使用操作性策略转换范式评估应激对认知灵活性的影响

摘要

应激性生活事件会损害认知功能，增加精神障碍的风险。本方案阐述了如何利用自动化操作性策略转换范式，研究应激对雄性和雌性Sprague Dawley大鼠认知灵活性的影响。文中讨论了特定行为背后的关键脑区，并探讨了研究结果的转化应用价值。

摘要

压力影响认知功能。压力是增强还是损害认知功能，取决于多种因素，包括：1）应激源的类型、强度和持续时间；2）所研究的认知功能类型；以及3）应激发生相对于学习或执行认知任务的时间点。此外，压力对认知功能的影响在不同性别之间存在广泛记录的差异。本文介绍了一种自动化操作性策略转换范式的改进方法，用于评估压力变化如何影响雄性和雌性斯普拉格-多利大鼠（Sprague Dawley rats）的认知灵活性。具体而言，在该基于操作性行为的任务中，于训练前或训练后施加束缚应激，以考察压力对两性认知表现的影响。该自动化范式中各任务所关联的特定脑区已有明确研究（即内侧前额叶皮层和眶额皮层），这使得研究者可在实验过程中进行靶向干预，或在范式结束后检测这些脑区中特定基因与蛋白质的表达情况。该范式还可识别应激后出现的不同类型的行为错误，每种错误均有明确的神经基础。研究还发现，在重复束缚应激范式后，雄性和雌性在持续性错误方面表现出显著的性别差异。在临床前模型中应用这些技术，有助于揭示压力如何影响大脑功能并导致创伤后应激障碍（PTSD）和重度抑郁障碍（MDD）等精神疾病中的认知损害，这些疾病在发病率上表现出明显的性别差异。

引言

在人类中，生活中的应激事件会损害认知功能（即认知灵活性¹），认知灵活性是指适应认知加工策略以应对环境中新情况的能力²。认知功能的损害会引发并加重多种精神疾病，例如创伤后应激障碍（PTSD）和重度抑郁症（MDD）^3,4。这些疾病在女性中的发病率是男性的两倍^5,6,7,8，但造成这种差异的生物学基础仍不清楚。人类执行功能的某些方面可通过威斯康星卡片分类测验进行评估，该测验可反映认知灵活性²。PTSD⁹和MDD¹⁰患者在此任务中的表现受损，但这种变化的神经基础只能通过脑成像技术进行研究¹¹。

通过使用动物模型（尤其是啮齿类动物），人们对压力如何影响大脑的理解已取得进展。由于认知灵活性在与压力相关的疾病中受到影响，因此在啮齿类动物中检测这一表型具有极高的相关性。迄今为止，大多数应激神经生物学研究文献采用了一种替代性的认知灵活性范式（有时称为“挖掘任务”）^12,13,14,15。尽管该任务已被广泛验证，但其需要实验人员投入更多的时间和精力来训练啮齿类动物。本文改编并描述了一种成熟的自动化集合转移（set-shifting）方案¹⁶，用于在不同应激模型下评估雄性和雌性 Sprague Dawley 大鼠的认知灵活性^17,18。该方法对实验人员的干预要求极低，并可同时测试多只大鼠。此外，与其他版本的此类自动化任务¹⁹不同，本范式的改编版本仅需3天训练时间，并包含高效的程序化数据分析流程。

压力对认知功能的影响是增强还是削弱，取决于应激源的类型、强度和持续时间，以及应激发生相对于学习或执行认知任务的时间点^20,21。因此，本实验方案在操作性训练前后均纳入了应激处理程序，并考察了应激研究中的典型结果。此外，已有研究明确认定了与特定集合转移（set-shifting）过程相关的大脑区域^2,16,22；因此，本报告还描述了如何在应激及策略转移操作期间或之后，精准定位并评估特定脑区的功能。

