本文介绍了一种节省时间和空间的方法，利用24孔组织培养板对单只蚊虫的产卵量和孵化率进行计数，该方法可显著提高繁殖力和生育力检测的规模和速度。
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本文内容
摘要
摘要
蚊子作为多种病原体的传播媒介，对公共卫生构成重大威胁。在需要评估蚊子适合度参数（特别是个体水平的产卵量和孵化率）的研究中，传统方法由于劳动强度高且需要大量实验室空间，给研究人员带来了巨大负担。本文介绍一种简便的方法，利用每个孔中含琼脂糖的24孔细胞培养板，结合对每个孔的数字成像，以在个体水平上测定产卵数和孵化率，显著减少了所需的时间和空间。
引言
控制蚊虫以保护人类免受虫媒病原体感染是一项重要的公共卫生目标，这主要归因于目前针对蚊媒携带的大多数病原体尚无有效的疫苗。许多研究致力于降低蚊虫适应性，并结合可在野外应用的种群控制策略以减少蚊虫数量。1,2,3这包括创建转基因蚊子和/或CRISPR/Cas9基因敲除品系的大量研究。此类种群改造策略需要对个体适合度参数进行详细评估。4评估雌蚊适应性的常规实验室技术包括将交配后并吸血的雌蚊个体分别置于100 mL容器中饲养5，经改造的50 mL锥形管，或试管 果蝇 通过使用湿润的棉絮和滤纸片提供潮湿表面，以改良饲养条件，供产卵（即卵纸）使用1,2,6,7. 这类方法需要相对较大的空间（例如，最多可容纳100个时为30 cm × 30 cm × 10 cm：宽 × 长 × 高） 果蝇 管) (图1），以及对单个产卵纸进行操作以计数卵和孵化幼虫，这些步骤可能非常耗时费力。本文提供了一种利用24孔板和琼脂糖作为产卵基质来计数蚊卵并测定孵化率的方法，以克服上述问题8.
同时，Ioshino 等人9描述了一种使用12孔板和24孔板对单只雌虫所产卵进行计数的详细方法。该方案相较于传统方法在节省时间和空间方面具有显著改进9。然而，他们所描述的方案仍采用湿润的滤纸作为产卵表面，这需要逐张展开滤纸才能进行计数，因为卵通常位于滤纸下方或褶皱中。此外，该方案未包含成像技术的应用，也未提供幼虫计数的方法。
本文介绍了一种改进的埃及伊蚊（Ae. aegypti）产卵数（即繁殖力）和孵化率（即生育力）适合度测定方法，该方法采用琼脂糖作为产卵基质，并在24孔组织培养板中进行，适用于在湿润表面产卵的蚊虫。这些培养板被命名为“EAgaL”板，名称来源于Egg（卵）、Agarose（琼脂糖）和Larva（幼虫）。这种24孔板为每只蚊子提供了最小化的产卵面积，从而简化并极大减少了计数以及维持卵和孵化后数天内幼虫所需的时间与工作量。EAgaL板使用半透明的琼脂糖作为产卵表面，避免了传统方法中需操作产卵纸以及寻找卵和孵化后幼虫的步骤；通过对每个孔进行拍照，可建立实验结果的长期存档记录，并将计数过程在时间和空间上与饲养/操作过程分离，解决了实验操作时间紧张的问题。
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方案
1. 培养板制备
- 在24孔组织培养板盖子上钻孔（每孔4−6个孔），使用家用钻孔机和直径约1.6 mm（1/16英寸）的钻头图2).
