环境过敏原（如屋尘螨（HDM））通常含有可激活先天免疫反应以调节过敏性炎症的微生物成分。本文所述方案展示了如何鉴定HDM过敏原中的双链RNA（dsRNA）成分，并表征其在调控嗜酸性粒细胞肺部炎症中的免疫原性活性。
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本文内容
摘要
摘要
环境过敏原（如屋尘螨（HDM））通常以复杂形式存在，其中既包含可引发异常2型免疫应答的过敏性蛋白，也含有可诱导固有免疫应答的微生物成分。这些与过敏原相关的微生物组分在调控2型炎症性疾病（如过敏性哮喘）的发生发展中起着重要作用。然而，其潜在机制在很大程度上仍不明确。本文所述方案旨在确定过敏原相关免疫刺激性RNA的结构特征及其体内活性。具体而言，检测常见过敏原中是否存在可激活肺部干扰素（IFN）应答并抑制 在尘螨（HDM）诱导的过敏性哮喘小鼠模型中，出现严重的肺嗜酸性粒细胞增多。本文包括以下三种检测方法：点印迹（Dot blot）用于显示从包括HDM物种在内的过敏原中分离的总RNA中的双链RNA（dsRNA）结构；逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）用于测定HDM RNA在小鼠肺组织中对干扰素刺激基因（ISGs）表达的激活作用；流式细胞术（FACS）分析用于分别评估HDM RNA对支气管肺泡灌洗液（BAL）和肺组织中嗜酸性粒细胞数量的影响。
引言
根据Strachan最初提出的卫生假说1，儿童早期接触内毒素等环境微生物因子可预防过敏性疾病的发生2,3。在微生物感染（例如病毒感染）过程中，宿主先天免疫系统对异源核酸（RNA/DNA）的识别可触发防御反应4,5,6。然而，屋尘螨（HDM）或其他昆虫过敏原中是否存在具有免疫原性的核酸（如长链双链RNA（dsRNA））及其流行程度目前尚不清楚。本实验方案旨在确定屋尘螨或昆虫及非昆虫过敏原中是否含有能够激活保护性免疫反应的长链dsRNA，以抑制过敏性哮喘小鼠模型中严重的嗜酸性粒细胞肺部炎症的发展。本文提供了三种简单快速的方法，用于评估屋尘螨总RNA中调控过敏原诱导的嗜酸性粒细胞肺部炎症所必需的结构决定因素。
黏膜免疫系统是人体最大的免疫器官，在抵御微生物感染和过敏性损伤方面发挥着宿主防御的第一道防线作用7,8。长链双链RNA（dsRNA）是多种病毒复制过程中的中间产物，已被证实可作为病原体相关分子模式（PAMP），通....
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方案
本研究所述实验程序已获德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥分校机构动物照护与使用委员会批准。
1. 点印迹法检测屋尘螨总RNA中dsRNA结构的存在
- 从过敏原、昆虫及非昆虫过敏原中提取总RNA
- 将采集的活体屋尘螨（HDM）、昆虫或非昆虫动物，或购自商业来源的样本放入50 mL离心管中，迅速用液氮冷冻2. 然后于 -70 °C 用于后续总RNA提取。
注意：本实验选择屋尘螨（HDM）、昆虫和非昆虫动物，是因为它们是已知常见的过敏原来源。此外，这些生物的RNA是否具有免疫刺激功能尚不明确。 - 转移适量（相当于 100 μL 体积或更小的尘螨、昆虫或非昆虫动物，储存在 -70 °C 加入含有珠子（1.4 mm 陶瓷球）的 2 mL 管中，然后将试管置于液氮中冷冻2 容器中放置约10分钟。
- 用于总RNA提取时，加入1 mL基于硫氰酸胍的RNA提取试剂24 向每个试管中加入，然后使用高能细胞破碎仪在最大速度下破碎昆虫及非昆虫小型动物，持续45秒，并在冰上冷却。重复此步骤两次。
- 将步骤1.1.3中的溶液转移至一个新的1.5 mL离心管中，并加入 200 μL 加入氯仿至各管，涡旋混匀。在14,000 ×g条件下离心 x g
- 将采集的活体屋尘螨（HDM）、昆虫或非昆虫动物，或购自商业来源的样本放入50 mL离心管中，迅速用液氮冷冻2. 然后于 -70 °C 用于后续总RNA提取。
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结果
采用dsRNA特异性小鼠单克隆抗体J2（≥ 40 bp）通过点印迹法检测了HDM、昆虫及非昆虫小型动物中长dsRNA结构的存在。使用RNase III将dsRNA消化为12–15 bp的dsRNA片段，这些片段无法被J2检测到（图1）。
屋尘螨总RNA以剂量依赖方式刺激小鼠肺部先天免疫反应的能力 通过RT-qPCR进行分析（图2，上图）。RNase III 处理消除了 HDM 总 RNA 的免疫刺激活性，表明 HDM 总 RNA 中的 dsRNA 结构对于肺部的天然免疫活性至关重要（图2，较低。
通过流式细胞术分析评估了屋尘螨（HDM）总RNA对严重2型肺部炎症发展的抑制作用（图3A）。在本研究中，嗜酸性粒细胞肺部炎症由屋尘螨提取物诱导，这些提取物经RNase III处理或未处理，.......
