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方法文章

鉴定和表征尘螨过敏原中调节嗜酸性粒细胞肺部炎症的免疫原性RNA种类

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DOI：

10.3791/61183

⸱

2020年5月30日

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, Long School of Medicine, University of Texas Health San Antonio, 2Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Applied Medical Sciences, Jouf University, 3Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Xiangya Hospital, Central South University

本文内容

摘要

环境过敏原（如屋尘螨（HDM））通常含有可激活先天免疫反应以调节过敏性炎症的微生物成分。本文所述方案展示了如何鉴定HDM过敏原中的双链RNA（dsRNA）成分，并表征其在调控嗜酸性粒细胞肺部炎症中的免疫原性活性。

摘要

环境过敏原（如屋尘螨（HDM））通常以复杂形式存在，其中既包含可引发异常2型免疫应答的过敏性蛋白，也含有可诱导固有免疫应答的微生物成分。这些与过敏原相关的微生物组分在调控2型炎症性疾病（如过敏性哮喘）的发生发展中起着重要作用。然而，其潜在机制在很大程度上仍不明确。本文所述方案旨在确定过敏原相关免疫刺激性RNA的结构特征及其体内活性。具体而言，检测常见过敏原中是否存在可激活肺部干扰素（IFN）应答并抑制 在尘螨（HDM）诱导的过敏性哮喘小鼠模型中，出现严重的肺嗜酸性粒细胞增多。本文包括以下三种检测方法：点印迹（Dot blot）用于显示从包括HDM物种在内的过敏原中分离的总RNA中的双链RNA（dsRNA）结构；逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）用于测定HDM RNA在小鼠肺组织中对干扰素刺激基因（ISGs）表达的激活作用；流式细胞术（FACS）分析用于分别评估HDM RNA对支气管肺泡灌洗液（BAL）和肺组织中嗜酸性粒细胞数量的影响。

引言

根据Strachan最初提出的卫生假说1，儿童早期接触内毒素等环境微生物因子可预防过敏性疾病的发生2,3。在微生物感染（例如病毒感染）过程中，宿主先天免疫系统对异源核酸（RNA/DNA）的识别可触发防御反应4,5,6。然而，屋尘螨（HDM）或其他昆虫过敏原中是否存在具有免疫原性的核酸（如长链双链RNA（dsRNA））及其流行程度目前尚不清楚。本实验方案旨在确定屋尘螨或昆虫及非昆虫过敏原中是否含有能够激活保护性免疫反应的长链dsRNA，以抑制过敏性哮喘小鼠模型中严重的嗜酸性粒细胞肺部炎症的发展。本文提供了三种简单快速的方法，用于评估屋尘螨总RNA中调控过敏原诱导的嗜酸性粒细胞肺部炎症所必需的结构决定因素。

黏膜免疫系统是人体最大的免疫器官，在抵御微生物感染和过敏性损伤方面发挥着宿主防御的第一道防线作用7,8。长链双链RNA（dsRNA）是多种病毒复制过程中的中间产物，已被证实可作为病原体相关分子模式（PAMP），通过Toll样受体3（TLR3）强烈激活先天免疫反应，诱导干扰素刺激基因（ISGs）的表达9,10,11,12,13,14。我们近期研究发现，屋尘螨（HDM）总RNA中含有dsRNA结构，当通过气管内滴注方式在HDM提取物诱导的小鼠过敏性哮喘模型中给予时，可上调ISGs的表达，并减轻严重的嗜酸性粒细胞肺部炎症15。肺部炎症的严重程度通过流式细胞术分析支气管肺泡灌洗液（BAL）及肺组织中的免疫细胞类型来确定16,17,18,19,20。

本方案包含三个实验：1）利用小鼠单克隆抗体J2通过RNA点印迹法快速检测双链RNA（dsRNA）结构，该抗体能够以序列无关的方式特异性结合长度≥40 bp的dsRNA；2）通过RT-qPCR检测干扰素刺激基因（ISGs）的诱导水平，快速评估免疫刺激性RNA在小鼠肺组织中的体内效应；3）在屋尘螨（HDM）诱导的肺部炎症背景下，采用流式细胞术对支气管肺泡灌洗液（BAL）和肺组织中的嗜酸性粒细胞进行精确定量分析。