注意：这些孔可防止琼脂糖产生的冷凝水积聚在盖子上，避免蚊子在其中产卵。雌性成虫的标准尺寸 埃及伊蚊 ("利物浦" 品系）的翅展约为3.11 mm。当使用体型较小的蚊子时，建议减小孔径，以避免蚊子从孔板中逃逸。 - 在产卵实验前一天，将培养皿彻底清洗并用蒸馏水冲洗，然后在室温下浸泡于1−5%的次氯酸钠溶液中30−60分钟。随后在流动的去离子水中充分冲洗，并将其干燥。
注意：此步骤可降低真菌和细菌在琼脂糖上生长的可能性。 - 在去离子水中配制2%琼脂糖溶液并加热融化，随后立即使用1,000 μL移液器将500 μL熔融琼脂糖加入24孔板的每个孔中（图3A,B当琼脂糖开始冷却并堵塞移液器吸头时，重新加热琼脂糖并更换新的移液器吸头。
注意：避免移液器吸头接触孔壁，因为这可能会在孔壁上留下琼脂糖碎片，导致雌性果蝇在该处产卵，从而干扰成像和计数过程。 - 使用前，将孔板置于实验台面上过夜，使孔壁上的冷凝水干燥。图3C,D).
注意：从血液饲喂到幼虫成像，EAgaL平板实验的时间线如图所示 图4，用于菌落蚊虫（埃及伊蚊 “Liverpool”品系在昆虫饲养室条件下饲养，光照周期为14小时光照：10小时黑暗，温度27 °C，相对湿度80%，每只49.5 cm × 29.2 cm × 9.5 cm的托盘中加入2 L水，饲养500只幼虫。建议各实验室在使用EAgaL板时，针对所用蚊虫进行测试，尤其是在使用不同品系、不同蚊种或不同饲养方案时。
2. 蚊虫饲喂
注意：所有处理组和对照组必须使用在相同条件下饲养的蚊子，因为幼虫期的营养状况会影响蚊子的适合度参数10,11。幼虫饲养时应保证空间宽松并提供充足食物。雌蚊羽化时需与雄蚊共处，以确保交配成功，并使其成熟至少3天。
- 在血液喂养前至少16小时，移除雌性蚊虫的所有水源和/或糖源，以增强其吸血行为。
- 将人工喂养用的水循环装置预热至37 °C，并使用含有脊椎动物血液的人工喂食器对雌性蚊虫喂血15−30分钟（图5A）。
- 用CO2或冰对蚊虫进行麻醉，将其转移至置于冰上的玻璃培养皿中，挑选出已吸饱血液的个体（图5B），放入容器中，并提供30%蔗糖水饲养超过72小时，直至雌虫完成排泄和卵子发育。
注意：若雌虫所饲喂的蔗糖水浓度较低，应在48小时后移除蔗糖水及任何湿润表面，以防雌虫产卵。
3. 产卵
- 在将蚊子转移至孔板前约1小时，使用移液管向每个孔板孔中加入2−3滴（约80−120 μL）水。
- 在血液饲喂后至少72小时，用CO2或冰块使蚊子麻醉，将其转移至置于冰上的玻璃培养皿中，并将每只蚊子单独放置在置于冰上的24孔板倒置的盖子上（图6A）。
注意：本步骤参考自Ioshino等人的方法9。 - 当所有24只蚊子均放置完毕后，用一个倒置的孔板底座盖住盖子，用一条全新的橡胶圈固定盖子与底座，并将其放入环境培养箱（或饲养室）中（图6B），直至蚊子恢复活动（约10−15分钟），然后将孔板正置（图6C）（图6D）。
- 让雌蚊产卵24−48小时，随后将雌蚊从孔板中释放至大型笼中以移除。
注意：若需追踪个体雌蚊，可通过冷却孔板使其麻醉，并在冰上逐个移除。若在血液饲喂后不足72小时即转移雌蚊至孔板，将观察到产卵延迟以及深色排泄物干扰卵计数的现象（图7D）。
4. 卵计数
- 检查24孔板的每个孔，因为有时蚊子会将卵产在孔壁以及琼脂糖/塑料表面的边缘处，这些位置的卵在照片中难以分辨。使用湿润的画笔将产在孔壁和琼脂糖边缘的卵转移至琼脂糖的平坦表面，使所有卵处于同一平面上且互不重叠。
注意：由于琼脂糖溶液的表面张力，琼脂糖的边缘通常位于相机焦平面之外。 - 使用镊子移除孔中可能干扰卵成像的断腿、断翅及其他颗粒物图7C).
