生成人诱导多能干细胞来源的肠道类器官用于发育与疾病建模研究

摘要

该方案可将人多能干细胞分化为肠道类器官。该方案通过模拟人类正常发育过程，将细胞依次分化为定型内胚层、后肠内胚层，最终形成肠上皮组织。因此，该方案适用于研究肠道发育以及疾病建模应用。

摘要

由hiPSC衍生的肠道类器官是由分化细胞自组装形成的上皮结构，能够形成代表人类肠道上皮的复杂三维结构，并表现出类似隐窝/绒毛的结构。本文描述了通过逐步分化hiPSC为定型内胚层，随后将其后部化形成后肠上皮，再转入三维培养条件以生成hiPSC来源的肠道类器官的方法。三维培养环境由细胞外基质（ECM）（例如Matrigel或其他兼容的ECM）组成，并添加SB202190、A83-01、胃泌素（Gastrin）、Noggin、EGF、R-spondin-1和CHIR99021。类器官每7天传代一次，通过机械破碎后转移至新鲜的细胞外基质中继续扩增。通过qPCR和免疫细胞化学检测证实，hiPSC衍生的肠道类器官包含成熟的肠道上皮细胞类型，如杯状细胞、潘氏细胞和肠上皮吸收细胞。此外，类器官表现出极性特征，其上皮细胞顶端表面表达绒毛蛋白（villin）。

所获得的类器官可用于模拟人类肠道发育以及多种人类肠道疾病，包括炎症性肠病。为模拟肠道炎症，可将类器官暴露于肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、转化生长因子-β（TGF-β）和细菌脂多糖（LPS）等炎症介质中。暴露于促炎性细胞因子的类器官会表现出炎症和纤维化的表型反应。将健康个体来源的类器官与炎症性肠病（IBD）患者来源的人诱导多能干细胞（hiPSCs）衍生的类器官进行配对比较，可能有助于理解驱动IBD的潜在机制。这或可揭示新的治疗靶点和新型生物标志物，从而辅助疾病的早期诊断。

引言

多能干细胞（PSCs）具有自我更新能力以及分化为人体所有细胞类型的潜能，这些特性使其成为研究发育过程、疾病病理学和药物测试的宝贵工具¹。人诱导性多能干细胞（hiPSC）在疾病建模研究中尤为有用，因为它们可来源于患者，能够直接捕获导致疾病表型的基因组^2,3。此类hiPSC可被分化为受遗传缺陷影响的细胞类型，从而对疾病的分子机制进行细致研究⁴。

人类多能干细胞（PSCs）的分化方案旨在通过激活或抑制调控谱系承诺与特化的特定信号通路，引导细胞经历主要的发育阶段。维持hiPSC处于多能状态需要中等水平的Activin A（Act-A）信号；而高剂量Act-A处理3天可使hiPSC定向分化为定型内胚层（DE）^5,6。Act-A与Wnt信号通路共同调控DE的前后轴身份。Act-A信号可诱导前肠（FG）标志物如HHEX、HNF4α和GATA4的表达，同时抑制后肠（HG）基因（如CDX2）的表达。Wnt信号则诱导DE的后部化，使其获得后肠基因表达谱^7,8。一旦确立了后肠细胞身份，分化过程便可从二维（2D）体系转移至三维（3D）体系，并进一步引导形成肠类器官。

肠道类器官通常在基于三维细胞外基质（例如Matrigel或其他兼容的ECM）的培养系统中进行培养⁹，该基质由层粘连蛋白、IV型胶原和内联蛋白组成，并富含表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板源性生长因子（PDGF）和胰岛素样生长因子-1（IGF-1）等生长因子，以支持类器官的存活与增殖。类器官在含有胃泌素、Noggin和CHIR的确定培养基中培养，以在长期培养过程中促进和支持肠干细胞的生长与增殖。

当肠上皮细胞嵌入细胞外基质后，肠隐窝开始形成并逐渐扩展，最终形成球状结构。这些结构进一步成熟为类器官，能够模拟肠道上皮的生理功能。类器官通常可在体外培养超过1年，且其功能特征和基因表达谱无明显丢失。每周需进行传代，通过酶消化将类器官分解为较小片段，这些片段随后可自行重组成完整的类器官。