上述检测方法不仅可用于研究过敏性肺部疾病，还可用于研究呼吸道细菌和病毒感染。例如，特异性识别双链RNA的J2抗体还可应用于其他实验，如免疫亲和层析、免疫组织化学、酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫染色21,22,23。此外，在支气管肺泡灌洗液收集之后，还可采用多种下游应用来定量分析可溶性成分，如通过ELISA检测细胞因子和趋化因子，并对气道内细胞（例如肺泡巨噬细胞）进行转录谱分析。尽管文献中已有多种评估肺部状况的实验方案，但这些方案大多集中于靶点验证。本文所述方法可用于鉴定环境过敏原中调控过敏性疾病发生发展的关键组分。

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方案

本研究所述实验程序已获德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥分校机构动物照护与使用委员会批准。

1. 点印迹法检测屋尘螨总RNA中dsRNA结构的存在

  1. 从过敏原、昆虫及非昆虫过敏原中提取总RNA
    1. 将采集的活体屋尘螨（HDM）、昆虫或非昆虫动物，或购自商业来源的样本放入50 mL离心管中，迅速用液氮冷冻2. 然后于 -70 °C 用于后续总RNA提取。
      注意：本实验选择屋尘螨（HDM）、昆虫和非昆虫动物，是因为它们是已知常见的过敏原来源。此外，这些生物的RNA是否具有免疫刺激功能尚不明确。
    2. 转移适量（相当于 100 μL 体积或更小的尘螨、昆虫或非昆虫动物，储存在 -70 °C 加入含有珠子（1.4 mm 陶瓷球）的 2 mL 管中，然后将试管置于液氮中冷冻2 容器中放置约10分钟。
    3. 用于总RNA提取时，加入1 mL基于硫氰酸胍的RNA提取试剂24 向每个试管中加入，然后使用高能细胞破碎仪在最大速度下破碎昆虫及非昆虫小型动物，持续45秒，并在冰上冷却。重复此步骤两次。
    4. 将步骤1.1.3中的溶液转移至一个新的1.5 mL离心管中，并加入 200 μL 加入氯仿至各管，涡旋混匀。在14,000 ×g条件下离心 x g 14 分钟 4 °C.
    5. 离心完成后，转移上层水相（200 μL) 转移至含有 500 μL 加入异丙醇以沉淀RNA沉淀物。切勿扰动中间相。上相与异丙醇的推荐体积比为1:2.5。
    6. 轻柔涡旋混匀，然后将离心管在14,000 × g条件下离心 x g 14 分钟 4 °C.
    7. 小心吸除上清液，然后用 500 μL 75%乙醇，7,500离心 x g 10 分钟 4 °C. 小心移除所有液体，将沉淀空气干燥后，用 20-50 μL 无RNase的H2O.
    8. 使用分光光度计，按照以下参数测定RNA浓度：
      1. 打开相关软件，选择要测量的核酸类型。将样本类型更改为RNA。
      2. 使用1-进行空白测定2 μL 无RNase的H2O. 用无RNase的H2O. 现在，仪器已准备就绪，可进行测量。
      3. 加载 1-2 μL RNA样品的浓度并测定RNA浓度（μg/μL).
        注意：RNA 在 260 和 280 nm 处的吸光度比值（A260/280）约为 2.0（1.9–2.2）时，通常被认为是“纯”的。若不能立即进行后续处理，应将 RNA 样品保存于 -70 ℃ ˚C，并避免冻融循环，以保持RNA完整。
  2. 利用dsRNA特异性J2抗体检测总RNA中的dsRNA结构
    1. 准备两份 20 μL RNA 样本（200 ng/μL）。一个经过RNase-III处理（1 μL 用于 1 μg RNA，于指定温度孵育 37 °C 60 分钟），另一组不进行 RNase-III 处理。
      注意：此处使用 RNase III 特异性降解 dsRNA，而不降解单链 RNA25.
    2. 用铅笔在膜上标记出RNA样品将要点样的网格位置。
    3. 斑点 2 μL 200 纳克/μL 将RNA样品转移至带正电荷的尼龙膜上。
    4. 在紫外交联仪中以1,200微焦耳×100的剂量将样品交联至膜上。在样品点样位置重复步骤1.2.3和1.2.4两次。最终总量将达到0.8 μg 每块印迹。
      注意：点样量不得超过 2 μL 每次在膜上点样一个RNA样本。
    5. 用含5%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液在室温下振荡孵育1小时，以封闭非特异性结合位点。移除步骤1.2.5中的封闭液，加入以含1%脱脂奶粉的TBS-T缓冲液按1:1,000比例稀释的抗dsRNA J2抗体，于4°C振荡孵育过夜。 4 °C.
    6. 用 TBS-T 缓冲液洗涤膜 5 分钟，并重复此步骤 3 次。加入二抗（碱性磷酸酶标记的 Anti-Mouse IgG，用 1% 脱脂牛奶按 1:5,000 稀释），于室温在摇床上孵育 1 小时。用 TBS-T 缓冲液洗涤膜 5 分钟，并重复此步骤 3 次。
    7. 加入底物（BCIP/NBT），孵育5-15分钟，直至出现理想的信号。
    8. 通过用 ddH₂O 冲洗膜来终止反应2O.
    9. 用纸巾将膜干燥，并用智能手机拍照（结果示例如下图所示） 图1).

