本文描述了一种从单个成年小鼠心脏的心房和心室同时分离心肌细胞和非心肌细胞的方法。该方案可稳定获得高活力的心肌细胞和非心肌细胞，并详细说明了适用于细胞表型鉴定和体外分析的优化细胞特异性培养条件。
本文内容
摘要
摘要
从小鼠中分离和培养心肌细胞对于深入理解心脏生理学和病理生理学至关重要。尽管从新生小鼠心脏中分离心肌细胞相对简单，但研究更倾向于使用成年小鼠心脏来源的心肌细胞。这是因为与新生心肌细胞相比，成年心肌细胞能更准确地再现成年心脏在体内的细胞功能. 然而，从成年小鼠心脏中分离出足够数量且具有高活性的心肌细胞在技术上存在较大难度，这导致了实验进展的瓶颈。此外，已发表的分离方法通常仅针对心房或心室心肌细胞的获取，而难以同时获得心房和心室的非心肌细胞。本文介绍了一种详细的方法，可从单个小鼠心脏中同时分离出心房和心室的心肌细胞以及相应的心房和心室非心肌细胞。同时提供了针对不同类型细胞的最佳培养条件，以提高细胞的存活率和功能活性。该实验方案不仅旨在加快成年小鼠心脏细胞的分离过程，还力求提高心房与心室心脏细胞分离的得率和活性，为相关研究提供更优质的细胞材料。
引言
原代细胞培养是一种重要的资源，可为心肌细胞功能的详细机制研究提供可控的环境。由于新生大鼠心房和心室肌细胞具有更强的耐受性且易于分离，长期以来一直是此类细胞培养的常用来源1。然而，成年小鼠心房和心室肌细胞（AMAMs 和 AMVMs）在体外研究中更具价值，因为它们的分子和功能特征更接近成人心肌细胞。因此，这些细胞在与心脏病理相关的研究中变得尤为重要，因为大多数心脏疾病均发生于成年人2。
此外，转基因小鼠和疾病小鼠模型的可获得性及其应用进一步拓展了分离成年心肌细胞的用途。已有大量先前发表的研究描述了用于短期和长期研究的小鼠心室肌细胞（AMVMs）的分离与培养方案2,3,4,5,6,7,8,9,10,11。相比之下，针对心房肌细胞（AMAMs）分离的方案报道较少。并且，已报道的方法主要针对 freshly isolated 细胞的急性实验进行优化，迄今为止尚无关于 AMAMs 长期培养的方案11,12,13。因此，现有的 AMAM 分离方案并未设计成具备 AMVMs 分离与培养方案所具有的实用性与多功能性。此外，尽管早期关于 AMAMs 和 AMVMs 分离的研究具有重要参考价值，但目前仍缺乏可同时高效分离并培养 AMAMs 与 AMVMs 的优化方案，导致每次心脏组织制备过程中无法充分有效地利用整个心脏组织。
迄今为止，已发表的AMAM和AMVM分离方案均未设计用于同时分离这两种细胞类型，因为大多数关于心房和心室功能的研究都集中在特定心腔。例如，AMAM主要用于研究心房肌细胞的电生理学特性，部分原因在于人们对心房颤动（AF）的关注——这是美国最常见的心律失常。然而，AF并非仅影响心房的疾病，已有研究指出其在轻度至重度左心室功能障碍中具有致病作用14。此外，射血分数保留型心力衰竭（HFpEF）患者的心电图显示，左心房大小是预测心力衰竭易感性的最强指标之一15。
除了在电生理学和收缩功能中发挥作用外，心房还是一种内分泌器官，可分泌调节血压和血容量稳态的心脏因子（例如心房利钠肽 [ANP]）16,17。此外，ANP（可能来源于心房肌细胞）在心室肌细胞中具有显著的保护作用和抗肥厚作用16,17。尽管在多种疾病状态下，心房与心室之间存在神经激素信号交流的有力证据，但这种交流背后的机制尚未得到充分研究。这一点在当前研究热潮中尤为突出：1）关注非肌细胞（特别是心脏成纤维细胞和免疫细胞）在病变心脏中的作用，以及 2）心脏重构如何作为疾病的功能性结果，直接影响心肌细胞的存活和整体心脏功能18,19,20,21,22。因此，对来自心房和心室的心脏细胞进行研究，是全面理解其在心脏病理生理过程中作用的必要途径。