已建立的类器官系可作为多种肠道相关疾病（包括克罗恩病、溃疡性结肠炎和结直肠癌）的可靠模型^10,11,12,13。相较于动物细胞，该模型更具优势，因其表达与这些疾病相关的人类基因，并且对外部刺激的反应更接近人体组织在体内的实际情况。

方案

注意：以下所有组织培养操作均应在 II 级生物安全柜中进行。

1. 人诱导性多能干细胞（hiPSCs）向后肠内胚层的分化

1. 为了用细胞外基质包被细胞培养瓶，首先计算所需的基质量。以下是以Matrigel包被12孔板为例。计算包被12孔板所需的细胞外基质量。使用以下公式：
   
   注意：使用所选的细胞外基质包被细胞培养皿。若使用Matrigel，建议在接种细胞前24小时以0.035 mg/cm²的浓度进行包被，以促进分化。请查阅产品说明书中细胞外基质的批次浓度，并根据制造商说明提前准备小份 aliquot。
2. 使用P1000移液器将所需量的细胞外基质加入冷DMEM培养基中稀释。
3. 使用5 mL stripette充分混匀。
4. 向每个孔中加入500 μL稀释后的基质溶液。轻轻摇动培养板，使稀释的细胞外基质均匀分布，并在37 °C下孵育至少12小时。
5. 在向培养板接种细胞前，用500 µL PBS洗涤每个孔，以去除多余的细胞外基质。这可以防止在分化过程中细胞脱落。
6. 最后一次洗涤后，将PBS保留在孔中，直到准备接种细胞，以防止细胞外基质干燥。
7. 为了诱导hiPSCs向定型内胚层（DE）或后肠（HG）分化，请取一培养瓶使用选定维持培养基（例如：Essential 8培养基）培养的hiPSCs，吸除培养基。（此处，我们以25,000个细胞/cm²的密度接种。）
   注意：接种密度对成功分化至关重要，需针对每种hiPSC细胞系进行优化。
8. 用5 mL PBS洗涤培养瓶中的细胞，随后吸除PBS。
9. 加入2.5 mL细胞解离溶液（例如TrypLE），室温孵育4分钟。吸除解离溶液，轻轻敲击培养瓶使细胞脱落。
10. 用5 mL预热至37 °C的DMEM培养基洗涤培养瓶，并将所有细胞收集至15 mL离心管中。
11. 取10 µL重悬的细胞悬液，使用血细胞计数板测定细胞密度。
12. 取足够量的细胞悬液，使细胞总数达到1.05 × 10⁶个，置于15 mL离心管中。
13. 以160 × g离心3分钟。在细胞离心过程中，吸除细胞外基质包被的12孔板中的PBS。
14. 离心结束后，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于12 mL含ROCK抑制剂（10 µM）的维持培养基中。
15. 使用P1000移液器，向12孔板的每个孔中加入1 mL细胞悬液。充分重悬细胞，确保各孔间细胞分布均匀。
16. 轻轻摇动培养板，使细胞在孔内均匀分布，但避免剧烈旋转液体，以免细胞聚集在孔中央。
17. 将培养板置于37 °C、5% CO₂的培养箱中。
18. 接种24小时后，更换为仅含维持培养基（例如Essential 8培养基）的培养液（不含ROCK抑制剂）。
19. 开始向DE分化时，根据表1配制内胚层基础培养基。
    注意：分化开始时，细胞汇合度应介于60–80%之间。
20. 在内胚层基础培养基中加入Activin A（100 ng/mL）和Wnt3（50 ng/mL），配制12 mL DE培养基。
21. 将培养基预热至37 °C。
22. 吸除组织培养板或培养瓶中每个孔的培养基。
23. 通过向12孔板的每个孔中加入1 mL DE培养基，启动DE分化。
24. 在开始DE分化后24小时（D1 DE），配制新鲜DE培养基并更换培养液。
25. 在48小时（D2 DE）重复步骤1.24。若此阶段出现大量细胞死亡，应在换液前用500 µL PBS洗涤所有孔。
    注意：为确认内胚层分化成功，可通过流式细胞术检测SOX17的表达。通常在D3 DE时，我们期望超过>80%的细胞为SOX17阳性。若SOX17表达不理想，应优化细胞接种密度及Activin A的浓度。
26. 此时开始HG分化，即在DE分化启动72小时后。在内胚层基础培养基中加入CHIR99021（3 µM）和RA（1 μM），配制12 mL HG培养基（表1）。
    注意：在D3 DE时，细胞应已形成均匀的单层。良好的DE分化是后续分化阶段成功的关键。
27. 吸除DE培养基。
28. 通过向12孔板的每个孔中加入1 mL HG培养基，启动HG分化。
29. 继续分化4天，每天更换培养基。
    注意：为评估DE后部化是否成功，可通过流式细胞术检测CDX2的表达。在HG分化的第4天（D4），我们通常期望超过>80%的细胞为CDX2阳性。若后部化效果不理想，应优化CHIR99021的浓度。
30. 为提取RNA取样时，吸除分化培养基，并用500 µL PBS洗涤孔。
31. 吸除PBS，加入RNA提取试剂盒中适量的细胞裂解缓冲液。
32. 使用P1000移液器刮擦孔底，确保所有细胞完全裂解。
33. 吸出细胞裂解液，转移至洁净离心管中。
34. 立即进行RNA提取，或在-20 °C下冷冻保存，待后续提取RNA。
35. 进行免疫染色时，吸除分化培养基，并用500 µL PBS洗涤孔。
36. 吸除PBS，加入500 µL 4%多聚甲醛（PFA）。
    注意：PFA具有毒性。操作时应穿戴适当的个人防护装备（PPE），并遵循本地实验室的PFA废弃物处理规程。
37. 在4 °C下孵育20分钟。
38. 去除PFA，用500 µL PBS洗涤孔三次。
39. 最后一次PBS洗涤后，将PBS保留在细胞上，直至准备进行免疫染色。