2. 采用RT-qPCR检测HDM总RNA刺激肺部ISGs表达的能力

  1. 从小鼠肺组织中分离RNA
    注意：小鼠（雌性，8–12 周龄，C57BL/6J）在特定无病原体条件下饲养。
    1. 用异氟烷短暂麻醉动物，随后通过气管内滴注给药 5 μg （用……稀释） 80 μL PBS) 经 RNase III 处理与未处理的 HDM RNA
    2. HDM RNA 处理后 16–18 小时，通过 CO2 吸入数分钟后，将小鼠置于平台上，用针固定四肢。
    3. 用70%乙醇对小鼠进行消毒，然后使用灭菌剪刀从腹部开始沿中线剪开皮肤至颈部。
    4. 用针固定皮肤，剪开肋骨以暴露肺部。取出整块肺组织，用冷的PBS冲洗。将肺组织置于滤纸上，分别从每个肺叶切取一小块组织放入含有珠子的2 mL离心管中（200-300 μL 体积为1.4 mm的陶瓷珠。
      注意：使用陶瓷珠的目的是研磨整肺组织
    5. 将试管放入液氮中冷冻肺组织样本2 容器中放置约10分钟。
    6. 添加 500 μL 加入基于硫氰酸胍的RNA提取试剂至各管中，使用匀浆器破碎肺组织45秒。每次操作间将样本置于冰上冷却。重复此步骤两次。
    7. 按照步骤 1.1.4–1.1.7 进行肺组织 RNA 提取。
    8. 空气干燥沉淀，并用适量无RNase的H2O（约20-30 μL).
    9. 按照步骤1.1.8中所述方法测定RNA浓度。
  2. 采用RT-qPCR检测HDM RNA刺激肺部基因表达的能力。
    1. 使用 100 ng/μL 以肺组织中提取的RNA为模板，按照参考方案进行cDNA合成26.
    2. 设置一个 RT-qPCR 反应 10 μL/well 使用上述生成的 cDNA 和基因特异性引物对，在 384 孔板中进行表1 和 表2).
    3. 用透明粘性封膜严密密封各孔，涡旋混匀 30 秒。以 1,000 × g 离心平板 x g 30 秒，以收集各孔底部的样品。
    4. 将 PCR 板装载到实时荧光定量 PCR 仪上，并使用热循环仪程序开始运行 RT-qPCR 反应（表3).
    5. 程序完成后，将结果导出至电子表格文件，或使用制造商提供的软件进行数据分析（代表性结果如图所示） 图2).