关于直接检验认知灵活性中性别差异的研究较为有限^18,23。 本方案描述了如何：1）在实验范式中同时纳入雄性和雌性大鼠，以及2）在自由周期雌性大鼠的实验前和实验过程中追踪其动情周期。先前研究表明，操作式训练前的应激可导致大鼠在认知灵活性上出现性别特异性缺陷¹⁷。特别是，雌性大鼠在应激后表现出认知灵活性受损，而雄性大鼠在应激后认知灵活性反而增强¹⁷。有趣的是，具有人类性别偏向发病率的应激相关精神疾病的一个主要特征正是认知僵化。这些结果提示，雌性可能比雄性更容易受到此类认知损害的影响。在动物模型中应用这些技术将有助于阐明应激对大脑的影响，以及其在人类精神疾病中损害认知功能的机制。

方案

本研究中的所有实验程序均经布林莫尔学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。 在订购实验动物和开始实验之前，须获得IACUC或其它适用的监管机构批准。

1. 动物准备

1. 获取成年雄性和雌性 Sprague Dawley 大鼠。
   注：大鼠可在 65 日龄前送达，但请在达到此日龄之后再开始实验操作，以确保雄性和雌性大鼠均已完全成熟。
2. 尽可能长时间地将同性别的大鼠成对饲养，因为长期单独隔离是一种应激因素²⁴。在准备进行操作性策略转换实验范式前，需提前将大鼠单独饲养以实施食物限制。
3. 经过 1 周的适应期后，每天对大鼠进行 3–5 分钟的温和抓握操作。记录每只大鼠的体重。此外，若需评估性腺激素对实验结果的可能影响，可对雌性大鼠采集阴道灌洗液（见第 2 节）。
4. 对将要进行操作性策略转换范式实验的大鼠，在训练开始前至少 3 天实施食物限制，以确保其能够成功学会任务。确保水始终可自由获取。 应为每只动物保留书面记录，用于记录每日的食物和液体摄入量、水合状态，以及作为临时或永久性从实验方案中移除动物依据的行为学和临床变化（Morton 2000；NRC 2003b）。
   1. 若在训练开始前使用超过 3 天的应激处理，则应将食物限制的持续时间调整为与应激天数一致（例如，5 天的束缚应激同时配合食物限制²⁵）。
   2. 每天提供正常日摄食量的 80%（即每 100 g 体重给予 4 g 食物）²⁶。根据每日测量的大鼠体重计算每日应给予的食物量。
   3. 在训练和测试期间持续实施食物限制。但需在大鼠完成当日训练或测试后，再向其居住笼中添加食物，否则它们将缺乏为获取食物奖赏而执行任务的动机。此外，应确保任务完成后投喂食物的时间具有一定的不可预测性，这有助于避免动物因倾向于等待回到居住笼中获得食物而降低在操作箱中的任务执行动机。
      注：接受束缚应激范式处理的动物并未表现出比未受应激的对照组显著更大的体重下降。然而，不同的应激处理本身可能引起体重减轻，导致在基于体重的食物限制中，应激组大鼠获得的食物量少于未应激组，这可能构成额外的混杂应激因素。若出现此情况，可考虑为每只动物提供固定量的食物，而不依据体重进行调整²⁷。

2. 阴道灌洗

注意：性腺激素（即雌激素和孕激素）已知会影响应激反应和认知功能^28,29,30。这些激素在雌性大鼠的动情周期中会发生波动³¹。如果希望追踪自由动情周期雌性啮齿类动物的动情周期阶段，并将其与应激或认知灵活性数据进行关联，可按照下述方法采集阴道灌洗液。本文未提供考虑动情周期阶段的代表性数据。

