，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4，0.01 M）洗涤载玻片两次，每次5分钟。
  11. 使用疏水性笔在肾组织周围画圈，注意在此过程中避免组织干燥。
  12. 用含10%鸡血清的5%牛血清白蛋白（BSA）/PBS（pH 7.4，0.01 M）溶液对组织进行封闭，每张切片加60 µL，封闭30分钟。此步骤后无需洗涤，用60 µL移液器小心吸除封闭液，注意防止切片干燥。
  13. 在1个离心管中配制一抗混合液，用1% BSA/PBS（pH 7.4，0.01 M）稀释，每张肾组织切片加60 µL。一抗浓度如下：
    兔抗人/小鼠H3Cit，1:100
    小鼠抗人/小鼠PAD4，1:50
    山羊抗人/小鼠MPO，1:200
  14. 在湿盒中4 °C孵育过夜。
  15. 在旋转摇床上，用PBS（pH 7.4，0.01 M）洗涤载玻片两次，每次5分钟。
  16. 在1个离心管中配制二抗混合液，用1% BSA/PBS溶液稀释，每张切片加60 µL，具体如下：
    鸡抗兔488，1:200
    鸡抗鼠647，1:200
    鸡抗山羊594，1:200
  17. 室温孵育40分钟。
  18. 在旋转摇床上，用PBS（pH 7.4，0.01 M）洗涤载玻片两次，每次5分钟。
  19. 每张切片加60 µL 1% BSA/PBS（pH 7.4，0.01 M）稀释的二抗（1:200），室温孵育40分钟。
  20. 在旋转摇床上，用PBS（pH 7.4，0.01 M）洗涤载玻片两次，每次5分钟。
  21. 将载玻片浸入含0.3%苏丹黑的70%乙醇溶液中，避光处理30分钟。
  22. 用自来水冲洗以去除沉淀物，随后浸入PBS（pH 7.4，0.01 M）中10分钟，防止进一步形成苏丹黑沉淀。
  23. 使用含DAPI的封片剂，分三滴（每滴60 µL）将载玻片封固于共聚焦显微镜专用盖玻片上。用指甲油沿盖玻片边缘密封。
  24. 室温下静置24小时（使DAPI充分渗透），然后置于4 °C避光保存。全程避光以防止荧光探针褪色。
  25. 使用配备共聚焦激光扫描头的显微镜对载玻片进行成像。使用405 nm激光激发DAPI，488 nm激光激发H3Cit，561 nm激光激发MPO，647 nm激光激发PAD4。采用逐线扫描模式并进行4次线平均，以提高信噪比，这对检测胞外DNA（ecDNA）至关重要。使用40倍、数值孔径1.0的油镜。每份样本至少成像20个肾小球。图像保存为ND2格式文件。