3. 通过流式细胞术分析 HDM RNA 对 BAL 和肺组织中嗜酸性粒细胞浸润的影响

  1. 用于FACS分析的BAL液体采集
    1. 处死经HDM变应原提取物处理的小鼠（雌性，8-12周龄，C57BL/6J），处理方案依据所示实验设计进行 图3B）由 CO2 吸入
    2. 将小鼠置于平台上，用针固定四肢。
    3. 用70%乙醇对小鼠进行消毒。使用剪刀从腹部上方区域向颈部剪开皮肤。
    4. 用镊子轻轻将唾液腺与胸骨舌骨肌小心分离，以暴露气管。用镊子将一根尼龙线（约10 cm）从气管下方穿过。
    5. 在喉部下方约 2 mm 处的气管上做一切口，切口大小以刚好能插入导管为宜。切勿切断气管。用线将气管与导管结扎固定。
    6. 用1 mL PBS+EDTA装填注射器，并将其连接至套管末端。将1 mL PBS+EDTA注入肺部，然后完全吸出液体。小心地将注射器从套管上取下并转移 将溶液加入预置冰上的15 mL离心管中。
    7. 用新鲜的PBS+EDTA重新装填注射器，并重复此步骤2次。
    8. 离心步骤3.1.7中获得的含合并BAL的离心管，以500 × g离心沉淀细胞 x g 7 分钟 4 °C记录BAL液体积，然后将上清液转移至两支1.5 mL离心管中，注意勿扰动沉淀。
      注意：BAL 上清液可保存在 -70 °C 用于后续分析，例如 ELISA。
    9. 如果由于严重的肺部炎症导致沉淀物中存在红细胞，在去除上清液后，加入 500 μL 加入红细胞裂解缓冲液，重悬混匀。将溶液转移至新的1.5 mL离心管中，以500 × g离心7分钟 x g 在 4 °C.
    10. 移除上清液，并将沉淀重悬于 150 μL FACS缓冲液
    11. 转移 150 μL 将重悬的样品加入96孔板中，以500 × g离心7分钟 x g 在 4 °C.
    12. 迅速将培养板倒置在纸巾上，以收集位于孔底部的细胞。
    13. 在含有 2.4G2 封闭抗体的 FACS 缓冲液中，用抗体对细胞进行染色（2.5 μg / 100 μL）。在室温下避光孵育平板30分钟。
    14. 染色后，以500 × g离心培养板，使细胞沉淀 x g 7 分钟 4 °C.
    15. 将培养板倒置在纸巾上以去除染色液，然后通过重悬进行洗涤 100 μL FACS缓冲液。接着，将培养板再次在500 × g下离心 x g 7 分钟 4 °C 将培养板倒置在纸巾上，去除FACS缓冲液。
    16. 将样品重悬于 150 μL FACS 缓冲液，并将样品转移至含有 FACS 缓冲液的 FACS 管中 350 μL FACS 缓冲液。加入 25 μL 向每个样本中加入计数微球。样本现可进行流式细胞术分析。
      注意：如所示，使用抗体标记支气管肺泡灌洗液中的多种细胞类型。流式细胞术检测前加入计数微球。流式细胞术数据采用市售软件进行分析。参见 图3 和 表4 用于门控策略。
  2. 用于FACS分析的肺组织消化
    1. 按照步骤 3.1.1 - 3.1.3 进行操作。
    2. 从腹部开始用灭菌剪刀剪开皮肤至颈部。用针固定皮肤，剪开肋骨以暴露肺脏。
    3. 取出整个肺组织，用冷的PBS洗涤。将样品置于含有 50 μL 肺组织消化液
    4. 用弯头剪刀将肺组织剪成小块。将肺组织转移至6孔板中，加入8 mL肺组织消化液。将培养板置于摇床中 37 °C 孵育箱中孵育45分钟。
    5. 孵育后，使用1.5 mL离心管的管盖研磨肺组织。将一个 70 µm 将滤器置于新的6孔板上，并通过滤器加入样品 0.22 µm 过滤器
    6. 将过滤后的溶液转移至15 mL离心管中，然后在500 ×g条件下离心 x g 7 分钟 4 °C吸弃上清液，将沉淀重悬于1 mL红细胞裂解缓冲液中，冰上静置3 min。
    7. 将样品转移至 1.5 mL 离心管中，在 500 ×g 条件下离心 x g 7 分钟 4 °C重复 2 次
    8. 用 1 mL FACS 缓冲液洗涤肺细胞 2 次。吸除上清液，将沉淀重悬于 1 mL FACS 缓冲液中，然后转移 100 μL 将样品加入96孔板中。
    9. 将培养板以500 × g离心7分钟 x g 在 4 °C按照肺组织消化样本细胞染色的步骤（3.1.13 至 3.1.16）进行操作，以用于流式细胞术分析支气管肺泡灌洗液样本。
      注意：肺部嗜酸性粒细胞经指定抗体标记后，与计数微球混合，用于后续流式细胞术分析。流式细胞术数据采用配套软件进行分析。参考 图3 用于评估屋尘螨RNA诱导的免疫反应。