1. 为获取雌性动物的阴道灌洗样本，准备一个装有温水的洁净烧杯、一支玻璃滴管、“灌洗”载玻片（即带有丙烯酸颜料圆圈以容纳灌洗样本的显微镜载玻片）以及一个空烧杯。
2. 用滴管吸取少量温水（约 0.5 mL），然后将滴管尖端插入雌性大鼠阴道内（可通过提起其尾巴进行操作）。将无菌水推注 2 至 3 次，并将收集到的液体排至显微镜载玻片上。注意不要使液体溢出灌洗载玻片上的圆圈区域。
3. 将多余的液体排入空烧杯中。在灌洗载玻片上标记大鼠编号，并按顺序放置每只大鼠的样本，以便明确区分各样本对应的动物。
4. 在采集下一只大鼠样本前，通过反复吸取并排出洁净温水数次，彻底冲洗滴管。
5. 小心将灌洗载玻片送至明场显微镜下观察灌洗样本，并根据 Becker 等人³¹所述方法对动情周期的阶段进行分类。
   注意：理想情况下，应持续进行数周的灌洗操作，以准确追踪雌性动物的动情周期，并且每天应在相近的时间点进行操作，以控制昼夜节律的影响。建议在实施应激或操作性策略转换实验之前完成该操作。也可使用棉签和无菌生理盐水作为替代方法代替滴管技术。 雌性大鼠的数据可在事后根据动情周期日进行分析（可考虑实施应激时所处的周期日和/或测试时所处的周期日）。

3. 仪器与软件

1. 使用操作性条件反射箱进行行为训练和测试。 
   1. 确保每个箱体至少包含两个可伸缩杠杆，每个杠杆上方各有一个刺激灯，另配有照明灯和用于强化的奖赏分配装置。
   2. 检查两个杠杆应位于中央奖赏递送区域的两侧，每个杠杆上方各有一个刺激灯。
   3. 使用照明灯照亮箱体内部，同时避免干扰对光刺激的检测（照明灯最好安装在箱体后壁，与杠杆和刺激灯相对）。
2. 在食物限制的大鼠实验中，使用无尘食物颗粒作为强化物（此处使用45 mg颗粒：含18.7%蛋白质、5.6%脂肪和4.7%纤维）。避免使用高蔗糖或高脂肪的颗粒（除非研究关注压力对可口食物摄入的影响）。
3. 通过具备操作箱体功能的计算机软件控制刺激呈现、杠杆操作和数据采集（材料表）。
   注意：如需了解使用该软件编写程序的相关信息，请联系作者。MED-PC脚本作为补充文件提供。该软件可记录动物在每次试验中的反应信息（按压的杠杆、反应是否正确/错误/无反应，以及做出选择的潜伏期）。基于这些数据，用户可按照行为分析部分所述方法计算行为范式中的各项指标。
4. 每天在相同时间进行训练/测试，以控制压力激素（及其他相关指标）的昼夜节律变化³²。
5. 在每个操作箱的底部托盘中铺上新鲜垫料，用于收集粪便/废弃物。每次实验结束后，清空托盘，使用酒精湿巾或IACUC批准的消毒剂清洁托盘和箱体内部 ，并在放入新动物前更换新鲜垫料。

4. 应激处理程序

1. 确定应在操作性策略转换范式训练之前、期间和/或之后实施应激程序（例如，在为期3天的操作性训练前实施5天的束缚应激） 与 3天操作式训练，随后进行单次束缚并测试。
2. 每天在相对于操作性训练的相同时段执行应激程序。（例如，上午9点开始进行30分钟的束缚应激，随后放入操作性条件行为箱）。
3. 在与饲养室和策略转换范式室分开的独立房间内进行应激操作（以避免目击应激带来的混杂因素）³³简而言之，将大鼠放入布鲁姆式透明固定管中，并封闭开口，注意避免夹伤四肢或尾巴。 每次实验对象之间，使用经IACUC批准的消毒剂清洁Broome式管。消毒不当可能残留信息素，从而对实验方案产生不利影响。
   注意：估算第一组大鼠在操作箱内停留的时间。该时间将根据训练情况而有所不同 与 测试日；然而，在运行若干队列后，可计算出完成每项任务的平均时间，以估算后续任务所需时间。
4. 根据可用的操作箱数量，对受试对象的应激程序进行交错安排。例如，先让四只大鼠接受束缚应激处理，并将其放入四个操作箱中；一小时后，再对另外四只动物实施应激处理，随后将其送入操作箱。