2. 肠类器官的传代

1. 根据表2配制肠道基础培养基。
2. 为从二维培养转为三维细胞培养，使用6孔板由hiPSCs生成定型内胚层（DE）细胞。用5 mL移液管将细胞单层从6孔板中脱离。
3. 将细胞收集至15 mL离心管中，于400 × g离心1分钟，形成细胞沉淀。
4. 将细胞沉淀重悬于含以下生长因子的肠道生长培养基中：SB202190（10 µM）、A83-01（500 nM）、胃泌素（10 nM）、Noggin（100 ng/µL）、EGF（500 ng/µL）、R-Spondin1（100 ng/mL）、CHIR99021（6 µM）、ROCK抑制剂（10 µM）。
5. 根据接种的孔数加入适量的细胞外基质。可通过以下公式计算：
   [1] 细胞外基质/培养基总体积（µL）= 30 µL × 48孔板孔数
   [2] 所需细胞外基质体积（µL）= 公式[1]结果 × 2/3
   [3] 所需培养基体积（µL）= 公式[1]结果 × 1/3
6. 向48孔板每孔中心加入30 µL细胞悬液。
7. 将培养板置于37 °C培养箱中孵育至少5分钟，使细胞外基质凝固。
8. 待细胞外基质形成圆顶状凝固后，向每孔加入300 µL含所有生长因子的肠道生长培养基。
9. 将培养板放回37 °C、5% CO₂的培养箱中。
   注意：若48小时后未观察到类器官生长和/或出现明显细胞死亡，可能需要优化ROCKi和NOGGIN的浓度。
10. 传代类器官时，使用光学显微镜观察细胞，评估类器官的密度和大小，判断是否需要传代。
11. 用冰浴PBS替换细胞培养基。
    注意：类器官培养通常每5–7天需传代一次。当类器官腔内出现明显细胞碎片，且周围肠道生长培养基变黄时，需进行传代。
12. 使用5 mL移液管以刮擦动作将类器官及细胞外基质球体从培养板上机械剥离。
13. 将各孔中的类器官收集至15 mL离心管中。
14. 将类器官悬液于400 × g离心1分钟，使类器官沉淀。小心吸除上清液至接近沉淀顶部，注意避免吸到可见的细胞外基质层。
15. 将沉淀重悬于15 mL冰浴PBS中。
    注意：此步骤用于清洗初次离心未完全去除的残留细胞外基质。
16. 于400 × g离心1分钟。吸除上清液至剩余类器官沉淀。
17. 将沉淀重悬于1 mL冰浴PBS中。使用P200移液器，通过反复吹打数次手动打散完整的类器官。
    注意：使用光学显微镜观察类器官大小，判断是否需要进一步解离。
18. 加入9 mL不含生长因子的培养基。
19. 于400 × g离心1分钟。吸除上清液至类器官沉淀。
20. 使用以下公式计算所需细胞外基质和培养基的体积：
    [1] 细胞外基质/培养基总体积（µL）= 30 µL × 48孔板孔数
    [2] 所需细胞外基质体积（µL）= 公式[1]结果 × 2/3
    [3] 所需培养基体积（µL）= 公式[1]结果 × 1/3
21. 将类器官沉淀重悬于计算体积的含生长因子（包括Noggin和ROCK抑制剂）的肠道培养基中。
22. 向该细胞悬液中加入所需体积的细胞外基质，并充分重悬，确保类器官均匀分布。
23. 向48孔板每孔中心加入30 µL该悬液（建议使用预热至37 °C培养箱中的培养板）。
24. 将培养板放回37 °C培养箱孵育5分钟，直至细胞外基质凝固。
25. 配制含生长因子（+ ROCK抑制剂）的肠道培养基（每48孔板约需17 mL）。
26. 向每孔加入300 µL。
27. 于37 °C、5% CO₂条件下孵育。
28. 传代后，每2–4天吸除肠道类器官的培养基，并更换为新鲜的含生长因子（不含Noggin和ROCK抑制剂）的肠道培养基。
    注意：若48小时后未观察到类器官生长和/或出现明显细胞死亡，可能需要优化ROCKi和NOGGIN的浓度。
    注意：肠道类器官在体内可响应多种炎症介质。TNFα是一种参与多种炎症过程的细胞信号蛋白。
29. 为在肠道类器官中诱导炎症反应，仅用基础培养基配制浓度为40 ng/mL的TNFα溶液。
30. 吸除48孔板中的培养基。
31. 向每孔加入300 µL含40 ng/mL TNFα的预配基础培养基。
32. 将培养板于37 °C孵育48小时，以模拟促炎环境。
    注意：肠道类器官在体内可响应多种炎症介质。TNFα是一种参与多种炎症过程的细胞信号蛋白。
33. 通过真空泵将剩余细胞吸入含5% Trigene的废液收集装置中处理。

