使用操作性策略转换范式评估应激对认知灵活性的影响

摘要

应激性生活事件会损害认知功能，增加精神障碍的风险。本方案阐述了如何利用自动化操作性策略转换范式，研究应激对雄性和雌性Sprague Dawley大鼠认知灵活性的影响。文中讨论了特定行为背后的关键脑区，并探讨了研究结果的转化应用价值。

摘要

压力影响认知功能。压力是增强还是损害认知功能，取决于多种因素，包括：1）应激源的类型、强度和持续时间；2）所研究的认知功能类型；以及3）应激发生相对于学习或执行认知任务的时间点。此外，压力对认知功能的影响在不同性别之间存在广泛记录的差异。本文介绍了一种自动化操作性策略转换范式的改进方法，用于评估压力变化如何影响雄性和雌性斯普拉格-多利大鼠（Sprague Dawley rats）的认知灵活性。具体而言，在该基于操作性行为的任务中，于训练前或训练后施加束缚应激，以考察压力对两性认知表现的影响。该自动化范式中各任务所关联的特定脑区已有明确研究（即内侧前额叶皮层和眶额皮层），这使得研究者可在实验过程中进行靶向干预，或在范式结束后检测这些脑区中特定基因与蛋白质的表达情况。该范式还可识别应激后出现的不同类型的行为错误，每种错误均有明确的神经基础。研究还发现，在重复束缚应激范式后，雄性和雌性在持续性错误方面表现出显著的性别差异。在临床前模型中应用这些技术，有助于揭示压力如何影响大脑功能并导致创伤后应激障碍（PTSD）和重度抑郁障碍（MDD）等精神疾病中的认知损害，这些疾病在发病率上表现出明显的性别差异。

引言

在人类中，生活中的应激事件会损害认知功能（即认知灵活性¹），认知灵活性是指适应认知加工策略以应对环境中新情况的能力²。认知功能的损害会引发并加重多种精神疾病，例如创伤后应激障碍（PTSD）和重度抑郁症（MDD）^3,4。这些疾病在女性中的发病率是男性的两倍^5,6,7,8，但造成这种差异的生物学基础仍不清楚。人类执行功能的某些方面可通过威斯康星卡片分类测验进行评估，该测验可反映认知灵活性²。PTSD⁹和MDD¹⁰患者在此任务中的表现受损，但这种变化的神经基础只能通过脑成像技术进行研究¹¹。

通过使用动物模型（尤其是啮齿类动物），人们对压力如何影响大脑的理解已取得进展。由于认知灵活性在与压力相关的疾病中受到影响，因此在啮齿类动物中....

方案

本研究中的所有实验程序均经布林莫尔学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。 在订购实验动物和开始实验之前，须获得IACUC或其它适用的监管机构批准。

1. 动物准备

1. 获取成年雄性和雌性 Sprague Dawley 大鼠。
   注：大鼠可在 65 日龄前送达，但请在达到此日龄之后再开始实验操作，以确保雄性和雌性大鼠均已完全成熟。
2. 尽可能长时间地将同性别的大鼠成对饲养，因为长期单独隔离是一种应激因素²⁴。在准备进行操作性策略转换实验范式前，需提前将大鼠单独饲养以实施食物限制。
3. 经过 1 周的适应期后，每天对大鼠进行 3–5 分钟的温和抓握操作。记录每只大鼠的体重。此外，若需评估性腺激素对实验结果的可能影响，可对雌性大鼠采集阴道灌洗液（见第 2 节）。
4. 对将要进行操作性策略转换范式实验的大鼠，在训练开始前至少 3 天实施食物限制，以确保其能够成功学会任务。确保水始终可自由获取。 应为每只动物保留书面记录，用于记录每日的食物和液体摄入量、水合状态，以及作为临时或永久性从实验方案中移除动物依据的行为学和临床变化（Morton 2000；NRC 2003b）。
   1. 若在训练开始前使用超过 3 天的应激处理，则应将食物限制的持续时间调整为与应激天数一致（例如，5 天的束缚应激同时配合食物限制

结果

上述经过调整的自动化操作性策略转换范式被用于确定反复施加的束缚应激是否影响雄性和雌性Sprague Dawley大鼠的认知功能。代表性行为学数据见下文图2。简言之，对照组与反复束缚处理的大鼠均接受了该操作性策略转换测试，测试包含一系列任务：侧向辨别、侧向反转以及光辨别任务。

每项任务达到标准所需的试验次数如图2A所示。通常情况下，每项任务中表现越好，达到标准所需的试验次数越少。这些数据表明，在经历急性束缚后，雄性个体完成侧向反转任务所需的试验次数显著少于未受应激的对照组雄性；相反，受应激的雌性个体完成该任务所需的试验次数显著增加。这些结果提示，应激后雄性表现改善，而雌性表现受损。在光辨别任务中，与对照组雌性相比，应激使达到标准所需的试验次数增加，从而导致雌性在此任务中的表现受损，而雄性则未受影响。

每项注意力任务的总错误次数如图2B所示。与达到标准所.......

讨论

本实验方案展示了如何测量应激对认知功能的影响。具体而言，在啮齿类动物中采用了一种改良的操作性策略转换范式，用于测量认知灵活性（类似于人类的威斯康星卡片分类任务）¹。认知灵活性指的是个体调整认知加工策略以适应环境中新条件的能力，对于正常的日常功能至关重要²。由于人类关于认知灵活性的研究大多局限于脑成像技术¹¹，在动物中应用该范式将极大促进对应激对大脑和认知影响的理解。

压力会损害认知功能⁴⁰。事实上，这是创伤后应激障碍（PTSD）和重度抑郁症（MDD）等压力相关疾病中最常见的表型之一^3,41。此外，压力相关精神疾病的发生存在显著的性别差异^5,6,

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3 英寸玻璃滴管吸头	Amazon	4306-30-012LC	用于阴道灌洗
酒精擦拭片	VWR	15648-990	用于在大鼠之间清洁设置转移箱中的托盘
生物素-SP标记的AffiniPure驴抗小鼠IgG（H+L），与牛、鸡、山羊、豚鼠、仓鼠、马、人、兔、羊血清蛋白的交叉反应最小	Jackson ImmunoResearch	715-065-150	所有其他DAB染色方案材料均为标准缓冲液/DAB，此处未作具体说明，因并非本方法论文的主要重点
c-fos小鼠单克隆一抗	AbCam	ab208942	用于染色在执行集合转移任务后脑区的神经元激活
无尘食物颗粒	Bio Serv	F0021	用于集合转移箱（作为奖励的分配装置）
GraphPad Prism			用于数据分析
Leica DM4 B 显微镜及配套成像软件	Leica		显微镜和工作站的多个不同部件，用于灌洗样本和/或c-fos的成像
MatLab			软件；用于分析集合转移数据的代码，可根据要求提供
Med-PC 软件套件	Med Associates	SOF-736	软件；使用代码控制操作性条件箱
操作性条件箱	Med PC	MED-008-B2	包含多种用于构建实验箱的部件及配套软件；我们还编写了独立的集合转移代码，可根据要求提供
大鼠垫料	Envigo	T.7097
大鼠饲料	Envigo	T.2014.15
束缚装置	Bryn Mawr College	由本单位车间制作	用于应激暴露；具体规格可根据要求提供
Scribbles 3D 布料颜料	Amazon	54139	用于阴道灌洗
Sprague Dawley 大鼠	Envigo		至少 D65 日龄的雄性和雌性大鼠
VWR Superfrost Plus 显微载玻片	VWR	48311-703	用于阴道灌洗和/或脑切片/c-fos染色