5. 训练

注意：该实验范式改编自 Floresco 等人开发的操作性定势转移程序，使其可在 3 天内完成¹⁹。  大鼠的训练程序需要 3 天（每天学习一项任务，如下所述）。大鼠无法学会这些任务的情况较为罕见。若某只大鼠未能学会每一项任务，则应将其排除在最终研究之外。训练范式的示意图见图 1A。

1. 将大鼠放入实验箱之前，确保食丸分配器中有足够的食丸，并且操作箱正常工作。为此，可在空箱中加载并启动一次训练日或测试日程序，手动测试正确的杠杆是否每次按压都能准确递送一次奖励。
2. 训练大鼠按压每个杠杆
   1. 在训练第一天将大鼠放入箱内之前，手动在正确的杠杆上放置一颗食丸奖励，该杠杆位置应在每个实验箱中加载训练程序时已指定。
   2. 使用固定比率（FR-1）程序训练大鼠，即每次正确按压杠杆均给予一次强化奖励。通过在控制实验箱的计算机上加载训练程序时指定正确的杠杆，使不同受试动物和/或实验条件下每日的正确杠杆位置保持平衡（每次仅塑造一个杠杆的反应）。
   3. 让大鼠持续按压杠杆，直至达到按压正确杠杆50次的标准，通常在30–45分钟内完成任务。
   4. 次日，使用与第一天相同的程序，但将相反一侧的杠杆设为正确杠杆，强制大鼠在对侧杠杆上执行相同任务。本训练日无需在杠杆上手动放置食丸进行“塑造”。通常，大鼠在学会按压第一个杠杆后，能迅速掌握该标准。
3. 训练大鼠对光线索作出反应
   1. 训练第三天，在每次15秒的试验中，同时点亮两个杠杆上方的灯，期间大鼠可按压任一杠杆以获得食丸奖励。在光辨别任务中，该程序将随机决定每轮试验中哪个杠杆为正确杠杆。
   2. 如果大鼠按压了正确杠杆，应确保灯光持续亮起3秒，并递送奖励，随后进入5秒间隔期，此期间灯光关闭，之后开始下一轮试验。如果大鼠按压了错误杠杆，则不应给予奖励，且灯光关闭10秒后才可开始下一轮试验。
   3. 完成最后一天训练后，通过将某一侧杠杆的按压次数除以总按压次数，计算“侧向偏好”，以判断大鼠是否偏好左侧或右侧杠杆。在测试日，应让大鼠从其偏好较低的一侧开始，以确保其学习的是特定的反应-奖励对应关系，而非单纯偏向某一偏好杠杆。

6. 测试

注意：有关下文所述测试范式的图示，请参见图1B。

1. 在第4天（测试日），在应激处理后将大鼠放入操作箱中，并依次进行侧向辨别、侧向反转和光辨别任务测试。确保光辨别任务中仅在“正确”杠杆上方的灯被点亮。在每个任务中，大鼠必须连续完成8次正确试验才能通过该辨别任务，期间不得按压无奖励的错误杠杆。一旦按压错误杠杆，该连续试验序列将被重置。
   1. 使用侧向辨别任务对大鼠进行测试。根据训练第三天确定的大鼠偏好较低的一侧，使用侧向辨别程序奖励大鼠按压该侧杠杆，忽略灯光线索。当正确杠杆被连续按压8次（排除遗漏）时，任务结束。
   2. 通过再次运行侧向辨别程序进行侧向反转测试，但此次将侧向辨别任务中的相反杠杆设为正确杠杆。确保大鼠按压此杠杆时获得奖励，忽略灯光线索。当正确杠杆被连续按压8次（排除遗漏）时，任务结束。
   3. 进行光辨别任务，该任务奖励大鼠按压上方灯光点亮的杠杆。每次操作箱测试在正确杠杆被连续按压8次（排除遗漏）后完成。
      注意：根据以往研究，无论是否连续按压，这些任务均至少包含30次试验，以确保大鼠有足够时间学习每项任务的规则¹⁸。因此，若大鼠在未达到30次试验前即连续完成8次正确试验，任务将继续进行，直至完成30次试验为止。