以下方案描述了在生理和病理生理条件下，从单个小鼠心脏中同时分离心房和心室肌细胞及非肌细胞的方法。此外，本方法首次描述了维持心房心肌细胞培养所需的优化条件，而维持心室心肌细胞培养的条件已有文献报道。
方案
本文所报告的涉及小鼠的所有研究均经过圣地亚哥州立大学机构动物护理和使用委员会审查和批准，并符合国家研究委员会发布的《实验动物护理和使用指南》。
1. 分离与培养基质及铺板的准备
- 使用前配制 1 L 心脏灌注培养基：将 Joklik 改良最低必需培养基（MMEM）加入 1 L 无菌水中。用 10 N NaOH 将 pH 调至 7.36，然后经 0.2 µm 滤器过滤，4 °C 保存，可保存最多 2 周。
注：Joklik MMEM 包含 112 mM NaCl、5.4 mM KCl、1 mM MgCl2、9 mM NaH2PO4 和 11.1 mM D-葡萄糖。补充 10 mM HEPES（2.38 g/L）、30 mM 牛磺酸（3.75 g/L）、2 mM D-L-肉碱（0.4 g/L）、2 mM 肌酸和 10 mM 丁二酮单肟（1.01 g/L）。 - 灌注前立即配制消化缓冲液：在 50 mL 心脏灌注培养基中加入 6.25 µL 100 mM CaCl2（见步骤 1.3）和 II 型胶原酶（酶活性 ~310–320 U/mg 干重）。
注：处死动物前称重。消化缓冲液中添加的 II 型胶原酶量由动物体重决定（每 1 g 体重添加 2.25 mg II 型胶原酶）。 - 配制 100 mM CaCl2：将 1.47 g CaCl2 加入 100 mL 分子生物学级水中，搅拌至完全溶解，经 0.2 µm 滤器过滤，室温保存，可保存最多 2 个月。
- 配制心肌细胞终止缓冲液 1：在 90 mL 心脏灌注缓冲液中加入 10 mL 胎牛血清（FBS）和 125 µL 100 mM CaCl2。经 0.2 µm 滤器过滤，4 °C 保存，可保存最多 2 周。
- 配制心肌细胞终止缓冲液 2：在 114 mL 心脏灌注缓冲液中加入 6 mL FBS 和 150 µL 10 mM CaCl2。经 0.2 µm 滤器过滤，4 °C 保存，可保存最多 2 周。
- 灌注前立即配制心房肌细胞铺板培养基：在 95 mL DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）中加入 4 mL FBS、1 mL 100× 青霉素/链霉素-谷氨酰胺、1 mL 100× 胰岛素-转铁蛋白-硒和 1 mL 10 µM 地塞米松。经 0.2 µm 滤器过滤，37 °C 保存至铺板使用。
- 配制心室肌细胞铺板培养基：在 95 mL 最低必需培养基（MEM）中加入 4 mL FBS、1 mL 100× 青霉素/链霉素-谷氨酰胺、10 mL 1 M HEPES 溶液、1 mL 100× 胰岛素-转铁蛋白-硒和 0.1 g 丁二酮单肟。经 0.2 µm 滤器过滤，4 °C 保存，可保存最多 2 周。
