我们提出了一种利用高分辨率显微计算机断层扫描成像技术来检测航天飞行是否对眼部结构造成损伤的实验方案。该方案展示了基于显微CT的测量方法 离体 啮齿类动物眼部结构。我们展示了利用一种非破坏性的三维技术评估航天飞行后眼部形态学变化的能力，以评价眼部损伤。
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摘要
摘要
研究表明，宇航员在国际空间站（ISS）任务期间及之后，长期暴露于太空飞行环境中会导致眼部形态和功能发生改变。然而，这些由太空飞行引起的眼部变化的潜在机制目前尚不清楚。本研究的目的是通过微计算机断层扫描（micro-CT）成像技术评估小鼠视网膜、视网膜色素上皮（RPE）、脉络膜和巩膜层的厚度，从而确定太空飞行环境对眼部结构的影响。10周龄的雄性C57BL/6小鼠被送往国际空间站执行为期35天的任务，之后活着返回地球进行组织分析。作为对照，地面对照组（GC）小鼠在地球上被安置于相同的环境条件和硬件设备中。在着陆后38(±4)小时内采集眼部组织样本用于micro-CT分析。采用micro-CT成像采集方法，记录固定眼球的视网膜、RPE、脉络膜和巩膜层横截面的轴向和矢状面图像。micro-CT分析显示，与地面对照组相比，太空飞行样本中视网膜、RPE和脉络膜层的横截面积及厚度均发生变化，太空飞行组的横截面和各层厚度显著薄于对照组。本研究结果表明，micro-CT评估是一种灵敏且可靠的方法，可用于表征眼部结构的变化。这些发现有望加深对环境应激因素影响整体眼部结构的理解。
引言
在太空飞行的微重力环境中，体液转移引起的颅内压（ICP）升高可能促进了与太空飞行相关的神经-眼综合征（SANS）的发生1,2,3,4,5。事实上，在国际空间站（ISS）任务期间及之后，超过40%的宇航员出现了SANS6，包括NASA双胞胎研究中的太空飞行受试者7。目前SANS的病理生理学表现包括多种生理变化，如视盘水肿、眼球后极部变平、脉络膜和视网膜皱褶、远视性屈光不正偏移，以及神经纤维层梗死（即棉絮斑），这些均已得到充分记录5,8。然而，这些变化的潜在机制以及导致损伤发生的相关因素仍不明确。为了更深入地理解SANS，已有多种动物模型可用于表征与太空飞行相关的视网膜结构和功能变化。
在之前针对同一批动物的研究中，我们报道了35天太空飞行对小鼠视网膜的影响。结果表明，太空飞行会导致视网膜及视网膜血管系统发生显著损伤，且一些与细胞死亡、炎症和代谢应激相关的蛋白质/通路在太空飞行后发生了显著改变9。
目前已有多种非侵入性成像技术用于监测疾病的发生和发展，以及机体对各种环境应激因素的生理反应，这些技术也广泛应用于小型啮齿类动物模型。其中一种技术是微型计算机断层扫描（micro-CT），可用于评估解剖结构和病理过程，并已成功应用于小至小鼠的生物体10。
Micro-CT 可实现微米级分辨率，通过添加适当的对比剂，可对软组织进行高对比度的三维体积分析10,11,12,13,14。与传统方法（如大体解剖、光学显微镜和组织学检查）相比，Micro-CT 技术具有优势，因其可最大限度减少对样本几何形态的物理损伤，并保持结构间的空间关系不变。此外，可从 Micro-CT 图像重建结构的三维（3D）模型12,14。迄今为止，尽管已有证据表明暴露于太空环境会导致视力受损，但在动物模型中仍缺乏足够的数据以深入理解与太空飞行相关的视网膜结构和功能变化。在本研究中，小鼠在中国台湾空间站（ISS）上执行为期35天的飞行任务，旨在通过 Micro-CT 定量分析视网膜、视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜层的微结构，评估太空飞行环境对眼部组织结构的影响。
方案
