基于旋转加速大鼠漫射性无羟基脑损伤的诱导

创伤性脑损伤 （TBI） 是美国死亡和残疾的主要原因。结核病占所有与伤害^{有关的死亡1，22}的约30%。TBI的主要原因因年龄组而异，包括跌倒、运动期间高速碰撞、故意自残、机动车碰撞和袭击^{11、2、3。2,3}

脑扩散性斧头损伤（DAI）是一种特殊类型的TBI，由旋转加速、晃动或爆炸损伤引起的大脑在受伤后瞬间不受限制的头部运动^{44，5，6，7，8。5,6,7,8}DAI涉及广泛的斧子损伤，导致长期神经损伤，与不良的结果，沉重的医疗费用，和33-64%的死亡率^1,1，2，4，5，9，10，11。^{2,4,5,9,10,11}尽管最近对DAI的发病机制进行了大量研究，但关于最佳治疗方案^{11、12、13、14,12,13,14}仍没有达成共识。

在过去的几十年里，许多实验模型试图准确地复制DAI^{11、12、15、1612,15,16}的不同方面。¹¹然而，与其他焦伤相比，DAI 具有独特的表现方式，这些模型存在局限性。这些以前的模型不仅在白质区域造成斧伤，而且还会导致焦点脑损伤。临床上，DAI伴有微出血，这可能是白质损伤的主要原因。

只有两种动物模型被证明复制DAI的主要临床特征。Gennarelli和他的同事在1982年制造了第一个侧头旋转装置，使用非冲击头旋转加速诱导昏迷与DAI在非人类灵长类动物模型^15。这种灵长类动物模型采用控制的单次旋转来加速和减速，在10-20毫秒内将头部通过60°取代。 这项技术能够模拟意识受损和广泛的斧头损伤，类似于在人类大脑中观察到的严重TBI的影响。然而，灵长类动物模型是非常昂贵的^{44，11，16。11,16}部分基于以前的模型，猪模型旋转加速脑损伤是在1994年（罗斯等人）设计，类似的结果^14。

这两种动物模型虽然产生了不同的典型病理学的介绍，但大大增加了DAI发病机制的概念。快速头部旋转被公认为诱导DAI的最好方法，啮齿动物为快速头部旋转研究^11、16,16提供了一个更便宜的模型。在这里，我们验证了DAI的简单、可复制和可靠的啮齿动物模型，该模型在不造成颅骨骨折或挫伤的情况下造成广泛的白质损伤。目前的模型将使人们更好地了解DAI的病理生理学和更有效的治疗方法的发展。

这些实验是在《赫尔辛基和东京宣言》和欧洲共同体《使用实验动物准则》的建议下进行的。这些实验得到了内盖夫本-古里安大学动物护理委员会的批准。

1. 为实验程序准备大鼠

注:选择成年雄性斯普拉格-达利大鼠体重300-350克。

1. 获得机构动物护理和使用委员会的批准，以进行这些实验。
2. 将大鼠保持在 22 ± 1 °C 的室温下，12 小时照明和 12 小时暗循环。提供鼠肉和水的盐水。
3. 在上午 6:00 到下午 12:00 之间执行所有实验。
4. 使用连续的等体管理系统诱导麻醉。确保蒸发器系统充满等体。
   1. 用2%的二分之一类物麻醉大鼠。
   2. 通过观察对外部刺激缺乏运动或踏板反射，确认大鼠完全麻醉。

2. 弥漫性斧伤的诱导

注:该装置由以下部件组成:1）透明塑料缸，2）铁重（1308克），3）旋转机构由圆柱形管、轴旋转的两个轴承和一个头固定（用于耳针）;4） 固定两个轴承的水平平台。

1. 将设备放在重、稳定的实验室桌子上。
2. 将重量附加到高度为 120 厘米的字符串上。
3. 允许自由下降的重量击中螺栓，激活旋转机构。使用侧头旋转装置，啮齿动物的头部从 0 迅速转向 90°。
4. 诱导扩散性无氧脑损伤后，将大鼠转移到恢复室。

3. 旋转运动学/生物力学参数的测量。

1. 测量旋转运动学/生物力学参数，如下所示:
   
   
   
   施用动物头部的F_o力（千克）;M = 力矩;K = 动能;m = 重量下降的质量;g - 重力加速度;h = 高度（厘米）;D = 耳针（厘米）之间的距离。
   注:要计算应用于动物头部（F_o）的力，必须了解下降重量的质量、重量下降的高度以及耳针之间的距离。其他参数保持不变。

4. 48小时后神经严重性评分评估

注:神经缺陷是使用神经严重性评分进行评估和分级的，如先前描述的17、18、19。^17,18,19运动功能和行为的变化由点系统评估，因此最高得分为24表示严重的神经功能障碍。分数 0 表示完整的神经系统状态。评估以下行为功能。

1. 评估大鼠在位于其中心时无法从圆（直径50厘米）退出。执行三次持续 30 分钟、60 分钟和 60 分钟以上的单独会话。
2. 测试大鼠在持续20分钟、40分钟和60分钟以上的三个疗程中，有右反射的丧失。
3. 执行对异位性测试，大鼠无法抵抗位置的强制变化。
4. 用尾巴抬起老鼠，以测试后肢的弯曲。
5. 把老鼠放在地板上，以测试它直行的能力。
6. 测试三个独立的反射:针刺反射，角膜反射，和肛门反射。
7. 根据寻求行为和垂化损失对具有临床等级的大鼠进行评分。
8. 测试放置肢体反射。在左前肢和右前肢，然后进行左和右后肢测试。
9. 通过光束平衡任务执行功能测试。光束应宽 1.5 厘米。运行 20 s、40 和 60 s 以上的会话的测试。
10. 对三个不同宽度的光束进行光束行走测试:8.5 厘米宽、5 厘米宽和 2.5 厘米宽。