- 配制心室肌细胞维持培养基：在 99 mL MEM 中加入 1 mL 100× 胰岛素-转铁蛋白-硒、0.1 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）、10 mL 1 M HEPES 溶液和 1 mL 100× 青霉素/链霉素-谷氨酰胺。经 0.2 µm 滤器过滤，4 °C 保存，可保存最多 2 周。
- 配制层粘连蛋白包被的实验板和载玻片：解冻小鼠层粘连蛋白储备液（1.19 mg/mL）。每 1 mL DMEM 中加入 10 µL 层粘连蛋白储备液，混匀。均匀包被实验板和载玻片，置于 37 °C、5% CO2 培养箱中至少 1 小时，以达到平衡。
注：包被后的实验板和载玻片可在 4 °C 保存最多 2 天。
2. 分离装置
- 每次分离前，用70%乙醇对系统管路和其他组件进行三次彻底清洗，将气泡捕集器注满至顶部（关闭底部活塞，保持顶部活塞打开）。
- 用无菌H2O将整个系统冲洗3次，将气泡捕集器注满至顶部（关闭底部活塞，保持顶部活塞打开）。
- 用心脏灌注缓冲液冲洗整个系统，并将培养基注入气泡捕集器至半满。
- 将循环水浴设置为37 °C。
- 将培养基水浴设置为37 °C。
- 清除蠕动泵管路中的任何气泡。
- 调节蠕动泵的流速至3 mL/min。
3. 手术操作（非存活）
- 将手术器械浸泡在70%乙醇中至少5分钟。
- 将心脏灌注液、心肌细胞终止缓冲液和消化缓冲液置于37 °C水浴中。
- 使用前1小时，将心房心肌细胞铺板培养基、心室心肌细胞铺板培养基和心室心肌细胞维持培养基放入37 °C、5% CO2培养箱中，并松开瓶盖以利于气体平衡。
- 对10周龄的雄性或雌性C57b6/j小鼠腹腔注射（i.p.）0.35 mL肝素，该肝素用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至100 IU/mL。让药物作用约10分钟。
注意：若需对两只小鼠心脏进行此分离操作，可在第一个操作流程的此阶段对第二只小鼠实施麻醉并注射肝素。为减轻动物应激，可使用2%异氟烷/氧气混合气体在密闭诱导室中给予轻度麻醉。 - 使用2%异氟烷/氧气混合气体对动物进行麻醉，并腹腔注射戊巴比妥钠（从10 mg/mL储备液中取0.3 mL），然后用70%乙醇擦拭胸部进行消毒。
- 预先准备好一根打结的5-0丝线，用于将心脏结扎固定在灌注套管上。将套管安装在手术显微镜旁。
- 迅速开胸：先从腹部中线至下颌做一纵行皮肤切口，然后用大剪刀进入腹膜腔，钝性分离并清除膈肌组织；接着沿两侧胸壁外侧用剪刀剪开并移除整个肋骨 cage。
- 剪断心脏与胸壁之间的纤维连接组织（包括胸腺）。然后完全移除肋骨 cage。使用小镊子和剪刀轻轻夹住心尖部位抬起心脏，暴露心脏后表面。
- 在无名动脉下方紧邻升主动脉处进行解剖，完整取出心脏，并立即放入冰冻PBS或冰冷的心脏灌注液中。随后，在冰冻的心脏灌注液中快速清除离体心脏上残留的其他组织，暴露升主动脉。
注意：保留胸腺完整有助于作为解剖定位标志，便于心脏取出。 - 使用显微解剖镊子和剪刀清除主动脉周围多余的组织。用尖头镊子将主动脉套入灌注套管，并用5-0丝线固定。
注意：通常最佳位置是使主动脉在套管上延伸约2 mm。 - 以3 mL/min的流速用心脏灌注液对插管后的心脏进行灌注，持续4分钟。随后将灌注液由心脏灌注液更换为消化缓冲液，继续灌注15.0−17.5分钟（图1A）。