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讨论
本方案描述了如何评估与过敏原相关的微生物RNA的免疫刺激特性及其在过敏性哮喘小鼠模型中对嗜酸性粒细胞肺部炎症发展的效应。尽管长链双链RNA（dsRNA）已被公认是多种病毒复制过程中的中间产物，可强烈激活哺乳动物细胞的干扰素反应，但其在屋尘螨（HDM）过敏原中的存在直到我们近期的工作15才被揭示。本文所采用的RNA点杂交、逆转录定量PCR（RT-qPCR）和流式细胞术（FACS）分析相结合的方法，可为解析环境过敏原中参与调控过敏原诱导的嗜酸性粒细胞炎症的关键固有免疫组分（如dsRNA种类）提供一个良好范例。
在本实验方案中，采用RNA点杂交法，利用小鼠单克隆抗体J2检测天然变应原中双链RNA（dsRNA）结构的存在。该抗体可特异性结合长度不小于40 bp的dsRNA，且不受序列影响。该方法具有高度可靠性，因为J2抗体仍可识别经RNase T1（特异性切割单链RNA的内切核酸酶）预处理的dsRNA样品，但无法识别经RNase III（特异性切割dsRNA的内切核酸酶）预处理的样品。然而需要指出的是，一种广泛使用的dsRNA合成类似物——多.......
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
感谢 Karla Gorena 女士在流式细胞术方面的技术支持。L.S. 受中国国家留学基金管理委员会和湖南省研究生创新基金（CX201713068）资助。H.H.A. 受沙特阿拉伯萨卡凯阿尔-朱夫大学应用医学科学学院临床实验室科学系资助。X.D.L. 受德克萨斯大学健康科学中心圣安东尼奥医学院启动基金以及 Max 和 Minnei Voelcker 基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.40 µm Falcon 细胞筛 | Thermo Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 1 mL 注射器 | Henke Sass Wolf | 5010.200V0 | |
| 15 mL 离心管 | TH.Geyer | 7696702 | |
| 50 mL 离心管 | TH.Geyer | 7696705 | |
| 70% 乙醇 | Decon Labs | 2701 | |
| 绝对计数微球 | Life Technologies Europe B.V. | C36950 | |
| ACK-红细胞裂解缓冲液 | Lonza | 10-548E | |
| Amersham Hybond-N+ 膜 | GE Healthcare | RPN203B | |
| 蚂蚁 | San Antonio | 备注：本地采集 | |
| 抗体稀释缓冲液 | （参见表5配方） | ||
| 抗小鼠 CD11b V450 大鼠单克隆抗体（克隆号 M1/70） | BD Bioscience | 560456 | 1:200 稀释 |
| 抗小鼠 CD11c PE-Cy7 单克隆抗体（克隆号 N418） | BioLegend | 117317 | 1:200 稀释 |
| 抗小鼠 CD19 Alexa Fluor 647 单克隆抗体（克隆号 1D3） | eBioscience | 15-0193-81 | 1:200 稀释 |
| 抗小鼠 CD3e APC 单克隆抗体（克隆号 145-2C11） | Invitrogen | 15-0031-81 | 1:200 稀释 |
| 抗小鼠 CD45 APC-Cy7 单克隆抗体（克隆号：30-F11） | BioLegend | 103130 | 1:200 稀释 |
| 抗小鼠可固定活力染料 eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866-14 | 1:200 稀释 |
| 抗小鼠 IgG (H+L)，碱性磷酸酶偶联物 | Promega | S3721 | |
| 抗小鼠 Ly-6G FITC 单克隆抗体（克隆号 RB6-8C5） | Invitrogen | 11-5931-82 | 1:200 稀释 |
| 抗小鼠 MHC II APC-eFluor 780 单克隆抗体（克隆号 M5/114.15.2） | eBioscience | 47-5321-80 | 1:200 稀释 |
| 抗小鼠 Siglec-F PE 单克隆抗体（克隆号 E50-2440） | BD Pharmingen | 552126 | 1:200 稀释 |
| BCIP/NBT 底物 | Thermo Fisher Scientific | PI34042 | |
| 封闭缓冲液 | （参见表5配方） | ||
| 套管，20G × 1.5” | CADENCE SCIENCE | 9920 | |
| 离心机 | Thermo Fisher Scientific | 75004030 | |
| CFX384 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统 | Bio-Rad Laboratories | 1855485 | |
| 氯仿 | Thermo Fisher Scientific | C298-500 | |
| 蟑螂 | Greer Laboratories | B26 | |
| 计数微球 | Thermo Fisher Scientific | 01-1234-42 | |
