本文介绍了一种监测与光转换荧光蛋白Dendra2融合的亨廷顿蛋白降解的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质在细胞内不断合成与降解，以维持稳态。能够监测目标蛋白质的降解过程，对于理解其生命周期以及揭示蛋白质稳态网络中的失衡至关重要。本方法展示了如何追踪致病蛋白亨廷顿蛋白（huntingtin）的降解。将两种不同形式的亨廷顿蛋白与Dendra2融合后在细胞中表达 秀丽隐杆线虫 神经系统：一种为生理状态版本，另一种为含有扩展且具有病理性的谷氨酰胺重复序列的版本。Dendra2 是一种可光转换的荧光蛋白；在短暂的紫外光（UV）脉冲照射后，Dendra2 的激发/发射光谱会从绿色转变为红色。类似于脉冲-追踪实验，可以对转换后的红色 Dendra2 的降解进行监测和定量，且不受新合成的绿色 Dendra2 的干扰。利用共聚焦显微镜并基于样本的光学透明性 秀丽隐杆线虫可以监测并量化活体衰老生物体内亨廷顿蛋白-Dendra2的降解过程。神经元中的亨廷顿蛋白-Dendra2在转化后不久即发生部分降解，并随时间推移进一步被清除。在突变型亨廷顿蛋白存在的情况下，调控降解的系统功能缺陷，且随着衰老进一步恶化。同一神经系统内的不同神经元亚型对亨廷顿蛋白-Dendra2的 turnover 能力存在差异。总体而言，监测任何与 Dendra2 融合的目标蛋白，不仅可提供有关其降解过程及参与蛋白质稳态网络的因子的重要信息，还可揭示其定位、转运与运输情况。
引言
生物体的蛋白质组处于持续自我更新的状态。蛋白质会根据细胞的生理需求不断被降解和合成。某些蛋白质会被迅速清除，而另一些则具有较长的寿命。利用基因编码的荧光蛋白（FPs）来监测蛋白质动态是一种更简单、更准确且侵入性更小的方法。荧光蛋白可自发催化形成，并能与任何目标蛋白（POI）融合，其折叠过程无需酶参与，仅需氧气作为辅因子1。最近，新一代荧光蛋白被设计为在特定波长的光脉冲照射下发生颜色转换。这类光激活荧光蛋白（PAFPs）可用于标记并追踪目标蛋白，或其所在的细胞器或细胞，进而分析其定量和/或定性参数2。利用荧光蛋白，可以追踪任意目标蛋白的运动、方向性、移动速率、扩散系数、可移动与不可移动组分的比例、在某一细胞区室中的停留时间，以及其周转速率。对于特定细胞器，可确定其运动与运输过程，或分裂与融合事件。对于特定类型的细胞，可确定其位置、分裂速率、体积和形态。关键的是，使用光激活荧光蛋白可在无需持续成像的情况下进行追踪，且不会受到新合成探针的干扰。已有研究在细胞和完整生物体中成功应用光激活荧光蛋白，在活体条件下解答了多种生物学问题，例如癌症的发生与转移、细胞骨架的组装与解聚，以及RNA-DNA/蛋白质相互作用3。在本研究中，采用光学显微镜结合光激活荧光蛋白，旨在揭示在神经退行性疾病线虫模型 C. elegans 中，易聚集蛋白亨廷顿蛋白（HTT）在体内的周转速率。
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方案
1. 表达神经元亨廷顿蛋白-Dendra2融合蛋白的秀丽隐杆线虫（C. elegans）的构建
- 通过传统的限制性内切酶消化10、Gibson 组装11或任意选择的方法，将编码目的蛋白（POI）的基因克隆至线虫表达载体（例如 pPD95_75，Addgene #1494）中。插入启动子以驱动目的组织或特定发育阶段的表达。将 Dendra2 荧光蛋白在阅读框内与目的蛋白的N端或C端融合。
- 构建表达融合蛋白的转基因 C. elegans（例如通过显微注射）12。
注意：携带转基因的质粒将以染色体外阵列形式存在。融合构建体的整合并非必需，但可根据需要进行13。在本实验方案中，通过显微注射将携带融合构建体亨廷顿蛋白外显子1-Dendra2（HTT-D2）的质粒导入 C. elegans，该构建体由泛神经元启动子 Prgef-1 驱动表达。所用 C. elegans 表达骨架来自 Kreis 等人14，含Q25或Q97的亨廷顿蛋白外显子1序列来自 Juenemann 等人15，Dendra2 荧光蛋白序列来自 Ha....