本研究遵循美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理和使用指南》中提出的相关建议，并获得了洛马林达大学（LLU）机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及美国国家航空航天局（NASA）的批准。有关此次飞行实验的更详细信息可参见其他文献9,15。
1. 飞行与控制条件
注意：2017年8月，SpaceX在肯尼迪航天中心（KSC）发射了第12次商业补给服务（CRS-12）载荷，执行为期35天的任务，其中包括搭载20只10周龄的雄性C57BL/6小鼠（n = 20），用于美国国家航空航天局（NASA）的第九次啮齿类动物研究实验（RR-9）。
- 在通过SpaceX的龙飞船返回地球之前，让小鼠在国际空间站（ISS）上的NASA啮齿类动物栖息地（RH）中生活35天，环境温度保持在26–28 °C，并在整个飞行期间维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。
- 将地面对照（GC）小鼠安置在与飞行期间相同的饲养设备中，并根据遥测数据尽可能匹配温度和二氧化碳（CO2）浓度等环境参数。
- 为地面对照小鼠提供与在轨小鼠相同的NASA食物棒饮食。对空间飞行组和地面对照组小鼠均自由供应饮水和食物。
2. 小鼠飞行后的评估
- 在返回地球溅落后的28小时内，将小鼠运送至洛马林达大学（Loma Linda University, LLU）。到达后，将小鼠从动物饲养装置中取出，并评估其存活状况与健康情况。
注意：经观察，检查人员报告称所有小鼠均成功存活了为期35天的太空任务，且身体状况良好，即未见明显缺陷或异常。
3. 航天飞行后小鼠眼睛的解剖与保存
- 在溅落后的38(±4)小时内（每组n=20），用100% CO2对小鼠实施安乐死，并摘取其眼球。
- 分离右侧眼球的视网膜，分别放入无菌冻存管中，液氮速冻后于−80 °C保存备用。
- 将左侧完整眼球用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液（PBS）固定24小时，随后用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，用于微计算机断层扫描（micro-CT）检测。
4. 微型计算机断层扫描样品制备
- 固定后，用乙醇对小鼠眼球进行脱水。为防止固定样本进一步或突然收缩，需使用梯度乙醇溶液：先用50%乙醇处理1小时，随后依次提高乙醇浓度，每种浓度各处理1小时：70%、80%、90%、96%和100%。
注意：小鼠眼球操作必须在通风橱内进行。 - 磷钼酸（PMA）染色
警告：由于PMA具有腐蚀性，且为致癌物并对器官有毒性，必须采取适当的个人防护措施，包括在通风橱中操作。- 配制染色液：将10 mg磷钼酸溶于100 mL无水乙醇中。
- 用磷钼酸染色液（10 wt. %磷钼酸-PMA溶于无水乙醇）对小鼠眼球染色6天。
- 扫描前，先用无水乙醇清洗眼球样本，然后将每个眼球置于单独的2 mL塑料容器中，容器内装满100%无水乙醇。扫描时加入棉垫以固定样本。
5. 微型计算机断层扫描与分析
注意：使用 SkyScan 1272 扫描仪（一种台式 X 射线显微计算机断层扫描系统）对小鼠眼睛的视网膜损伤进行评估
- 将软组织样本安装到合适的样品 holder 上。为防止 X 射线 CT 测量过程中发生任何移动，确保样本在 holder 上安装牢固（图 1）。
- 在对每个样本进行精确对准后，分别通过 X 射线扫描样本。
- 打开软件后，将样本居中于视野中。在该方案中，不使用滤光片，并将矩阵设置为 4 µm 像素尺寸。使用微调定位功能，使样本中心保持在视野中央。
- 随后，检查参数以最大化对比剂效果。进行校准时，移除样本并确认平场校正大于 80%。
- 校准完成后，将样本重新插入扫描腔室。扫描时，采用 0.400 的旋转步长、4 帧平均、30 的随机移动，并将样本旋转 180°。