结果

分化方案的示意图见图1A。在方案的第1天，hiPSCs应呈致密状态，形成小克隆，总体汇合度约为50-60%。诱导分化24小时后，定型内胚层（DE）细胞开始从干细胞克隆迁移出来，形成单层细胞。此过程在接下来的3天内持续进行，至DE分化的第3天（D3）应形成完整的单层细胞（图1）。在整个分化过程中应监测基因表达情况：多能性标志物（OCT4、NANOG、SOX2）在D0天高表达，并在DE分化过程中迅速下调。在DE分化期间，T基因表达在D1天达到峰值，随后EOMES和MIXL在D2天达到峰值。D2天时，DE相关基因（SOX17、FOXA2、GATA4、CXCR4）应开始表达，并在D3天达到高峰（图2和图3）。至DE D3天，细胞应形成单层，随后可进一步后部化为后肠内胚层。在后部化过程中，三维结构最早可在D2天开始形成。然而，有时这些结构可能直到D4天才出现，甚至完全不出现；这并不一定表明细胞无法继续发育并形成肠类器官（图1）。在后肠（HG）特化过程中，CDX2和HNF4a的表达应被诱导并随时间逐渐增强（图3）。

将二维细胞片转移至细胞外基质后，最初24小时内可观察到二维细胞团块。48小时后，细胞片应开始自发重组，形成更为致密的三维球状结构，初期体积较小（图4A），随后在培养7至10天内逐渐增大并变得更加复杂（图4B & 图4C）。类器官应待其形成明确的类器官/球状体形态，且具有明显上皮结构、腔面朝向类器官/球状体中心时，方可进行传代（图4D）。在此阶段，可利用免疫细胞化学方法检测肠特异性标志物（如villin和CDX2）的表达，以确认类器官的特性（图5）。并非所有二维细胞团块均能发育为类器官，且细胞外基质中可能存在部分死亡细胞。这些死亡的细胞片应予以忽略，直至存活细胞形成较大类器官并具备传代条件为止。