注意：冠状动脉流速通常会增加，表明组织消化有效（即心脏呈现苍白、肿胀状态）。 - 在灌注最后几分钟内收集8 mL流出的消化缓冲液，供后续步骤5.4使用。
- 将心脏从套管上取下，放置于60 mm塑料培养皿中。去除多余组织（如主动脉、静脉），并将心脏浸入2.5 mL消化缓冲液中，准备进行机械分离。
注意：此时应将心房组织解剖分离，一名实验人员应开始进行心房细胞分离操作，另一名实验人员同时进行心室细胞分离操作。
4. 心房细胞的分离与培养
- 将心房从心脏上分离，并放入一个30 mm的塑料培养皿中。加入0.75 mL消化缓冲液进行机械分离。将心室保留在60 mm培养皿中（步骤3.12），并同时进行独立的分离操作（第5节，图1B）。
注意：此时可根据需要进一步分离心房和心室，以获取左侧和右侧的细胞。 - 首先使用尖头手术剪将心房组织剪碎，再用精细镊子进一步撕解组织。避免剧烈搅动组织，切勿快速拉断肌纤维。
- 使用无菌移液管头，持续轻柔混合并解离组织15分钟。每5分钟在10倍物镜明场显微镜下观察心房心肌细胞从组织中的解离情况。随着组织进一步消化，改用孔径更小的无菌移液管头继续轻柔混合和解离组织。
- 将细胞悬液转移至2 mL无菌微量离心管中。用0.75 mL 37 °C的心肌细胞终止缓冲液1冲洗30 mm培养皿，并将冲洗液合并至细胞悬液中（终体积 = 1.5 mL）。
- 在室温下静置10分钟，使心房心肌细胞依靠重力自然沉降。轻柔振荡细胞悬液，促使心肌细胞沉降至锥形管底部，形成可见的沉淀。
- 将细胞悬液在20 × g 条件下离心5分钟。小心吸除含有非心肌细胞的上清液，并使用无菌移液管头将其转移至15 mL聚丙烯锥形管中，注意不要扰动心房心肌细胞沉淀。
- 将非心肌细胞组分在20,000 × g 条件下离心5分钟。吸除上清液后，将非心肌细胞沉淀重悬于10 mL添加了10%胎牛血清（FCS）的DMEM培养基中。
- 使用血细胞计数板或其他方法对非心肌细胞进行计数，然后根据实验需求接种，或通过荧光激活细胞分选进一步分离为特定的单一群体（图1C）。
- 将步骤4.6中获得的心房心肌细胞沉淀重悬于1 mL心房心肌细胞接种培养基中，取10 µL该悬液滴加至血细胞计数板上。统计每视野中杆状心肌细胞的数量。
- 吸除预先包被的实验板/玻片上的层粘连蛋白，将分离的心房心肌细胞重悬于适量添加了25 µM blebbistatin的心房心肌细胞接种培养基中。根据实验需求以适当密度接种（图1C）。
注意：本方案所述长期培养的典型接种密度为每四室（1.7 cm2）玻片每室5 × 105个细胞。
5. 心室细胞的分离与培养
- 开始用精细手术剪刀剪碎心室组织，并用精细镊子进一步分离组织（图1B）。避免通过快速拉扯肌纤维来搅动组织。
- 将细胞悬液转移至15 mL聚丙烯锥形管中。用2.5 mL 37 °C的心肌细胞终止缓冲液1冲洗培养皿，并将冲洗液与细胞悬液合并（终体积 = 5 mL）。
- 使用无菌移液管头继续轻柔混合并解离组织4分钟。取10 µL该细胞悬液滴加到载玻片上，观察杆状心肌细胞的存在，以确保分离质量。
- 将细胞悬液通过100 µm无菌尼龙滤网过滤至50 mL聚丙烯锥形管中。使用步骤3.12中收集的2 mL消化缓冲液冲洗滤网上残留的细胞。
- 让心室心肌细胞在室温下静置沉降6分钟。轻轻振荡过滤后的细胞悬液，使心肌细胞沉降至锥形管底部，形成可见的沉淀。