- 使用定位夹具以进行重复测量。由于采用了如前所述的相位对比增强技术，可检测到小至 4 µm 的结构细节，这些信号来自密封微焦点 X 射线管（钨阳极）在 50 keV 和 80 mA 条件下产生的 X 射线，积分时间为 90 分钟。
注：本节所述采集参数旨在生成具有最高图像质量的概览 CT 扫描。 - 扫描完成后，使用软件（例如 NRecon）对数据进行重建。
- 调整直方图，并对所有样本使用相同的范围（0 – 0.24）。重建的兴趣区域为圆形，未使用任何比例尺或标签。
- 为减少扫描过程中的伪影，使用 20 的束硬化校正、1 的平滑校正、6 的环状伪影抑制，并不对错位补偿进行修改。重建后确认样本位于兴趣区域内。
- 使用与视神经和晶状体平行的平面重新定位图像。
- 扫描完成后，使用软件（例如 DataViewer）在三个正交视图中可视化重建图像。
注：如有必要，可通过该软件使用与视神经和晶状体平行的平面重新定位图像，以实现标准化分析。 - 描述性分析
- 使用软件中的测量工具（例如 CTAn）测量结构。以视神经为界划定分析的兴趣区域。根据计算，该方案采用中间切片进行测量。该评估通过描述性分析完成（图 2 和 图 3）。
- 在矢状面（图 2）和轴向视图（图 3）中测量视网膜、视网膜色素上皮层（RPE）、脉络膜和巩膜层。对每种结构进行三次测量，以计算平均值。
结果
根据上述方案进行微计算机断层扫描（micro-CT）后，记录视网膜、视网膜色素上皮（RPE）、脉络膜和巩膜各层的平均厚度（图1）。该技术可从三个不同视角对眼球进行多平面重建。在分析过程中，观察者可逐层浏览整个样本，以确保分析位置标准化于样本正中央。
显微CT分析显示了眼球在矢状面和轴向视图中的横截面区域（图2 和 图3），并在这些图像上进行了线性测量。与地面对照组（GC组）相比，飞行组的视网膜色素上皮层（RPE）和脉络膜层厚度显著降低或呈降低趋势（图3）。
图1：软组织的显微CT操作流程。（A）软组织样本（小鼠眼球）。（B）将样本固定于磷酸盐缓冲液（PBS）中含4%甲醛的溶液中。固定后，用乙醇对小鼠眼球进行脱水处理。为防止固定样本进一步发生急剧收缩，采用梯度乙醇溶液处理，依次为50%乙醇处理1小时，随后分别用70%、80%、90%、96%和100%乙醇溶液处理，每种浓度各1小时。（C）将小鼠眼球在磷钼酸（PMA）中染色6天，随后用无水乙醇洗涤，并置于盛有无水乙醇的独立2 mL塑料容器中。（D）采用台式X射线显微CT系统扫描仪评估小鼠眼球中的视网膜损伤。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：地面对照小鼠的眼球矢状切面图。 图像右侧的眼球各层结构从上至下依次标注为：视网膜（0.077 mm）、视网膜色素上皮层（RPE，0.038 mm）、脉络膜（0.041 mm）、巩膜（0.059 mm）。该图引自 Overbey 等人15。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：地面对照小鼠的轴向视图。 图像右侧的眼部各层从上至下依次标注为：视网膜（0.144 mm）、视网膜色素上皮层（RPE，0.051 mm）、脉络膜（0.041 mm）和巩膜（0.073 mm）。该图引自 Overbey 等人15。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：通过显微CT测量的太空飞行组与对照组中视网膜层、视网膜色素上皮（RPE）层及脉络膜层的平均厚度。每组五只视网膜的数据取平均值。数值以均值±标准误（SEM）表示，误差线代表均值的SEM。与地面对照组（GC）相比，太空飞行组（FLT）横截面厚度显著降低，以‘*’表示（p < 0.05）。本图引自Overbey等人的研究15。请点击此处查看此图的放大版本。
