本方案验证了一种可靠、易于操作且可重复的啮齿类动物脑弥漫性轴索损伤（DAI）模型，该模型可诱导广泛的白质损伤，且不伴随颅骨骨折或挫伤。
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本文内容
摘要
摘要
创伤性脑损伤（TBI）是导致死亡和残疾的主要原因。弥散性轴索损伤（DAI）是大量需要住院治疗的TBI患者的主要损伤机制。DAI由震荡、旋转或爆炸伤引起广泛的轴索损伤，导致轴索快速拉伸损伤以及继发性轴索改变，这些改变对功能恢复具有长期影响。历史上，设计不伴局灶性损伤的DAI实验模型一直较为困难。本文中，我们验证了一种简单、可重复且可靠的啮齿类动物DAI模型，该模型可引起广泛的白质损伤，但不导致颅骨骨折或脑挫伤。
引言
创伤性脑损伤（TBI）是美国死亡和残疾的主要原因。TBI约占所有与损伤相关死亡的30%1,2。不同年龄组TBI的主要原因有所不同，包括跌倒、运动中的高速碰撞、故意自残、机动车事故以及袭击1,2,3。
脑弥漫性轴索损伤（DAI）是一种特定类型的创伤性脑损伤（TBI），由脑部在受伤瞬间因头部不受限制的运动所导致的旋转加速度、摇晃或冲击伤引起4,5,6,7,8。DAI表现为广泛的轴索损伤，可导致持久的神经功能障碍，与不良预后、高昂的医疗费用以及33–64%的死亡率相关1,2,4
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方案
实验遵循《赫尔辛基宣言》和《东京宣言》的建议以及欧洲共同体实验动物使用指南进行。本实验已获内盖夫本-古里安大学动物护理委员会批准。
1. 实验前大鼠的准备
注意：选择体重为 300–350 g 的成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠。
- 开展这些实验前，须获得机构动物护理和使用委员会的批准。
- 将大鼠饲养在温度为 22 ± 1 °C 的环境中，光照与黑暗周期各 12 小时。自由供应大鼠饲料和饮水。
- 所有实验应在上午 6:00 至中午 12:00 之间进行。
- 使用持续异氟烷给药系统诱导麻醉。确保蒸发器系统中已加注异氟烷。
- 用 2% 异氟烷对大鼠进行麻醉。
- 通过观察大鼠对外界刺激无运动反应或足底反射，确认其已完全麻醉。
2. 弥散性轴索损伤的诱导
注意：该装置由以下部件组成：1）透明塑料圆筒，2）铁质砝码（1308 g），3）旋转机构，包括一个圆柱形管、两个支撑轴旋转的轴承以及一个头部固定装置（用于耳杆）；4）水平平台，其上固定有两个轴承。
- 将装置放置在沉重且稳定的实验台上。
- 将重物固定在一根绳子上....
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结果
表1展示了实验方案的时间线。在此创伤性脑损伤模型中，死亡率为0%。Mann-Whitney检验显示，干预后48小时，15只创伤性脑损伤大鼠的神经功能缺损显著高于15只假手术大鼠（中位数 = 1 vs. 0），U = 22.5，p < 0.001，r = 0.78（见表2）。数据以计数形式测量，结果以中位数及25–75百分位数范围表示。
图1显示了大鼠脑组织丘脑切片的代表性显微照片。图1显示，与对照组相比，大鼠在创伤后48小时单纯性弥漫性轴索损伤（DAI）可出现轴突和神经元的βAPP免疫反应性（67.46 ± 30 vs. 0 ± 0），U = 0，p < 1.1E-06，r = 0.92。数据以计数形式测量，表示为均值 ± 标准差（SD）。
.......| 分组 |
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讨论
本方案描述了一种弥散性轴索损伤（DAI）的啮齿类动物模型。在DAI中，脑组织受到旋转加速度作用，产生剪切效应，引发轴突和生化改变，进而导致轴突功能进行性丧失。继发性轴突损伤由快速的轴突拉伸损伤引起，其范围和严重程度具有变异性4,5,10。在原发性损伤发生后数小时至数天内，生化改变将导致轴突功能丧失4,5,10。损伤发生后，轴突膜通透性发生变化，导致大量钙离子内流。钙离子的摄入引起线粒体肿胀并破裂，释放caspase酶，进而触发caspase介导的进行性细胞死亡4,5,10,.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者们衷心感谢内盖夫本-古里安大学机械工程系的 Nathan Kleeorin 博士在生物力学测量方面提供的帮助。同时，我们感谢乌克兰第聂伯市奥列斯·冈察尔第聂伯大学生物、生态与医学系生理学教研室的 Olena Severynovska 教授、Maryna Kuscheriava、Maksym Kryvonosov、Daryna Yakumenko 和 Evgenia Goncharyk，感谢她们在讨论中给予的支持和有益贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.01 M 柠檬酸钠 | SIGMA - ALDRICH | ||
| 2.5% 正常马血清 | SIGMA - ALDRICH | H0146 | 液体 |
| 4% 缓冲甲醛溶液 | |||
| 兔源抗淀粉样前体蛋白C端抗体 | SIGMA - ALDRICH | Lot 056M4867V | |
| 生物素化二抗 | Vector | BA-1000-1.5 | 10 mM 磷酸钠，pH 7.8，0.15 M NaCl，0.08% 叠氮化钠，3 mg/ml 牛血清白蛋白 |
| 骨剪 | |||
| DAB 过氧化物酶（HRP）底物试剂盒（含镍），3,3’-二氨基联苯胺 | vector laboratory | ||
| 包埋盒 | |||
| 99.9% 乙醇 | ROMICAL | 易燃液体 | |
| 断头器 | |||
| 苏木精 | SIGMA - ALDRICH | H3136-25G | |
| 过氧化氢溶液 | Millipore | 88597-100ML-F | |
| 异氟烷，USP 100% | Piramal Critical Care, Inc | ||
| Olympus BX 40 显微镜 | Olympus | ||
| 石蜡 | paraplast plus leica biosystem | 组织包埋介质 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | SIGMA - ALDRICH | P5368-10PAK | 一袋内容物溶于一升蒸馏水或去离子水中，可得到 0.01 M 磷酸盐缓冲盐水（NaCl 0.138 M；KCl 0.0027 M）；25 °C 时 pH 为 7.4。 |
| 链霉亲和素 HRP | ABCAM | ab64269 | 链霉亲和素-HRP，用于免疫组织化学（IHC）中与生物素化二抗配合使用。 |
| 二甲苯 |
参考文献
- Faul, M., Wald, M. M., Xu, L., Coronado, V. G. Traumatic brain injury in the United States; emergency department visits, hospitalizations, and deaths, 2002-2006. US Government. , (2010).
- Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visit....
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重印与许可
