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方法文章

基于旋转加速度的大鼠弥漫性轴索脑损伤诱导方法

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DOI：

10.3791/61198

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2020年5月9日

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1Division of Anesthesia and Critical Care, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center and the Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 3Department of Anesthesiology, Yale University School of Medicine, 4Recanati School for Community Health Professions, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 5Department of microbiology and immunology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案验证了一种可靠、易于操作且可重复的啮齿类动物脑弥漫性轴索损伤（DAI）模型，该模型可诱导广泛的白质损伤，且不伴随颅骨骨折或挫伤。

摘要

创伤性脑损伤（TBI）是导致死亡和残疾的主要原因。弥散性轴索损伤（DAI）是大量需要住院治疗的TBI患者的主要损伤机制。DAI由震荡、旋转或爆炸伤引起广泛的轴索损伤，导致轴索快速拉伸损伤以及继发性轴索改变，这些改变对功能恢复具有长期影响。历史上，设计不伴局灶性损伤的DAI实验模型一直较为困难。本文中，我们验证了一种简单、可重复且可靠的啮齿类动物DAI模型，该模型可引起广泛的白质损伤，但不导致颅骨骨折或脑挫伤。

引言

创伤性脑损伤（TBI）是美国死亡和残疾的主要原因。TBI约占所有与损伤相关死亡的30%1,2。不同年龄组TBI的主要原因有所不同，包括跌倒、运动中的高速碰撞、故意自残、机动车事故以及袭击1,2,3。

脑弥漫性轴索损伤（DAI）是一种特定类型的创伤性脑损伤（TBI），由脑部在受伤瞬间因头部不受限制的运动所导致的旋转加速度、摇晃或冲击伤引起4,5,6,7,8。DAI表现为广泛的轴索损伤，可导致持久的神经功能障碍，与不良预后、高昂的医疗费用以及33–64%的死亡率相关1,2,4,5,9,10,11。尽管近年来对DAI发病机制的研究已取得显著进展，但目前在最佳治疗方案方面仍缺乏共识11,12,13,14。

数十年来，已有多种实验模型试图准确复制弥漫性轴索损伤（DAI）的不同特征11,12,15,16。然而，由于DAI在临床表现上与其他局灶性脑损伤具有显著差异，这些模型均存在局限性。先前的模型不仅导致白质区域的轴索损伤，还会引发局灶性脑损伤。临床上，DAI常伴有微出血，这可能是造成白质损伤的主要原因之一。

目前仅有两种动物模型被证实能够复制弥漫性轴索损伤（DAI）的关键临床特征。1982年，Gennarelli 及其同事首次研制出一种侧向头部旋转装置，利用非撞击性的头部旋转加速度在非人灵长类动物模型中诱导出伴有弥漫性轴索损伤的昏迷状态15。该灵长类模型通过可控的单次旋转实现加速与减速，使头部在10-20毫秒内偏转60°。该技术能够模拟意识障碍以及广泛性的轴索损伤，其表现类似于人类大脑中观察到的重度创伤性脑损伤（TBI）效应。然而，灵长类动物模型成本极高4,11,16。基于上述模型的部分原理，1994年设计出一种猪的旋转加速度性脑损伤模型（Ross 等），并获得了类似的结果14。

尽管这两种动物模型产生的典型病理表现不同，但它们极大地推动了对弥漫性轴索损伤（DAI）发病机制的理解。快速头部旋转通常被认为是诱导 DAI 的最佳方法，而啮齿类动物为快速头部旋转研究提供了成本较低的模型11,16。本文验证了一种简单、可重复且可靠的啮齿类 DAI 模型，该模型可导致广泛的白质损伤，且不伴随颅骨骨折或脑挫伤。这一现有模型将有助于更深入地理解 DAI 的病理生理机制，并促进更有效治疗方法的开发。

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方案

实验遵循《赫尔辛基宣言》和《东京宣言》的建议以及欧洲共同体实验动物使用指南进行。本实验已获内盖夫本-古里安大学动物护理委员会批准。

1. 实验前大鼠的准备

注意：选择体重为 300–350 g 的成年雄性 Sprague-Dawley 大鼠。

  1. 开展这些实验前，须获得机构动物护理和使用委员会的批准。
  2. 将大鼠饲养在温度为 22 ± 1 °C 的环境中，光照与黑暗周期各 12 小时。自由供应大鼠饲料和饮水。
  3. 所有实验应在上午 6:00 至中午 12:00 之间进行。
  4. 使用持续异氟烷给药系统诱导麻醉。确保蒸发器系统中已加注异氟烷。
    1. 用 2% 异氟烷对大鼠进行麻醉。
    2. 通过观察大鼠对外界刺激无运动反应或足底反射，确认其已完全麻醉。