为了模拟炎症状态，可将TNFα加入组织培养基中，作用24-48小时。在与促炎分子共孵育后，类器官采用与其分离和传代时相同的技术收集，并使用适用于QPCR或蛋白质印迹等应用的细胞裂解缓冲液进行裂解。如果需要较短时间的处理，应先将类器官从细胞外基质中分离，然后在1.5 mL离心管中以悬浮状态暴露于TNFα。通常情况下，TNFα处理肠道类器官48小时可诱导促炎标志物（TNFα、IL1B、IL8、IL23）的表达，同时对肠上皮标志物（LGR5、VIL）的表达产生抑制作用（图6）。

内胚层基础培养基		50 mL
RPMI 1640		48.5 mL
B27 补充剂		1 mL
1% NEAA		0.5 mL

表1：内胚层分化用内胚层基础培养基的成分。

肠道基础培养基		50 mL
Advanced DMEM/F12		46.5 mL
HEPES 缓冲液		0.5 mL
GlutaMAX		0.5 mL
烟酰胺		0.5 mL
N2 补充剂		0.5 mL
B27 补充剂		1.0 mL
青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep）		0.5 mL

表2：用于肠道类器官培养的肠道基础培养基成分

图1：hiPSC通过定型内胚层向后肠谱系分化过程中的形态学变化。
(A) 肠道分化方案的示意图。该hiPSC细胞系形成由小细胞组成的松散集落，具有较高的核质比。随着分化进行，细胞发生符合从上皮表型向间充质表型转变的形态变化，并在定型内胚层第3天（DE D3）形成均一的单层结构。在接收到适当信号后，定型内胚层细胞伸长，形成更致密的单层结构，三维球状体最早可在后肠第3天（HD D3）出现，但此现象依赖于所用细胞系，并非转入三维培养的必要条件（B）。比例尺：100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：hiPSCs 向定型内胚层分化可诱导内胚层基因的表达。
hiPSCs 向定型内胚层分化的免疫染色结果显示，转录因子在蛋白水平上的表达发生变化。多能性标志物（NANOG 和 OCT4）在定型内胚层第3天（DE D3）下调（A）。中内胚层标志物 BRA(T) 在方案的第1天（D1）表达（B），而定型内胚层特异性转录因子 SOX17 和 FOXA2 在第2天（D2）出现（B & C）。比例尺：200 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：hiPSC向后肠内胚层（HG）分化过程中通过qPCR检测的基因表达变化。
与多能性相关的基因表达下调（OCT4、NANOG、SOX2），随后出现中内胚层基因的短暂表达（T、EOMES、MIXL1），最终表达定型内胚层基因（SOX17、FOXA2、CXCR4）及后肠基因（CDX2、GATA4、HNF4a）。数据以均值±标准差表示。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：人胃内胚层在三维细胞外基质培养中自组装形成三维肠道类器官。
将人胃内胚层转移至适宜的三维细胞外基质培养环境中，最初形成小的实心细胞团（A）。在培养7-10天后，人胃内胚层细胞团逐渐扩大（B），随后变得不对称，并开始形成更复杂的上皮结构（C），最终发育为具有清晰上皮形态的类器官，其腔面朝向类器官中心（D）。比例尺 = 50 µm 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：已建立的 hiPSC 来源类肠器官表达肠道标志物。
免疫细胞化学染色显示 CDX2 和 Villin 的表达。比例尺 = 100 µm 请点击此处查看本图的放大版本。

图6：TNFα对健康肠道类器官炎症特征及肠细胞基因表达的影响。
健康结肠类器官经TNFα（40 ng/mL）处理48小时后的炎症特征。暴露于TNFα后，促炎标志物（TNFα、IL-8和IL-23）的表达增加，而同时肠上皮标志物（LGR5、VIL）的表达下调。统计分析采用双侧学生t检验。数据以每组的均值±标准差表示。*P < .01；**P < .001；***P < .0001。（n=3）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了一种将人类多能干细胞分化为人类肠道类器官的实验方案。我们展示了其在炎症研究中的应用，但该方法也可应用于多种其他研究背景，并可结合CRISPR/Cas9基因编辑技术¹⁴，在任何遗传背景下进行。经过分化后，类器官遵循天然发育过程的分化序列，即定型内胚层、后肠内胚层，最终形成肠上皮。所得类器官可连续培养和传代超过12个月。