- 在不扰动心室心肌细胞沉淀的前提下，小心吸除上清液（非心肌细胞），并用无菌移液管头将其转移至50 mL聚丙烯锥形管中。将非心肌细胞部分在20,000 x g离心5分钟。吸除上清液，并将非心肌细胞沉淀重悬于10 mL含10%胎牛血清（FCS）的DMEM培养基中。
- 使用血细胞计数板对非心肌细胞进行计数，并将其重悬于适量含10% FCS的DMEM培养基中。随后根据实验需求接种细胞，或通过荧光激活细胞分选进一步分离为特定的单一群体（图1C）。
- 将分离的心室心肌细胞重悬于2 mL心肌细胞终止缓冲液2中，并取10 µL细胞悬液滴加至血细胞计数板。计数每视野中的杆状心肌细胞数量。
- 采用逐步方式重新引入Ca2+
注意：钙离子重新引入步骤仅适用于心室心肌细胞，不可用于心房心肌细胞，否则将导致细胞死亡。- 向心室心肌细胞悬液中加入50 µL 10 mM CaCl2。充分混匀后在室温下孵育4分钟。
- 向心室心肌细胞悬液中再加入50 µL 10 mM CaCl2。充分混匀后在室温下孵育4分钟。
- 向心室心肌细胞悬液中再加入100 µL 10 mM CaCl2。充分混匀后在室温下孵育4分钟。
- 向心室心肌细胞悬液中加入80 µL 100 mM CaCl2。充分混匀后在室温下孵育4分钟。
- 去除培养板或载玻片上的层粘连蛋白包被，根据实验需要将分离的心室心肌细胞重悬于适量的心室心肌细胞接种培养基中（图1C）。
注意：本方案中所述长期培养的典型接种密度为每四室（1.7 cm2）玻璃载玻片每室5 x 105个细胞。避免接种密度过高（超过75%融合度），因为细胞过度密集会促进细胞聚集，从而抑制细胞贴壁。此外，在首次换液时将损失大量细胞。细胞应在分离后尽快接种，因为细胞外Ca2+会促进过度收缩并导致可存活心肌细胞的丢失。 - 让心室心肌细胞沉降并贴壁至少1小时，随后更换为含25 µM blebbistatin的心室心肌细胞维持培养基。
注意：在含µM级blebbistatin的条件下，心室心肌细胞可培养长达96小时。实验应在不含blebbistatin的心室心肌细胞维持培养基中进行。
结果
一只10周龄的野生型C57b6/j小鼠心脏通常可分离得到75,000−150,000个心房心肌细胞和1.0−1.5 × 106个心室心肌细胞，相当于心房和心室心肌细胞的回收率约为30%−50%18,19。在分离过程中及分离完成后，存活的心肌细胞应呈杆状且不发生收缩。大多数分离得到的心肌细胞应具备此种形态，表明灌注效果良好。杆状形态也可作为细胞存活能力的预测指标。本方案旨在提高从小鼠病变心脏中分离的心肌细胞和非心肌细胞的得率和存活率。此外，该方案已在压力超负荷诱导的心力衰竭模型中进行过测试（数据未显示）。
为验证从心房和心室组织中分离心肌细胞与非心肌细胞的充分性与可重复性，对培养不同天数的细胞进行观察并拍照记录（图2）。此外，采用定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测细胞类型特异性转录本的表达水平。心肌肌钙蛋白T（Tnnt2）是心肌细胞的标志物，在心房和心室心肌细胞培养物中均呈强表达（图3A）。相比之下，心房利钠肽（Nppa，这在生理条件下通常仅在成年心房心肌细胞中表达）以及肌球蛋白轻链2（Myl2，这是一种心室肌细胞特异性基因）在心房和心室心肌细胞培养物中分别被强烈且特异性地表达（图3B，C).