2. 弥散性轴索损伤的诱导

注意：该装置由以下部件组成：1）透明塑料圆筒，2）铁质砝码（1308 g），3）旋转机构，包括一个圆柱形管、两个支撑轴旋转的轴承以及一个头部固定装置（用于耳杆）；4）水平平台，其上固定有两个轴承。

  1. 将装置放置在沉重且稳定的实验台上。
  2. 将重物固定在一根绳子上，并将其提升至 120 cm 的高度。
  3. 让重物自由下落，撞击螺栓，从而启动旋转装置。通过侧向头部旋转装置，使啮齿类动物的头部迅速从 0° 转动至 90°。
  4. 在诱导产生弥漫性轴索脑损伤后，将大鼠转移至恢复室。

3. 旋转运动学/生物力学参数的测量。

  1. 按如下方法测量旋转运动学/生物力学参数：
    力矩计算公式，M=2*(K+mgl1)/π，用于解决物理问题。
    静力平衡方程示意图；M=0.225m*(1+14.2mh/(1.664+1.037m))；用于教学。
    静力平衡公式图示，包含力方程 Fo=(2.5/D)m*(1+(14.2mh)/(1.664+1.037m))
    其中 Fo — 施加于动物头部的力（kg）；M — 力矩；K — 动能；m — 下落重物的质量；g — 重力加速度；h — 下落高度（cm）；D — 耳杆之间的距离（cm）。
    注意：要计算施加于动物头部的力（Fo），必须知道下落重物的质量、下落高度以及耳杆之间的距离。其他参数保持不变。

4. 48小时后神经功能缺损评分的评估

注：神经功能缺损的评估与分级采用神经功能缺损评分（Neurological Severity Score），方法如前所述17,18,19。通过评分系统对运动功能和行为的改变进行评估，最高分24分表示严重的神经功能障碍，0分表示神经功能正常。以下行为功能将被评估。

  1. 将大鼠置于直径为50 cm的圆圈中心，评估其无法逃出圆圈的能力。分别进行三次独立实验，持续时间分别为30分钟、60分钟和超过60分钟。
  2. 检测大鼠翻正反射的丧失情况，实验分别持续20分钟、40分钟和超过60分钟，共进行三次。
  3. 进行偏瘫测试，即检测大鼠是否无法抵抗被强迫改变体位的情况。
  4. 通过尾巴提起大鼠，测试其后肢的屈曲反应。
  5. 将大鼠放置于地面，测试其能否直线行走。
  6. 检测三种独立的反射：耳廓反射、角膜反射和惊跳反射。
  7. 根据大鼠寻觅行为的丧失程度和衰竭状态，给予临床评分。
  8. 测试肢体放置反射，分别对左侧和右侧前肢进行测试，然后对左侧和右侧后肢进行测试。
  9. 通过平衡木任务进行功能测试，平衡木宽度应为1.5 cm。测试持续时间分别为20秒、40秒和超过60秒。
  10. 使用三种不同宽度的平衡木对大鼠进行行走测试：分别为8.5 cm、5 cm和2.5 cm宽。

5. 48小时后用于组织学检查的脑组织采集

  1. 损伤后48小时，通过将大鼠吸入的气体混合物更换为20% O2/80% CO2实施安乐死。确保按照机构动物护理与使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）指南规定的预定流速输送CO2。
    1. 根据机构动物护理与使用委员会指南确认动物死亡。
  2. 经心脏灌注0.9%肝素化生理盐水（4 °C），随后灌注500 mL含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。
  3. 灌注完成后，使用断头器进行断头。
  4. 使用骨剪去除颅骨盖部以获取脑组织，避免损伤脑组织。
  5. 立即取出脑组织，并在4%缓冲甲醛溶液中固定48小时，温度为4 °C。
  6. 从嗅球至视皮层按5 mm间隔切取脑组织冠状面，同时将小脑和脑干纵向切开。
  7. 石蜡包埋后，使用切片机对丘脑以外区域进行冠状面和矢状面切片（5 µm）。