4. 中性粒细胞胞外诱捕网与ecMPO分析

  1. 安装 ImageJ：https://imagej.net/Fiji/Downloads。
  2. 检查 插件 | 分割 | 可训练的 Weka 分割 菜单下是否提供可训练的 Weka 分割功能。
  3. 将图像拖入 ImageJ。点击 图像 | 颜色 | 拆分通道。将出现一幅显示 DAPI 蓝色染色的所有细胞核的图像，一幅显示 H3Cit 绿色的图像，一幅显示 MPO 红色的图像，以及一幅显示 PAD4 白色的图像。
    1. 通过点击 颜色 | 合并通道，将单个图像合并为一个文件，以绘制肾小球的感兴趣区域（ROI）。弹出窗口将提示为每个通道分配颜色。为每个通道分配颜色后，勾选 创建复合图像 和 保留源图像 选项，然后点击 确定。合并后的图像将显示出来。与之前用于 ecDNA 的方案不同，我们将使用该复合图像完成后续所有步骤。
  4. 对复合图像执行高斯模糊处理，以平滑细胞核。点击 处理 | 滤波器 | 高斯模糊，输入 1.00–2.00。图像将略微模糊，但细胞核变得平滑，背景也得到柔化。
    注意：此步骤旨在去除噪声，清除可能干扰图像属性相关检测的人工伪影。
  5. 点击 插件 | 分割 | 可训练的 Weka 分割。将弹出一个包含待分析图像及 Weka 分割专用菜单工具的新窗口。
  6. 使用 ImageJ 工具栏中的线条工具，首先使用自由手绘工具勾勒出不表达全部 4 种 NET 成分（MPO、PAD4、DAPI 和 H3Cit）的完整细胞核，然后将其添加至 添加类别 1 框中。
  7. 使用 ImageJ 工具栏中的线条工具，将背景区域划入 类别 2 框中。
  8. 点击标签菜单中的 创建新类别 按钮，并将类别命名为 "NETs"。使用线条工具勾勒出共定位的 DAPI（蓝色）、MPO（红色）、PAD4（白色）和瓜氨酸化组蛋白（绿色）所标识的 NETs 区域。
  9. 点击标签菜单中的 创建新类别 按钮，并将类别命名为 "ecMPO"。使用线条工具勾勒出无细胞的 MPO（红色）区域。
  10. 点击可训练 Weka 分割窗口中训练菜单下的 训练分类器 按钮。
    注意：停止 按钮将取代 训练分类器 按钮并保持显示，直至训练完成。训练过程中切勿点击此按钮，否则将中断处理过程。
  11. 点击训练菜单中的 生成结果 按钮，生成一幅包含所有已分类成分的图像，包括完整细胞核、背景以及被识别为 ecMPO 的成分。
  12. 点击训练菜单中的 获取概率 按钮。移动鼠标以获得一幅黑白图像，其中所有类别以黑色显示，所选对象以白色高亮。
  13. 通过点击 图像 | 复制，复制 NET 概率图像和 ecMPO 概率图像。
  14. 使用鼠标切换至显示 NETs 的屏幕。应用阈值以确保仅高亮识别出的 NETs。在 ImageJ 菜单工具栏中，点击 图像 | 调整 | 阈值。移动滑动条，直到仅 NET 成分被高亮。满意后点击 应用。对 ecMPO 重复相同步骤。
  15. 若在阈值处理后仍检测到 ecMPO 或 NETs 的额外区域，返回原始训练图像，添加更多分类器，并重新执行步骤 4.1–4.14。
  16. 点击 图像 | 图像调整 | 转为二值图。复制步骤 4.3 中创建的肾小球 ROI，点击 Ctrl+Shift+E。通过 编辑 | 选择 | 恢复 激活 Weka 窗口以恢复选择区域。点击 分析颗粒，仅测量肾小球内的 NET 颗粒。
  17. 使用鼠标切换至显示 ecMPO 的屏幕。应用阈值以确保仅获取识别出的 ecMPO。满意后点击 应用。重复上述步骤 4.16。
    注意：系统将生成一个结果表，包含颗粒计数、面积、平均像素值以及含有 NETs 和 ecMPO 的肾小球区域百分比。这些结果可导入电子表格并保存，用于后续统计分析。
  18. 通过点击选项菜单中的 保存分类器，将分类器保存为 NETs.classifier，并将文件保存至桌面的 ImageJ 应用程序文件夹（ImageJ 文件夹）。然后点击选项菜单中的 保存数据，并保存为 NETs.arff 文件。每次使用时需手动添加肾小球 ROI，因为肾小球的大小和形状会变化，但程序已学习识别 NETs 和 ecMPO 的特征。
  19. 若要将模型应用于后续图像，请使用新图像重复步骤 4.1–4.5。从选项菜单中点击 加载分类器。在 ImageJ 文件夹中选择 Nets.classifier。日志菜单将弹出并运行模型。模型运行完成后，点击选项菜单中的 加载数据，并选择 NETs.arff 文件。
    1. 点击 生成结果。若生成的图像未能识别全部细胞核、背景或 ecDNA，请点击重新训练分类器，添加更多分类器，并保存新模型。通过重复步骤 4.11–4.19 完成分析流程。
      注意：可使用多幅图像生成最终用于检测 ecDNA、ecMPO 和 NETs 的模型。方法是将模型应用于后续图像，添加更多分类器，并将新模型和数据保存至 ImageJ 文件夹。当不同样本背景较高时，此步骤尤为重要。Weka 分割程序兼容 ImageJ 宏语言，因此许多命令可被宏记录，从而实现部分步骤的自动化。

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结果

这些图像展示了成功使用可训练的Weka分割方法来减少对小鼠诱导抗MPO GN的荧光染色FFPE肾组织中ecDNA进行劳动密集型手动测量所需的多个步骤。这些步骤在图1和图2中进行了总结，图像直接取自Weka分割程序，概述了分析过程中的每一步。随后在图3中展示了该分析的测量结果，证明了该程序能够确定在未诱导抗MPO GN的对照组织中沉积于肾小球内的不同量的ecDNA。图4表明，该ecDNA模型可被调整用于识别对照患者（微小病变疾病患者的肾小球在组织学水平上几乎无损伤）以及MPO-AAV患者的肾活检标本中的ecDNA。图5展示了该程序在肾组织中其他染色方法中的可转化能力。我们使用了一例诱导实验性抗MPO GN小鼠肾组织的代表性样本，对NETs和ecMPO进行染色，随后利用可训练的We...