成纤维细胞标志物转录因子21（Tcf21）、血小板源性生长因子受体A（Pdgfra）以及单核细胞来源细胞标志物分化簇68（Cd68）仅在从心房和心室腔室分离的非心肌细胞培养物中表达（图3D−F）。据估计，非心肌细胞约占心脏所有细胞的65%，其中大多数来源于成纤维细胞系或单核细胞来源的谱系18,19,23,24。因此，鉴于在多种心脏病理模型和病因研究中对这两类细胞群体的关注，选择这两类谱系的标志物作为代表性标记。
对心房心肌细胞（AMAMs）和心室心肌细胞（AMVMs）进行T小管标志物二氢吡啶受体（DHPR，一种电压依赖性L型钙通道）以及兰尼碱受体（RYR2）的免疫染色，结果显示在分离过程及长期培养中T小管结构保持完整（图4A,B）。DHPR的丰富表达及其在心房和心室心肌细胞中特有的定位表明T小管的存在。此外，DHPR与RYR2免疫染色的共定位提示二联体结构保持完整。对心房和心室心肌细胞中的肌节蛋白α-肌动蛋白进行免疫染色，呈现出预期的肌节条纹模式。该肌节条纹模式结合杆状形态及TOPRO-3核染色，用于评估分离后心肌细胞的纯度和活性（图4C,D；紫色和红色）。如预期所示，心室心肌细胞较大，平均长度约为~150 mm，而心房心肌细胞平均长度约为~75 mm。此外，通过免疫染色分析发现，心房心肌细胞（而非心室心肌细胞）表现出心房利钠肽（ANP）的强表达，其染色模式具有内质网和分泌颗粒定位的典型特征（图4C,D；绿色）。
心房心肌细胞的一个独特特征是，除了具有收缩细胞的功能外，还被归类为内分泌细胞。心房心肌细胞在基础条件下即可分泌心房利钠肽（ANP），而在分泌刺激物（例如α-肾上腺素受体激动剂苯肾上腺素[PE]）作用下，其分泌量会增加。此外，心房心肌细胞能够分泌ANP，并伴随将部分激素前体（Pro-ANP，15 kD）共分泌性地加工为成熟肽段（ANP，3 kD）16,17。这种分泌能力可通过免疫印迹法检测经急性PE处理后分离的心房心肌细胞培养上清中的ANP水平进行定量分析（图4E）。研究发现，心房心肌细胞的这种分泌和加工能力对培养条件敏感。因此，必须在心房心肌细胞接种培养基中添加地塞米松、胰岛素、转铁蛋白和硒元素。
图1：逆行心脏灌注、消化及细胞分离的示意图。图中展示了从单个小鼠心脏同时分离心房和心室细胞的主要步骤。（A）通过升主动脉迅速插管，对单个小鼠心脏进行逆行灌注。（B）将心脏分为心房和心室组织，以进行进一步的消化和物理分离。（C）在充分消化后，细胞通过重力过滤分离为总共四个细胞组分，并进行培养以用于后续实验。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：分离培养的心房和心室心肌细胞及非心肌细胞的形态学分析。（A）分离的成年小鼠心房心肌细胞（AMAMs），（B）成年小鼠心房非心肌细胞（AMANMs），（C）成年小鼠心室心肌细胞（AMVMs），或（D）成年小鼠心室非心肌细胞（AMVNMs）以每孔 5 × 105 个细胞的密度接种于四孔（1.7 cm2）玻璃培养片上，并分别使用相应的接种培养基。在培养的指定天数，使用倒置荧光显微镜配备 10 倍物镜获取相差图像。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：分离细胞培养物的代表性 qRT-PCR 分析。 从新分离的心肌细胞和非心肌细胞中提取 RNA，并通过 qRT-PCR4 检测细胞特异性基因标志物的 mRNA 水平。(A) Tnnt2，心肌肌钙蛋白 T（心肌细胞标志物）；(B) Nppa，心房利钠肽（心房心肌细胞标志物）；(C) Myl2，肌球蛋白轻链 2（心室心肌细胞标志物）；(D) Tcf21，转录因子 21（成纤维细胞标志物）；(E) Pdgfra，血小板源性生长因子受体 A（成纤维细胞标志物）；(F) Cd68，分化簇 68（单核细胞来源细胞标志物）。数据表示为均值 ± 标准误（*p ≤ 0.05，与所有其他值相比具有显著差异，经 ANOVA 分析后采用 Newman-Keul 法进行事后检验）。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：分离的心房和心室心肌细胞的代表性形态学与功能分析。（A）将AMAMs或（B）AMVMs以每孔5 × 105个细胞的密度接种于四孔（1.7 cm2）玻璃培养皿中，在相应的接种培养基中孵育1小时以促进贴壁。随后，更换为心房心肌细胞接种培养基，或更换为添加了blebbistatin的心室心肌细胞维持培养基，继续培养16小时。