6. 免疫化学染色与观察

  1. 用软毛刷将切片轻轻放置在载玻片上，每张载玻片放一片切片。
  2. 进行 βAPP 的免疫化学染色。
    1. 用二甲苯脱蜡（每次 5 分钟，共 3 次），并在室温下用浓度逐渐降低的乙醇进行再水化：100% 乙醇中浸泡 2 次，每次 3 分钟；95% 乙醇中浸泡 2 次，每次 3 分钟；90% 乙醇中 3 分钟；70% 乙醇中 3 分钟；双蒸水（DDW）中 3 分钟。
    2. 用 3% H2O2 处理脱蜡并再水化的脑组织切片，室温下孵育 15 分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。
    3. 将切片在 0.01 M 柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中，98 °C 孵育 5 分钟，进行抗原修复。
    4. 将载玻片置于缓冲液中，室温下静置 20 分钟以冷却。
    5. 用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤切片两次，每次 5 分钟。
    6. 用 2.5% 正常马血清在室温下封闭切片 1 小时，随后在含 1:4000 稀释的兔抗 APP 一抗的封闭血清中，4 °C 过夜孵育。
    7. 一抗孵育后，于室温下用 PBS 洗涤切片。
    8. 在适当稀释的生物素化二抗中孵育切片 15 分钟，然后在室温下用 PBS 洗涤两次，每次 3 分钟。
    9. 在链霉亲和素-过氧化物酶溶液中孵育 15 分钟，再于室温下用 PBS 洗涤两次，每次 3 分钟。
    10. 将切片与含过氧化氢和 3,3-二氨基联苯胺显色剂的缓冲底物溶液（pH 7.5）孵育，避光反应至显色完成。
    11. 将载玻片在室温下用 DDW 孵育 5 分钟，以终止反应。
    12. 用苏木精在室温下对切片复染 3 分钟，然后用流动自来水冲洗 5 分钟。
    13. 在室温下用浓度逐渐升高的乙醇脱水：DDW 中 2 分钟；70% 乙醇中 2 分钟；90% 乙醇中 2 分钟；95% 乙醇中 2 分钟；100% 乙醇中 2 分钟；二甲苯中 3 次，每次 3 分钟。
    14. 干燥后用封片介质封片。
  3. 使用显微镜，配备 20 mm 物镜，在 200 倍放大下观察切片。

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结果

表1展示了实验方案的时间线。在此创伤性脑损伤模型中，死亡率为0%。Mann-Whitney检验显示，干预后48小时，15只创伤性脑损伤大鼠的神经功能缺损显著高于15只假手术大鼠（中位数 = 1 vs. 0），U = 22.5，p < 0.001，r = 0.78（见表2）。数据以计数形式测量，结果以中位数及25–75百分位数范围表示。

图1显示了大鼠脑组织丘脑切片的代表性显微照片。图1显示，与对照组相比，大鼠在创伤后48小时单纯性弥漫性轴索损伤（DAI）可出现轴突和神经元的βAPP免疫反应性（67.46 ± 30 vs. 0 ± 0），U = 0，p < 1.1E-06，r = 0.92。数据以计数形式测量，表示为均值 ± 标准差（SD）。

...
分组

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讨论

本方案描述了一种弥散性轴索损伤（DAI）的啮齿类动物模型。在DAI中，脑组织受到旋转加速度作用，产生剪切效应，引发轴突和生化改变，进而导致轴突功能进行性丧失。继发性轴突损伤由快速的轴突拉伸损伤引起，其范围和严重程度具有变异性4,5,10。在原发性损伤发生后数小时至数天内，生化改变将导致轴突功能丧失4,5,10。损伤发生后，轴突膜通透性发生变化，导致大量钙离子内流。钙离子的摄入引起线粒体肿胀并破裂，释放caspase酶，进而触发caspase介导的进行性细胞死亡4,5,10,...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者们衷心感谢内盖夫本-古里安大学机械工程系的 Nathan Kleeorin 博士在生物力学测量方面提供的帮助。同时，我们感谢乌克兰第聂伯市奥列斯·冈察尔第聂伯大学生物、生态与医学系生理学教研室的 Olena Severynovska 教授、Maryna Kuscheriava、Maksym Kryvonosov、Daryna Yakumenko 和 Evgenia Goncharyk，感谢她们在讨论中给予的支持和有益贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.01 M 柠檬酸钠SIGMA - ALDRICH
2.5% 正常马血清SIGMA - ALDRICHH0146液体
4% 缓冲甲醛溶液
兔源抗淀粉样前体蛋白C端抗体SIGMA - ALDRICHLot 056M4867V
生物素化二抗VectorBA-1000-1.510 mM 磷酸钠，pH 7.8，0.15 M NaCl，0.08% 叠氮化钠，3 mg/ml 牛血清白蛋白
骨剪
DAB 过氧化物酶（HRP）底物试剂盒（含镍），3,3’-二氨基联苯胺vector laboratory
包埋盒
99.9% 乙醇ROMICAL易燃液体
断头器
苏木精SIGMA - ALDRICHH3136-25G
过氧化氢溶液Millipore88597-100ML-F
异氟烷，USP 100%Piramal Critical Care, Inc
Olympus BX 40 显微镜Olympus
石蜡paraplast plus leica biosystem组织包埋介质
磷酸盐缓冲液（PBS）SIGMA - ALDRICHP5368-10PAK一袋内容物溶于一升蒸馏水或去离子水中，可得到 0.01 M 磷酸盐缓冲盐水（NaCl 0.138 M；KCl 0.0027 M）；25 °C 时 pH 为 7.4。
链霉亲和素 HRPABCAMab64269链霉亲和素-HRP，用于免疫组织化学（IHC）中与生物素化二抗配合使用。
二甲苯

参考文献

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