本方案的一个关键环节是在内胚层分化之前未分化干细胞的初始接种密度。如果该密度未得到充分优化，细胞很可能在初始定型内胚层（DE）分化的步骤中死亡（密度过低时）或降低DE分化的效率（密度过高时）。正确的起始密度需根据所使用的细胞系进行优化，合适的密度应使细胞在DE第3天（D3）结束时形成单层。应通过流式细胞术检测DE特化效率，我们通常观察到超过>80%的细胞对SOX17和/或CXCR4呈阳性。当SOX17阳性细胞比例低于60%时，会影响后肠（HG）模式化的效率，导致转移至细胞外基质后形成的类器官数量减少。这最终将导致类器官培养失败。为判断DE向HG模式化是否成功，我们通过流式细胞术评估CDX2阳性细胞的比例，通常预期超过>80%的细胞呈阳性。同样，若CDX2阳性细胞比例低于50%，则在转移至三维细胞外基质培养时生成的肠类器官数量将受到不利影响。

将二维单层细胞转入三维培养后，通常在转移后的24-48小时内会出现微小而致密的球形结构。根据所用细胞系的分化效率，可能会出现大片死亡细胞。我们并不立即传代以清除这些碎片，而是允许类器官充分形成并发育出更复杂、折叠的结构。在首次传代前等待7-10天，可确保存在足够数量的分裂细胞，从而生成大量新的肠类器官。培养物中仍存在的任何碎片，可在传代过程中通过轻柔离心轻松去除：将解离后的类器官与碎片混合物置于离心管中，以适当速度离心，使类器官沉淀成团，而细胞碎片仍悬浮于培养基中。随后可吸除上清液及细胞碎片，仅保留类器官沉淀物。

该方法的局限性在于，由hiPSC分化而来的细胞类型在基因表达和功能特征上通常并未完全成熟。为了确定hiPSC来源的肠组织是否适用于特定应用，应针对多种细胞类型对类器官进行表征，包括肠上皮细胞（VIL）、肠内分泌细胞（neurog3）、杯状细胞（MUC2）、过渡扩增细胞（CD133）、潘氏细胞（FZD5）以及LGR5⁺干细胞（LGR5），以明确类器官的细胞组成。

总体而言，该方案相较于其他多种类器官分化方案的主要优势在于，该培养平台通过使用小分子替代多种重组蛋白和条件培养基的制备，显著降低了成本^15,16。向肠组织样类器官（HG）的分化过程非常简单且快速，可适用于人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞，并获得一致的分化结果。只要严格遵循操作流程，并针对所使用的细胞系进行优化，该方法即可提供一个相对简便的模型平台，且不含污染性的间充质细胞，可用于在多种背景下研究肠上皮，包括炎症反应和宿主-病原体相互作用⁷。通过施加促纤维化刺激，随后利用QPCR、Western印迹和ELISA检测胶原蛋白、层粘连蛋白和纤连蛋白等细胞外基质蛋白的表达水平，可进一步用于肠道纤维化建模研究。在分化前，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对未分化的干细胞系进行修饰，可构建基因敲除或蛋白过表达的类器官，从而用于建立疾病特异性的类器官及更复杂的疾病模型^14,17,18。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
A83-01	Tocris	2939
Activin A	R&D	338-AC
Advanced DMEM/F12 (1X)	Life Technologies	12654-010
B27 补充剂	Gibco	17504044
CHIR99021	Sigma	SML1046-5MG
表皮生长因子	R&D Systems	236-EG-01M
胃泌素	Sigma Aldrich	G9145
GlutaMAX (100X)	Life Technologies	15630-056
生长因子减少型 Matrigel	BD
HEPES 缓冲液 (1M)	Life Technologies	15630-080
N2 补充剂 (100X)	Gibco	17502-048
N-乙酰半胱氨酸	Sigma Aldrich	A7250
烟酰胺	Sigma Aldrich	N0636
Noggin	R&D Systems	6057-NG
非必需氨基酸	Gibco	11140-050
多聚甲醛	VWR	9713.5
青霉素/链霉素	Gibco	15140122
磷酸盐缓冲液	Gibco	14190-094
视黄酸	Sigma	302-79-4
ROCK 抑制剂	Tocris	1254/1
ROCK 抑制剂 Y-27632	Tocris	1254
RPMI	Sigma	R8758-500ml
R-Spondin-1	Peprotech	120-38
SB202190	Tocris	1264
TrypLe Express	Gibco	12604-021
Wnt 3a	R&D	5036-WN