之后固定细胞，并对RYR2（紫色）、DHPR（绿色）以及核染料TOPRO-3（红色）进行免疫荧光染色。（C）AMAMs或（D）AMVMs经分离接种后，对α-肌动蛋白（α-actinin，紫色）、心房利钠肽（ANP，绿色）和TOPRO-3（红色）进行免疫荧光染色。每种细胞类型展示两张代表性图像。（E）将AMAMs以每孔5 × 105个细胞的密度接种于12孔板中，在心房心肌细胞接种培养基中培养16小时。随后，AMAMs用溶剂对照或ANP分泌刺激剂（去氧肾上腺素，phenylephrine，50 mM）处理0.5小时，收集培养基并进行ANP的免疫印迹分析。在进行免疫印迹分析前，培养基样品于500 × g 离心5分钟，以去除细胞碎片，确保所检测到的ANP来源于AMAMs的主动分泌。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
采用本方案分离的细胞质量，根据培养中细胞的得率和整体健康状况来评估，取决于多种可控制的因素。从实验小鼠本身开始，已有文献表明，施加于动物的应激可对培养中的细胞得率和存活率产生负面影响，这可能归因于体内皮质醇和儿茶酚胺水平升高，以及心肌组织处于过度收缩状态2,5,7。因此，在处死动物前应采取措施避免引起其惊吓。这些措施包括覆盖动物笼具，并在处死前尽量减少其在屏障环境外的停留时间。常用于安乐死的肝素和多种巴比妥类药物可能影响信号通路，因此应根据具体情况选择最适宜的安乐死方法。动物的年龄对分离细胞的质量和存活率具有显著影响，这很可能与衰老过程中伴随的间质纤维化进行性累积有关，后者可能影响组织的消化效果25。在未展示的数据中，尽管上述方法可用于长达78周龄的小鼠，但这些较老年动物所获得的细胞质量较低。
在所述的分离过程以及其他采用朗根多夫（Langendorff）装置进行逆行灌注的实验方案中，最关键的步骤是心脏的插管和初始灌注。为了获得最佳效果，从心脏摘除到升主动脉插管并开始灌注的时间不应超过90秒。除了时间因素外，另外两个重要因素是插管的深度以及灌注装置可能引入空气栓塞的风险。因此，应将插管推进至升主动脉内，但不得进入主动脉根部而阻塞主动脉瓣，否则将影响冠状血管的灌注。
在消化过程中，需定期检测心脏的硬度，以避免心肌细胞长时间暴露于消化酶胶原酶中，从而减少心肌细胞对钙离子的耐受性下降。上述针对分离的心室肌细胞培养物中钙离子重新引入的方案，旨在通过抑制钙库操纵性钙通道介导的异常钙内流，降低心肌细胞死亡。需要注意的是，分离的心房肌细胞培养物不应进行逐步钙离子重新引入，因为这会促进细胞在短期和长期培养过程中的死亡12。为进一步确保细胞活性，本实验所用的灌注和消化缓冲液中均含有心肌收缩抑制剂丁二酮单肟（BDM），以防止分离的心肌细胞发生过度收缩以及钙反常现象，这两种情况均会影响心肌细胞的存活率26。然而，应注意将BDM替换为blebbistatin，后者是维持分离心肌细胞培养时首选的抗收缩试剂。在未展示的数据中，blebbistatin在分离心肌细胞的长期培养中可提供更高的细胞存活率。
分离后应立即考虑长期培养心肌细胞（尤其是心肌细胞）所带来的影响。本文所述的心脏非心肌细胞分离与培养方案基于常用方法，利用了不同类型心脏细胞的密度差异和黏附特性。非心肌细胞的优势在于其在培养中具有较高的扩增潜能；因此，与心肌细胞不同，它们适合传代培养以实现持续增殖。然而，已知培养条件（包括在培养基中添加FBS）可能会影响心肌细胞的功能性27。本文所述的培养基旨在优化细胞存活率，并尽量减少功能紊乱，特别是针对分离的心房肌细胞。尽管在未添加blebbistatin的培养条件下，分离的心肌细胞未表现出明显的收缩功能受损，但针对电生理学、收缩性及其他基于单细胞体内分子信号通路的研究，应在分离后尽快进行，此时肌节结构和分子特征仍能模拟完整心脏的状态。
心房肌细胞的一个显著特征是除了具有收缩功能外，还能兼职作为具有强大分泌能力的内分泌细胞。在生理条件下，心房肌细胞会产生大量心房利钠肽（ANP），这些肽类物质储存于内质网以及大型致密核心分泌颗粒中，一旦接收到刺激信号即可进行调节性胞吐16,17。尽管许多分离的心房肌细胞研究主要关注其独特的电生理特性，但本研究是首个设计出适用于此类细胞的培养基的研究。该培养基可维持心房肌细胞的长期存活，并促进其内分泌功能和收缩功能的保持。这种新型的细胞培养方法，以及从单个小鼠心脏同时分离心房和心室各类型细胞的技术，将对心房和心室肌细胞的生理及病理生理特性研究具有重要应用价值和高效性。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