7. 行为学分析

注意：只要每项任务的 MED-PC 脚本已启动并运行完毕（参见补充材料中的 MED-PC 脚本），测试当天每只动物所获取的数据将由计算机自动记录并保存。

1. 使用计算机程序打开每个测试日任务（侧向辨别、侧向反转和光辨别）的数据。程序记录的主要指标包括达到标准所需的试验次数、达到标准过程中的错误次数以及达到标准所需的时间。这些指标的具体含义如下所述。
   注意：作者已开发出一个 MATLAB 脚本，可用于自动化分析过程，并区分perseverative（持续性）错误与regressive（回归性）错误（如需代码信息以简化数据分析，请联系作者）。
   1. 以达到标准所需的试验次数作为准确性的主要指标，该值指大鼠连续完成八次正确试验所需的总试验次数（不包括遗漏试验），包含这八次正确试验。该数据位于测试日任一任务由 MED-PC 脚本生成的数据文件中数组 B 的第一列。
   2. 检查每项任务期间发生的总错误次数。该数据位于测试日任一任务由 MED-PC 脚本生成的数据文件中数组 B 的第三列。这些错误进一步分为持续性错误和回归性错误。当大鼠继续遵循先前任务的旧规则时，即产生持续性错误；当大鼠已脱离旧规则但仍未能掌握新规则时，即产生回归性错误（有关此类错误计算方法的更多细节，请参见已发表的方法¹⁸）。
   3. 如果大鼠在 15 秒内未对光提示作出反应，则该次试验被归类为遗漏试验，不计入达到标准所需的总试验次数。计算方法如下：首先将正确反应次数（位于数据文件中数组 B 的第二列）与错误次数（位于数据文件中数组 B 的第三列）相加，然后用达到标准的总试验次数减去该和值（达到标准的总试验次数为数据文件中数组 B 第一列的最后一个数值，不同于“达到标准所需的试验次数”）。
   4. 利用程序记录的开始和结束时间（位于测试日任一任务由 MED-PC 脚本生成的数据文件顶部）来计算达到标准所需的时间。还可通过数据文件计算首次压杆反应的潜伏期，即用达到标准所需的时间减去变量 K（从首次压杆开始经过的秒数）。
   5. 对同一处理组内大鼠的各项行为学指标数据进行平均，并根据所分析变量的数量进行适当的统计分析。

8. 脑部底物

1. 确定感兴趣的大脑区域和/或认知灵活性的某个方面。例如，如果应激会增加侧向反转任务中的持续性错误，则眶额皮层（OFC）可能尤为值得关注，因为既往的损毁研究已表明该脑区在多种形式的反转学习中发挥作用（例如，在侧向反转任务中测试的空间反转）^34,35,36。在此示例中，可在策略转换范式完成后处死大鼠，并采用已描述的免疫组织化学方法²⁵（此处简要概述）检测OFC中的c-fos表达（神经元激活的指标³⁷）。
   1. 首先，从动物体内取出大脑，并切成40 µm厚的切片。
   2. 用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织，每次5分钟，共洗4次，然后在0.3%过氧化氢中孵育10分钟，以淬灭内源性过氧化物酶。
   3. 用PBS清洗组织2次，每次5分钟，然后在小鼠抗c-fos一抗（1:500）、3%正常驴血清（NDS）和0.3% Triton X中4℃过夜孵育。
   4. 次日，用PBS清洗组织3次，每次5分钟，然后在生物素-SP标记的驴抗小鼠二抗（1:500）中室温孵育2小时。
   5. 用PBS清洗组织3次，每次5分钟，然后在亲和素-链霉亲和素AB复合物中孵育1小时。
   6. 用PBS清洗组织3次，每次5分钟，然后在DAB溶液中孵育最多10分钟，使组织发生氧化显色反应。
   7. 用PBS清洗组织3次，每次5分钟，然后将脑切片贴附于玻璃显微镜载玻片上。
   8. 使用基于甲苯的封片剂封片，并用明场显微镜成像。
      注：如代表性结果所示，大鼠在策略转换范式结束30分钟后被处死，大约在反转任务完成后的60–90分钟内（具体时间取决于每只大鼠在光任务中的表现）。此时间点应能较好地反映c-fos的表达水平³⁸，从而体现其在反转任务中的表现。
2. 或者，在施加应激或操作性策略转换范式之前，对特定脑区进行埋管以用于药物注射或病毒注射。
   注：研究者可能希望探究调控神经底物如何改变应激对认知灵活性的影响。例如，可在测试前阻断前额叶皮层中的某种特定神经递质受体。