讨论
本研究结果表明，与地面对照组（GC组）相比，利用微计算机断层扫描（micro-CT）技术可观察到航天小鼠眼球发生结构变化，尤其是视网膜、视网膜色素上皮（RPE）以及脉络膜层的厚度减小。micro-CT提供了一种高效且非破坏性的方法，用于表征这些变化，无需对样本进行物理操作。使用PMA染色增强了micro-CT图像质量，成功在重建后获得清晰的三维断层图像，从而避免了对样本结构进行物理改变的需要。这些图像的另一优势在于能够以数字化方式完整显示感兴趣区域，从而提高了研究结果的可及性与可重复性。通过本研究生成的micro-CT图像，目标样本中视网膜、RPE、脉络膜及巩膜层等多个结构得以清晰区分，便于测定各层的厚度。
该实验方案中的一个关键步骤是对样本的操作，因为样本的尺寸和质地较为特殊。在制备过程中，必须小心处理标本，避免对其施加压力。显微CT存在一些局限性：分辨率以及缺乏参数的标准化数值。在扫描过程中，不同的显微CT设备可能采用不同的图像处理算法；然而，可通过灰度校准来克服潜在问题。扫描完成后，图像重建应基于组织类型及后续将进行的分析而定。这一步骤可能至关重要，因为图像质量取决于断层扫描系统、设备设置、标本尺寸以及制备方法16,17。
由于微计算机断层扫描（micro-CT）在研究多种正常及病变组织方面已取得成功应用，未来的研究应利用其成像能力获取体积数据以用于其他分析。因此，尽管根据本研究的目的，使用二维测量方法是可接受的，但对整体三维结构进行分割也有助于更精确地勾画出整个样本的轮廓。尽管非破坏性技术具备诸多优势，micro-CT 并不会取代免疫组织化学等其他方法，而是可作为补充手段，并在需要时允许后续进行组织学分析。
长期的太空飞行环境会导致宇航员在飞行期间及任务结束后出现一系列结构性和功能性的眼部改变，这些改变被定义为 SANS。研究发现包括远视性屈光偏移、眼球后部变平、脉络膜/视网膜皱褶以及棉絮斑19。与宇航员光学相干断层扫描（OCT）所观察到的视网膜神经纤维层增厚相反，本项动物微计算机断层扫描（micro-CT）研究记录到了视网膜和脉络膜层的变薄。这些结果出乎意料。这种差异可能源于混杂因素。与人类相比，小鼠的头向体液转移程度有限。这种体液转移的缺乏可能引发了对重力变化的不同生理反应。其次，小鼠在着陆后38小时内即被解剖，返回地球后的急性适应反应也可能导致视网膜和脉络膜的形态学改变。这一可能性的证实需要在飞行期间以及任务结束后进行更长期的测量研究。
本研究结果表明，太空飞行条件，尤其是重力变化，可能会在眼部引发一种急性且短期的反应。需要进一步研究以确定这些急性变化对视网膜功能的影响，以及太空飞行引起眼部结构改变的机制。
披露
所有作者均无披露内容。
致谢
本研究得到了美国国家航空航天局（NASA）空间生物学项目基金（编号：NNX15AB41G）和LLU基础科学系的支持。Sungshin Choi、Dennis Leveson 和 Rebecca Klotz 为本次太空飞行研究的成功做出了重要贡献，我们非常感谢他们的支持。作者还要感谢整个 NASA 生物样本共享计划团队提供的大力协助。
作者还希望感谢牙科研究中心提供的显微CT服务。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10 wt. % 磷钼酸 | Sigma | 12026-57-2 | |
| 绝对乙醇（Baker Analyzed） | VWR | 80252500 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Merck | L1825 | |
| X射线显微CT系统 SkyScan 1272 扫描仪 | Bruker |
参考文献
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