4. 统计分析

  1. 使用商业化的软件进行统计分析。
  2. 通过非配对双尾 Student t 检验比较两组数据，确定 p 值。
  3. 根据参考微球（上图）的绝对计数，使用以下公式计算嗜酸性粒细胞的绝对数量

figure-protocol-1

  1. 确定 p 采用双因素方差分析（two-way ANOVA）及Sidak多重比较检验对多个组别进行比较。
  2. 考虑一个 p 将小于 0.05 的值视为具有统计学意义。 p 数值在图中以 *p 标注 <0.05，**p<0.01，***p<0.001，以及 ****p<0.0001.
    注意：所有缓冲液配方均以 表5.

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结果

采用dsRNA特异性小鼠单克隆抗体J2（≥ 40 bp）通过点印迹法检测了HDM、昆虫及非昆虫小型动物中长dsRNA结构的存在。使用RNase III将dsRNA消化为12–15 bp的dsRNA片段，这些片段无法被J2检测到（图1）。

屋尘螨总RNA以剂量依赖方式刺激小鼠肺部先天免疫反应的能力 通过RT-qPCR进行分析（图2，上图）。RNase III 处理消除了 HDM 总 RNA 的免疫刺激活性，表明 HDM 总 RNA 中的 dsRNA 结构对于肺部的天然免疫活性至关重要（图2，较低。

通过流式细胞术分析评估了屋尘螨（HDM）总RNA对严重2型肺部炎症发展的抑制作用（图3A）。在本研究中，嗜酸性粒细胞肺部炎症由屋尘螨提取物诱导，这些提取物经RNase III处理或未处理，...

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讨论

本方案描述了如何评估与过敏原相关的微生物RNA的免疫刺激特性及其在过敏性哮喘小鼠模型中对嗜酸性粒细胞肺部炎症发展的效应。尽管长链双链RNA（dsRNA）已被公认是多种病毒复制过程中的中间产物，可强烈激活哺乳动物细胞的干扰素反应，但其在屋尘螨（HDM）过敏原中的存在直到我们近期的工作15才被揭示。本文所采用的RNA点杂交、逆转录定量PCR（RT-qPCR）和流式细胞术（FACS）分析相结合的方法，可为解析环境过敏原中参与调控过敏原诱导的嗜酸性粒细胞炎症的关键固有免疫组分（如dsRNA种类）提供一个良好范例。

在本实验方案中，采用RNA点杂交法，利用小鼠单克隆抗体J2检测天然变应原中双链RNA（dsRNA）结构的存在。该抗体可特异性结合长度不小于40 bp的dsRNA，且不受序列影响。该方法具有高度可靠性，因为J2抗体仍可识别经RNase T1（特异性切割单链RNA的内切核酸酶）预处理的dsRNA样品，但无法识别经RNase III（特异性切割dsRNA的内切核酸酶）预处理的样品。然而需要指出的是，一种广泛使用的dsRNA合成类似物——多...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