- 将白纸置于培养皿下方，以增强深色蚊卵在体视显微镜照明成像前的对比度图7A).
- 使用小型数码相机的显微模式拍摄每孔的图像，该模式可使用户聚焦于近至1 cm的物体。此功能允许将相机直接放置在培养板上拍摄卵子图像，无需使用三脚架或支架。图7A）。为了区分成团产下的单个卵，应使用精细或超精细模式拍摄高分辨率图像，以便观察近距离的细节。
注意：使用前请清空相机存储卡，以避免新旧图像混淆。 - 拍摄完每孔后，对整块板进行成像，并附上带有成像顺序标签的图像，以便后续区分每块板图7E).
- 用移液管向每个孔中加入约5滴水（约200 μL）形成一层薄水层，以防止琼脂糖凝胶塞和卵干燥，并促进胚胎发育和孵化。在最初几小时内需注意观察水位，并每天检查，因为琼脂糖可能吸水或水分可能发生蒸发而导致水位下降。当水位过低影响幼虫孵化时，应及时补充水分。
注意：水分蒸发在单个培养板内以及多层叠放的培养板之间均不均匀。观察发现干燥顺序如下：1）角上的孔（A1、A6、D1、D6）干燥最快；其次为 2）位于板外缘的孔（A2–A5、B1、B6、C1、C6、D2–D5）；最后为 3）内部的孔。当培养板叠放时，最上层的板干燥最快。 - 将图像转移至装有 ImageJ（Fiji）的计算机，并将文件重命名为更易于管理的格式，例如“[plate ID]_[well ID].jpg”图8A,B).
- 创建一个电子表格文件，用于记录卵的数量（即繁殖力）和幼虫数量，并计算孵化率（即受精率）图9E).
- 使用 ImageJ（Fiji）打开图像12 并使用“多点” 工具标记每个卵（图9A−C）；使用“+” 或 “–”用于计数卵子的关键 团块。标记完所有卵后，双击 多点图标 以增加标记的数量（图9D）。将结果记录在电子表格中。
5. 生育力评估
注意：2天后，一龄幼虫可能开始从孔中孵化。为确保所有可存活的卵均已孵化，需再等待3−5天后再进行成像或计数。
- 通过将 1/16 茶匙（约 168 mg）的鱼饲料粉（即蚊幼虫常规食物）与 20 mL 水混合，并静置至大颗粒沉淀，制备幼虫食物（图 10A−D）。一旦幼虫孵化出现，立即向含有幼虫的孔中加入食物（上清液），因为幼虫在无食物条件下存活时间很短。
注意：添加过多食物颗粒可能干扰幼虫成像和计数。 - 在向孔中加水后约 5–8 天，用碎冰覆盖培养板 15−20 分钟，使培养板冷却以麻醉幼虫。
- 保持培养板置于冰上，对每一孔进行成像，操作方式与对卵成像时相同。为获得幼虫图像，可在培养板下方插入黑色材料以提供深色背景，增强对比度。拍摄完每块板的所有孔后，再对整块板拍摄一张包含成像顺序标签的图像，以便后续区分各培养板。
注意：成像时保持培养板在冰上，因为幼虫活动可能影响计数准确性。培养板可重复使用；使用后将蚊虫和琼脂糖冷冻并清除，以便下次使用。EAgaL 板不适合用于将幼虫培养至较晚期阶段。 - 使用 ImageJ（Fiji）软件打开图像，并利用“多点”工具通过点击每个幼虫进行计数。在 3−5 天期间，部分幼虫可能已蜕皮，尤其是在幼虫数量较少的孔中。因此，计数时应排除蜕下的表皮（即蜕壳），这些结构外观类似仅有头部并带少量身体的幼虫，或呈皱缩状的幼虫（图 10E）。将结果记录在电子表格中。
6. 执行分析
- 在收集完用于繁殖力和生育力分析的全部必要数据后，使用偏好的软件进行适当的统计分析并绘制图表。
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结果
通过显微注射将靶向候选铁转运蛋白（FeT）或对照基因（EGFP）的dsRNA注入蚊子体内，随后提供血液饲喂，并采用上述步骤所述的EAgaL板法测定其繁殖力和生育力输出。