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讨论

目前已有多种检测肾小球肾炎患者及小鼠模型血清和尿液中促炎标志物的实验方案。本方案可直接分析肾小球内细胞死亡产物（ecDNA、NETs 和 ecMPO）。该方案中最关键的步骤是组织制备和成像。采用荧光染色法进行分析时，主要限制因素是组织自发荧光。经甲醛固定、石蜡包埋的组织易产生自发荧光，可能掩盖特异性荧光信号。染色方法的最后一步是将切片浸入苏丹黑溶液，可有效减弱组织自发荧光，通过降低信噪比，凸显抗体特异性染色信号19。组织成像时必须使用至少40倍油镜放大倍数，以便检测较小的ecDNA和MPO片段。成像过程中，必须采用逐线扫描方式采集图像，以确保不同荧光标记之间无信号串扰。

该分析方案的一个优势在于其通过ImageJ提供开放获取，可供任何人使用16我们已在此证明，该方法可轻松适用于检测肾组织内不同的荧光标记物。一旦在Trainable Weka Segmentation中确定了模型，便可无偏倚地以完全相同的方式应用于后续图像的分析。这种分析的监督性质允许通过额外的阈值设定步骤对分割中的任何误...

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致谢

我们感谢莫纳什显微成像中心提供尼康C1直立共聚焦激光扫描显微镜的使用，以及莫纳什组织学平台对肾组织的处理。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
牛血清白蛋白SIGMAA2153用 PBS 配制成 5% 和 1% 溶液，可批量配制后冷冻保存——解冻后即弃用。
鸡抗山羊 IgG（H+L）交叉吸附抗体 Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-21468使用前在小型离心机中离心 1 分钟，以避免抗体混合液中存在游离偶联物
鸡抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附抗体，Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA-121468使用前在小型离心机中离心 1 分钟，以避免抗体混合液中存在游离偶联物
鸡抗兔 IgG（H+L）交叉吸附抗体 Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-21441使用前在小型离心机中离心 1 分钟，以避免抗体混合液中存在游离偶联物
鸡血清SIGMAC5405用 1% BSA/PBS 配制
盖玻片 24 × 60 mmAzerscientificES0107222#1.5，此为非标准厚度——专为共聚焦显微镜设计
EDTA 10 mMSIGMAE6758将 TRIS 与 EDTA 溶于蒸馏水中，调 pH 至 9，用于抗原修复，可配制成 10 倍浓度溶液
乙醇 30%、70% 和 100%Chem SupplyUN1170以 100% 未变性乙醇形式提供——用蒸馏水稀释至 30% 和 70%
甲醛 4%（10% 中性缓冲福尔马林）TRAJANNBF-500将肾脏组织放入含 3 ml 福尔马林的 5 ml 管中，室温固定 16 小时，福尔马林应在通风橱中使用
组织学载玻片 — Ultra Super Frost，Menzel Glaser，25 × 75 × 1.0 mmTRAJANJ3800AM4必须使用带正电荷涂层的载玻片。不推荐使用多聚-L-赖氨酸包被载玻片，因为在抗原修复步骤中组织易从载玻片脱落
山羊抗人/小鼠 MPO 抗体R&DAF3667收到后分装并于 -80°C 冷冻保存
HistosolClini PureCPL HISTOSOL 08直接使用，置于 200 ml 染色架容器中，在通风橱中操作
疏水笔VECTOR LabsH-400用于在肾脏组织周围画圈
小鼠抗人/小鼠肽基精氨酸脱亚胺酶 4（PAD4）ABCAMab128086收到后分装并于 -80°C 冷冻保存
尼康 C1 共聚焦激光扫描头，连接至尼康 Ti-E 倒置显微镜Coherent Scientific收到后分装并于 -80°C 冷冻保存
磷酸盐缓冲液SIGMAP381350.01 M PB/0.09% NaCl，每次配制 5 L
6 L Tefal Secure 5 Neo 不锈钢压力锅TefalGSA-P2530738在当地家居用品商店购买
Prolong Gold DAPILife TechnologiesP36962直接滴加至盖玻片上
兔抗人/小鼠 Beta Actin 抗体ABCAMab8227收到后分装并于 -80°C 冷冻保存
兔抗人/小鼠 H3Cit 抗体ABCAMab5103收到后分装并于 -80°C 冷冻保存
24 片染色架ProScitechH4465所选染色架必须能耐受加压煮沸及在 60°C 烤箱中孵育
苏丹黑 BSIGMA1996640.3%，将 3 g 加入 1 L 瓶中，溶于 70% 乙醇，过滤后避光保存——室温下可稳定保存 6 个月
Tris 10 mMSIGMAT4661将 TRIS 与 EDTA 溶于蒸馏水中，调 pH 至 9，用于抗原修复，可配制成 10 倍浓度溶液
二甲苯TrajanXL005/20必须在通风橱中使用

参考文献

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