E.A.B. 获美国国立卫生研究院（1F31HL140850）、ARCS基金会圣迭戈分会资助，并为圣地亚哥州立大学心脏研究所Rees-Stealy研究基金会Phillips Gausewitz博士学者。E.A.B. 和 A.S.B. 获得稻盛基金会资助。CCG 获美国国立卫生研究院（NIH）R01 HL135893、R01 HL141463 和 HL149931 项目资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (-)-Blebbistatin | Sigma-Aldrich | B0560 | |
| 1 升水套式储液槽 | Radnoti | 120142-1 | |
| 2,3-丁二酮单肟 | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5-0 丝线缝合线 | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| 腺苷 | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| 气泡捕集顺应性腔室 | Radnoti | 130149 | |
| 无水氯化钙 | Fisher Scientific | C614-500 | |
| 盐酸肉碱 | Sigma-Aldrich | C9500 | |
| II 型胶原酶 | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | |
| 肌酸 | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| DMEM/F12 (1:1; 1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Dumont #7 精细镊子 | Fine Science Tools | 11274-20 | |
| 落射荧光显微镜 | Olympus X70 | IX70 | |
| 胎牛血清（热灭活） | Omega Scientific | FB-12 | 批号# 206018 |
| 精细剪刀 - 锐利型 | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Graefe 镊子 | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| 头戴式放大镜 | Fine Science Tools | 28030-04 | |
| 血细胞计数板（亮线型） | Hausser Scientific | 1475 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| 次黄嘌呤核苷 | Sigma-Aldrich | I4125 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒-X | Gibco | 51500-056 | |
| Isotemp 105 水浴锅 | Fisher Scientific | NC0858659 | |
| Isotemp 3006 | Fisher Scientific | 13-874-182 | |
| Joklik 改良最低必需培养基 | Sigma-Aldrich | M-0518 | |
| 层粘连蛋白（天然，小鼠来源） | Gibco | 1795024 | 批号# 1735572 |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Masterflex C/L 单通道可调速紧凑型泵 | Cole-Palmer | EW-77122-24 | |
| 最低必需培养基（MEM 1X） | Gibco | 12350-039 | |
| 分子生物学级水 | Corning | 46-000-CM | |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺（100X） | Gibco | 10378-016 | |
| 弹簧剪刀 - 6 mm 刃口 | Fine Science Tools | 15020-15 | |
| 牛磺酸 | Sigma-Aldrich | T-8691 |
参考文献
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