注射dsRNA后FeT表达被沉默的蚊虫，其产卵数量和孵化率均显著降低（图11A−C）。所有对照组和处理组蚊虫在吸血后72小时被放置于EAgaL板中。FeT沉默的蚊虫还表现出排泄延迟，以及卵体积较小、颜色较浅（图12A，B）。相关示例结果亦见于Tsujimoto等人的研究8。
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讨论
EAgaL 平板极大地减少了进行个体繁殖力和生育力测定所需的人力、时间和空间 伊蚊 aegypti 与FT方法相比，FT方法与EAgaL板的初步比较结果显示，所有步骤的时间均更短（成像技术已应用于FT方法）表1）。作为参考，可估算启动和 每次检测（一块24孔EAgaL板对比24个FTs）的成本如下所示 表 2.
使用EAgaL板时需考虑几个要点。最初人们担心将蚊子置于如此狭小的空间内，可能因活动受限而无法产下全部卵。为了验证是否存在这种情况，在蚊子于EAgaL板中放置48小时后，将其集体转移到一个更大的笼子中，并提供一个内衬浸水滤纸的产卵杯，继续产卵48小时。结果表明，蚊子确实会继续产卵，但每只雌蚊平均仅额外产下2.1枚卵，这一数量在大多数（即使不是全部）情况下不会对任何统计分析结果产生显著影响。这些数据来自超过500只蚊子的测试（数据未显示）。然而，该结论可能仅适用于在所述条件下培养的埃及伊蚊（Ae. aegypti）“利物浦”品系。各个实验室可能需...
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披露
作者声明本研究无任何利益冲突。
致谢
我们感谢德克萨斯A&M大学&感谢#38;M 农业生命研究昆虫传播疾病资助计划的经费支持。我们还感谢Adelman实验室成员在本方法开发及论文撰写过程中提供的帮助和建议，以及Kevin Myles实验室成员的支持。同时，我们感谢审稿人和编辑为提升本文质量所提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.6 mm Φ 钻头 | 也可使用加热的金属钉 | ||
| 1000 μL型移液器吸头（长） | 奥林巴斯塑料制品 | 24-165RL | |
| 24孔细胞培养板 | 赛默飞世尔科技 | 930186 | 透明平底带环形盖板 |
| 琼脂糖 | VWR | 0710-500G | |
| 紧凑型数码相机 | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| 计算机（Windows、Mac 或 Linux） | |||
| 去离子水 | |||
| Fiji（ImageJ）软件 | 下载地址：https://fiji.sc/ | ||
| 镊子 | Dumont | 锐利的镊子可能会破坏蚊虫的躯体 | |
| 玻璃培养皿 | VWR | ||
| 家用漂白剂 | |||
| 家用电动钻孔机 | |||
| 体视显微镜照明灯（鹅颈管） | |||
| P-1000 移液器 | Gilson | ||
| 画笔 | |||
| 橡皮筋 | |||
| SD卡 | 使用数码相机拍摄图像（建议使用 DSHC、SDXC 格式） | ||
| 电子表格软件（Microsoft Excel） | 微软 | 任何电子表格软件均可使用 | |
| TetraMin 鱼饲料 | 四面体 | 使用咖啡研磨机、搅拌机或研钵研磨 &研钵和研杵 | |
| 移液管 | VWR | 16011-188 |
参考文献
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重印与许可