感谢 Karla Gorena 女士在流式细胞术方面的技术支持。L.S. 受中国国家留学基金管理委员会和湖南省研究生创新基金（CX201713068）资助。H.H.A. 受沙特阿拉伯萨卡凯阿尔-朱夫大学应用医学科学学院临床实验室科学系资助。X.D.L. 受德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥医学院启动基金以及 Max 和 Minnei Voelcker 基金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.40 µm Falcon 细胞筛Thermo Fisher Scientific08-771-1
1 mL 注射器Henke Sass Wolf5010.200V0
15 mL 离心管TH.Geyer7696702
50 mL 离心管TH.Geyer7696705
70% 乙醇Decon Labs2701
绝对计数微球Life Technologies Europe B.V.C36950
ACK-红细胞裂解缓冲液Lonza10-548E
Amersham Hybond-N+ 膜GE HealthcareRPN203B
蚂蚁San Antonio备注：本地采集
抗体稀释缓冲液（参见表5配方）
抗小鼠 CD11b V450 大鼠单克隆抗体（克隆号 M1/70）BD Bioscience5604561:200 稀释
抗小鼠 CD11c PE-Cy7 单克隆抗体（克隆号 N418）BioLegend1173171:200 稀释
抗小鼠 CD19 Alexa Fluor 647 单克隆抗体（克隆号 1D3）eBioscience15-0193-811:200 稀释
抗小鼠 CD3e APC 单克隆抗体（克隆号 145-2C11）Invitrogen15-0031-811:200 稀释
抗小鼠 CD45 APC-Cy7 单克隆抗体（克隆号：30-F11）BioLegend1031301:200 稀释
抗小鼠可固定活力染料 eFluor 506Invitrogen65-0866-141:200 稀释
抗小鼠 IgG (H+L)，碱性磷酸酶偶联物PromegaS3721
抗小鼠 Ly-6G FITC 单克隆抗体（克隆号 RB6-8C5）Invitrogen11-5931-821:200 稀释
抗小鼠 MHC II APC-eFluor 780 单克隆抗体（克隆号 M5/114.15.2）eBioscience47-5321-801:200 稀释
抗小鼠 Siglec-F PE 单克隆抗体（克隆号 E50-2440）BD Pharmingen5521261:200 稀释
BCIP/NBT 底物Thermo Fisher ScientificPI34042
封闭缓冲液（参见表5配方）
套管，20G × 1.5”CADENCE SCIENCE9920
离心机Thermo Fisher Scientific75004030
CFX384 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统Bio-Rad Laboratories1855485
氯仿Thermo Fisher ScientificC298-500
蟑螂Greer LaboratoriesB26
计数微球Thermo Fisher Scientific01-1234-42
D. farinaeGreer LaboratoriesB81
D. pteronyssinusGreer LaboratoriesB82
Denville 带盖细胞培养板，96 孔细胞培养板Thomas Scientific1156F03
数字干浴器 - 四模块Universal Medical, Inc.BSH1004
蚯蚓San Antonio备注：本地采集
乙二胺四乙酸（EDTA）Sigma-AldrichE6511
FACS 缓冲液（参见表5配方）
Falcon 圆底聚丙烯管，5 mLSTEMCELLTM TECHNOLOGIES38056
流式细胞仪（BD FACS Celesta）BD Biosciences
蝇Greer LaboratoriesB8
镊子Roboz Surgical InstrumentRS-5135
血细胞计数板Hausser Scientific3110
HT-DNASigmaD6898
体内应用单克隆抗体抗小鼠 CD16/CD32（克隆号：2.4G2）Bio X CellBE0307
iScript cDNA 合成试剂盒Bio-Rad Laboratories1708891
异氟烷Abbott Labssc-363629Rx
异丙醇Thermo Fisher ScientificBP2618500
J2 抗双链 RNA 单克隆抗体SCICONS10010200
肺组织消化液（参见表5配方）
Lysing Matrix DMP Biomedicals116913050-CF
Lysing Matrix D，2 mL 管MP BiomedicalsSKU:116913100
小鼠（雌性，8–12 周龄，C57BL/6J）Jackson Laboratory#000664
微量离心管，1.5 mLSigma-Aldrich30120.094
显微镜OlympusCK30
Mini-BeadBeaterHomogenizersSKU:BS:607
Mini-Beadbeater-16Biospec607
蚊子Greer LaboratoriesB55
NanoDrop 2000CThermo Scientific Spectophotometer Medex SupplyTSCND2000C
针头，21 G × 1 1/2 英寸BD Biosciences305167
脱脂奶粉Bio-Rad Laboratories1706404
尼龙线Dynarex3243
磷酸盐缓冲液（PBS）LonzaBE17-516F
RNase IIIThermo Fisher ScientificAM2290
RNase T1Thermo Fisher ScientificAM2283
剪刀Roboz Surgical InstrumentRS-6802
摇床或小型实验室混合器Boekel Scientific201100
SPHERO AccuCount 荧光微球SpherotechACFP-70-51:10 稀释
蜘蛛San Antonio备注：本地采集
TBS（参见表5配方）
TBS-T（参见表5配方）
总细胞培养基（参见表5配方）
TRIzol 试剂Thermo Fisher Scientific15596018
Tween 20Sigma-AldrichP9416
UV Stratalinker 2400 紫外交联仪LabX20447
黄蜂San Antonio备注：本地采集

参考文献

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