结果

上述经过调整的自动化操作性策略转换范式被用于确定反复施加的束缚应激是否影响雄性和雌性Sprague Dawley大鼠的认知功能。代表性行为学数据见下文图2。简言之，对照组与反复束缚处理的大鼠均接受了该操作性策略转换测试，测试包含一系列任务：侧向辨别、侧向反转以及光辨别任务。

每项任务达到标准所需的试验次数如图2A所示。通常情况下，每项任务中表现越好，达到标准所需的试验次数越少。这些数据表明，在经历急性束缚后，雄性个体完成侧向反转任务所需的试验次数显著少于未受应激的对照组雄性；相反，受应激的雌性个体完成该任务所需的试验次数显著增加。这些结果提示，应激后雄性表现改善，而雌性表现受损。在光辨别任务中，与对照组雌性相比，应激使达到标准所需的试验次数增加，从而导致雌性在此任务中的表现受损，而雄性则未受影响。

每项注意力任务的总错误次数如图2B所示。与达到标准所...

讨论

本实验方案展示了如何测量应激对认知功能的影响。具体而言，在啮齿类动物中采用了一种改良的操作性策略转换范式，用于测量认知灵活性（类似于人类的威斯康星卡片分类任务）¹。认知灵活性指的是个体调整认知加工策略以适应环境中新条件的能力，对于正常的日常功能至关重要²。由于人类关于认知灵活性的研究大多局限于脑成像技术¹¹，在动物中应用该范式将极大促进对应激对大脑和认知影响的理解。

压力会损害认知功能⁴⁰。事实上，这是创伤后应激障碍（PTSD）和重度抑郁症（MDD）等压力相关疾病中最常见的表型之一^3,41。此外，压力相关精神疾病的发生存在显著的性别差异^5,6,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3 英寸玻璃滴管吸头	Amazon	4306-30-012LC	用于阴道灌洗
酒精擦拭片	VWR	15648-990	用于在大鼠之间清洁设置转移箱中的托盘
生物素-SP标记的AffiniPure驴抗小鼠IgG（H+L），与牛、鸡、山羊、豚鼠、仓鼠、马、人、兔、羊血清蛋白的交叉反应最小	Jackson ImmunoResearch	715-065-150	所有其他DAB染色方案材料均为标准缓冲液/DAB，此处未作具体说明，因并非本方法论文的主要重点
c-fos小鼠单克隆一抗	AbCam	ab208942	用于染色在执行集合转移任务后脑区的神经元激活
无尘食物颗粒	Bio Serv	F0021	用于集合转移箱（作为奖励的分配装置）
GraphPad Prism			用于数据分析
Leica DM4 B 显微镜及配套成像软件	Leica		显微镜和工作站的多个不同部件，用于灌洗样本和/或c-fos的成像
MatLab			软件；用于分析集合转移数据的代码，可根据要求提供
Med-PC 软件套件	Med Associates	SOF-736	软件；使用代码控制操作性条件箱
操作性条件箱	Med PC	MED-008-B2	包含多种用于构建实验箱的部件及配套软件；我们还编写了独立的集合转移代码，可根据要求提供
大鼠垫料	Envigo	T.7097
大鼠饲料	Envigo	T.2014.15
束缚装置	Bryn Mawr College	由本单位车间制作	用于应激暴露；具体规格可根据要求提供
Scribbles 3D 布料颜料	Amazon	54139	用于阴道灌洗
Sprague Dawley 大鼠	Envigo		至少 D65 日龄的雄性和雌性大鼠
VWR Superfrost Plus 显微载玻片	VWR	48311-703	用于阴道灌洗和/或脑切片/c-fos染色