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结果
通过显微注射获得了两种在线虫中表达亨廷顿蛋白外显子1片段与光转换蛋白 Dendra2 融合的线虫品系，质粒以染色体外阵列形式保留。该融合构建体在整个 C. elegans 神经系统中表达，从发育阶段持续至衰老过程。其中，HTT-D2 包含生理性的 25 个聚谷氨酰胺重复序列（HTTQ25-D2，图 1A），或包含完全外显且具有致病性的 97 个谷氨酰胺重复序列（HTTQ97-D2，图 1B）。最初对融合蛋白进行测试，以确认其在紫外光照射后能否从绿色荧光谱成功转换为红色荧光谱。HTT-D2 在光照区域实现了从绿色到红色的特异性转换，且仅限于被照射区域。根据紫外脉冲的功率和重复次数，以及激光束穿过线虫角质层时在不同 z 层面的穿透能力，仅有部分 HTT-D2 被转换，而非全部。在光转换的神经元中出现红色信号，并与未转换的绿色 HTT-D2 信号共定位（
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讨论
要理解蛋白质的功能，必须了解其合成、定位和降解过程。随着新型、稳定且高亮度的荧光蛋白（FPs）的发展，对目标蛋白（POIs）的可视化和监测已变得更加简便和高效。基因编码表达的光转化荧光蛋白（PAFPs）如Dendra2，特别适用于研究目标蛋白的稳定性。当暴露于紫蓝色光时，Dendra2会在一段保守的三联氨基酸序列内的特定位置发生断裂，其发色团随之发生微小的结构变化，导致荧光光谱从绿色完全转变为红色23。这一光谱转变使得与Dendra2融合的任何目标蛋白均可被检测和追踪。事实上，这类融合构建体最初被用于构建秀丽隐杆线虫（C. elegans）报告品系，以在活体中研究泛素-蛋白酶体系统16。Dendra2还被用于探究特定神经元亚型的易损性及其应对扩展型多聚谷氨酰胺蛋白的能力24，或在运动神经元疾病模型中监测自噬的诱导过程25。
本文介绍了一种非侵入性监测亨廷顿蛋白（hunting.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢德国研究基金会（DFG，项目编号KI-1988/5-1，授予JK；NeuroCure卓越集群向MLP提供的NeuroCure博士奖学金）提供的经费支持。同时感谢柏林莱布尼茨分子药理学研究所（FMP）成像核心设施提供成像设备。此外，我们还要感谢Diogo Feleciano在实验室建立了Dendra2系统并提供了相关操作指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 琼脂-琼脂 Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM 组分 |
| 琼脂糖，通用级 | 生物 & Sell GmbH | BS20.46.500 | 安装载玻片组件 |
| BD Bacto 蛋白胨 | BD生物科学 | 211677 | NGM 组分 |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | 盖玻片 |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | 卡尔·蔡司股份公司 | 目标 | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | 美国国立卫生研究院 | 分析软件 | |
| 盐酸左旋咪唑 | AppliChem GmbH | A4341 | 麻醉剂 |
| LSM710-ConfoCor3 | 卡尔·蔡司股份公司 | 激光扫描共聚焦显微镜 | |
| 体视显微镜安装 | 徕卡相机股份公司 | 显微镜安装 | |
| 神经元-HTTQ25-Dendra2 | 本文 | 秀丽隐杆线虫 菌株 | |
| 神经元-HTTQ97-Dendra2 | 本文 | 秀丽隐杆线虫 菌株 | |
| OP50 大肠杆菌 | 秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC） | OP50 | 线虫食物来源 |
| 氯化钠 | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM 组分 |
| 标准物镜äger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | 载玻片 |
| ZEN2010 B SP1 | 卡尔·蔡司股份公司 | 共聚焦采集软件 |
参考文献
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
- Lukyanov, K. A., Chudakov,....
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重印与许可