5. 48小时后进行组织学检查的大脑收集

1. 在受伤后48小时，用20%O₂/80% CO₂替换受启发的气体混合物，对大鼠进行安乐死。确保 CO₂按照机构动物护理和使用委员会准则以预定费率交付。
   1. 确保根据机构动物护理和使用委员会准则确认死亡。
2. 在温度 4 °C 下，在大鼠中注入 0.9% 的肝素盐水，随后在 0.1 M 磷酸盐缓冲盐水（pH 7.4）中注入 500 mL 的 4% 甲醛。
3. 灌注后，用断头台进行斩首。
4. 通过用骨切钳去除钙质，以避免损坏脑组织，从而进行大脑采集。
5. 立即取出大脑，在4°C下固定在4%缓冲甲醛溶液中48小时。
6. 将大脑从嗅球面块块块成5毫米的冠状部分，从视觉皮层和一部分分小脑和脑茎。
7. 在石蜡嵌入后，通过微托姆切片切割日冕和下垂部分（5 μm），远离丘状人。

6. 免疫化学染色和检查

1. 用软刷轻轻将切片放在玻璃幻灯片上，每张幻灯片 1 片。
2. 生产βAPP的免疫化学染色。
   1. 用二甲苯脱硫切片（每片3次，每次5分钟），在室温下用逐渐降低乙醇浓度补充水分:3分钟在100%乙醇中两次，3分钟在95%乙醇中两次，3分钟在90%乙醇中，3分钟在70%乙醇中，3分钟在DDW中。
   2. 在室温下用3%H₂O₂治疗去石蜡和再水化脑部分15分钟，以阻止内源性过氧化物酶活性。
   3. 在98°C下用0.01M柠度钠（pH 6.0）孵育部分5分钟，用于抗原检索。
   4. 在室温下将滑片放在缓冲器中 20 分钟以冷却。
   5. 使用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液清洗部分两次，5 分钟。
   6. 在室温下用2.5%正常马血清将部分块1小时，并在原兔抗APP（1:4000）中在4°C下孵育一夜。
   7. 在原抗体中孵育后，在室温下洗涤PBS部分。
   8. 在适当稀释的生物微化二次抗体中孵育部分15分钟，在室温下用PBS洗涤3分钟两次。
   9. 在链球菌中孵育15分钟，在室温下再次在PBS中洗涤3分钟。
   10. 用缓冲基底溶液（pH 7.5）孵育含有过氧化氢和3，3-二氨基苯铬原溶液的部分，并保护光，直到颜色形成。
   11. 在室温下用 DDW 孵育幻灯片 5 分钟，以停止反应。
   12. 在室温下用血氧林对块进行3分钟，用流动的自来水洗涤5分钟。
   13. 在室温下，乙醇浓度逐渐增加，脱水:DDW 2 分钟，70% 乙醇 2 分钟，90% 乙醇 2 分钟，乙醇 2 分钟 95%，100% 乙醇 2 分钟，二甲苯 3 分钟。
   14. 用安装介质干燥并安装。
3. 使用显微镜使用 20 mm 目标透镜在显微镜放大 200 倍下检查切片。

表 1说明了协议时间线。DAI模型的死亡率为0%。Mann-Whitney的一项测试表明，15只DAI大鼠的神经缺陷明显大于干预后48小时15只假鼠（Mdn = 1 vs. 0），U = 22.5，p < 0.001，r = 0.78（见表2）。数据以计数为单位进行测量，并呈现为中位数和 25-75 个百分位数范围。

图1显示了脑组织下部具有代表性的显微图。与对照组（67.46 × 30 vs. 0） 相比，微显图显示，在大鼠48小时后分离DAI后，xxon和神经元βAPP免疫反应，与对照组（67.46 × 30 vs. ± 0），U = 0，p < 1.1E-06，r = 0.92。数据以计数为单位进行测量，并呈现为均值 = SD。

表 1:协议时间表的演示。实验开始时，显示不同时期的大鼠组:DAI = 扩散性斧脑损伤;48时，确定神经严重性评分，并在两组进行βAPP的免疫化学染色。

表2::神经严重性评分。神经缺陷 48 小时后 DAI 为 2 个研究组。Mann-Whitney的一项测试表明，15只DAI大鼠的神经缺陷明显大于干预后48小时15只假鼠（Mdn = 1 vs. 0），U = 22.5，p < 0.001，r = 0.78。数据以计数为单位进行测量，并呈现为中位数和 25-75 个百分位数范围。

图1:免疫化学检查。与对照组（A）相比，脑组织下山面部分的代表性光显微图显示，在大鼠（B）受伤后48小时分离DAI后，xxonal和神经元免疫反应。*APP免疫反应在所有15只DAI大鼠感兴趣的区域被检测到，而在任何假操作的大鼠中则根本不检测。曼-惠特尼测试表明，15只DAI大鼠的βAPP阳性斧子数量明显高于戴大后48小时受伤的动物（67.46× 30 vs. ± 0），U = 0，p < 1.1E-06，r = 0.92。图像在原始放大倍率 = 200。数据以计数为单位进行测量，并呈现为平均值 = SD。请点击此处查看此数字的较大版本。

作者没有什么可透露的。