| D. farinae | Greer Laboratories | B81 | |
| D. pteronyssinus | Greer Laboratories | B82 | |
| Denville 带盖细胞培养板，96 孔细胞培养板 | Thomas Scientific | 1156F03 | |
| 数字干浴器 - 四模块 | Universal Medical, Inc. | BSH1004 | |
| 蚯蚓 | San Antonio | 备注：本地采集 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | E6511 | |
| FACS 缓冲液 | （参见表5配方） | ||
| Falcon 圆底聚丙烯管，5 mL | STEMCELLTM TECHNOLOGIES | 38056 | |
| 流式细胞仪（BD FACS Celesta） | BD Biosciences | ||
| 蝇 | Greer Laboratories | B8 | |
| 镊子 | Roboz Surgical Instrument | RS-5135 | |
| 血细胞计数板 | Hausser Scientific | 3110 | |
| HT-DNA | Sigma | D6898 | |
| 体内应用单克隆抗体抗小鼠 CD16/CD32（克隆号：2.4G2） | Bio X Cell | BE0307 | |
| iScript cDNA 合成试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | 1708891 | |
| 异氟烷 | Abbott Labs | sc-363629Rx | |
| 异丙醇 | Thermo Fisher Scientific | BP2618500 | |
| J2 抗双链 RNA 单克隆抗体 | SCICONS | 10010200 | |
| 肺组织消化液 | （参见表5配方） | ||
| Lysing Matrix D | MP Biomedicals | 116913050-CF | |
| Lysing Matrix D，2 mL 管 | MP Biomedicals | SKU:116913100 | |
| 小鼠（雌性，8–12 周龄，C57BL/6J） | Jackson Laboratory | #000664 | |
| 微量离心管，1.5 mL | Sigma-Aldrich | 30120.094 | |
| 显微镜 | Olympus | CK30 | |
| Mini-BeadBeater | Homogenizers | SKU:BS:607 | |
| Mini-Beadbeater-16 | Biospec | 607 | |
| 蚊子 | Greer Laboratories | B55 | |
| NanoDrop 2000C | Thermo Scientific Spectophotometer Medex Supply | TSCND2000C | |
| 针头，21 G × 1 1/2 英寸 | BD Biosciences | 305167 | |
| 脱脂奶粉 | Bio-Rad Laboratories | 1706404 | |
| 尼龙线 | Dynarex | 3243 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Lonza | BE17-516F | |
| RNase III | Thermo Fisher Scientific | AM2290 | |
| RNase T1 | Thermo Fisher Scientific | AM2283 | |
| 剪刀 | Roboz Surgical Instrument | RS-6802 | |
| 摇床或小型实验室混合器 | Boekel Scientific | 201100 | |
| SPHERO AccuCount 荧光微球 | Spherotech | ACFP-70-5 | 1:10 稀释 |
| 蜘蛛 | San Antonio | 备注：本地采集 | |
| TBS | （参见表5配方） | ||
| TBS-T | （参见表5配方） | ||
| 总细胞培养基 | （参见表5配方） | ||
| TRIzol 试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| UV Stratalinker 2400 紫外交联仪 | LabX | 20447 | |
| 黄蜂 | San Antonio | 备注：本地采集 |
参考文献
- Strachan, D. P. Hay fever, hygiene, and household size. BMJ. 299, 1259-1260 (1989).
- Schuijs, M. J., et al. Farm dust and endotoxin protect against allergy through A20 induction in lung epithelial cells. Science. 349, 1106-1110 (2015).
- Stein, M. M.....
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