本文介绍了一种节省时间和空间的方法，利用24孔组织培养板对单只蚊虫的产卵量和孵化率进行计数，该方法可显著提高繁殖力和生育力检测的规模和速度。
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本文内容
摘要
摘要
蚊子作为多种病原体的传播媒介，对公共卫生构成重大威胁。在需要评估蚊子适合度参数（特别是个体水平的产卵量和孵化率）的研究中，传统方法由于劳动强度高且需要大量实验室空间，给研究人员带来了巨大负担。本文介绍一种简便的方法，利用每个孔中含琼脂糖的24孔细胞培养板，结合对每个孔的数字成像，以在个体水平上测定产卵数和孵化率，显著减少了所需的时间和空间。
引言
控制蚊虫以保护人类免受虫媒病原体感染是一项重要的公共卫生目标，这主要归因于目前针对蚊媒携带的大多数病原体尚无有效的疫苗。许多研究致力于降低蚊虫适应性，并结合可在野外应用的种群控制策略以减少蚊虫数量。1,2,3这包括创建转基因蚊子和/或CRISPR/Cas9基因敲除品系的大量研究。此类种群改造策略需要对个体适合度参数进行详细评估。4评估雌蚊适应性的常规实验室技术包括将交配后并吸血的雌蚊个体分别置于100 mL容器中饲养5，经改造的50 mL锥形管，或试管 果蝇 通过使用湿润的棉絮和滤纸片提供潮湿表面，以改良饲养条件，供产卵（即卵纸）使用1,2,6,7. 这类方法需要相对较大的空间（例如，最多可容纳100个时为30 cm × 30 cm × 10 cm：宽 × 长 × 高） 果蝇 管) (图1），以及对单个产....
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方案
1. 培养板制备
- 在24孔组织培养板盖子上钻孔（每孔4−6个孔），使用家用钻孔机和直径约1.6 mm（1/16英寸）的钻头图2).
注意：这些孔可防止琼脂糖产生的冷凝水积聚在盖子上，避免蚊子在其中产卵。雌性成虫的标准尺寸 埃及伊蚊 ("利物浦" 品系）的翅展约为3.11 mm。当使用体型较小的蚊子时，建议减小孔径，以避免蚊子从孔板中逃逸。 - 在产卵实验前一天，将培养皿彻底清洗并用蒸馏水冲洗，然后在室温下浸泡于1−5%的次氯酸钠溶液中30−60分钟。随后在流动的去离子水中充分冲洗，并将其干燥。
注意：此步骤可降低真菌和细菌在琼脂糖上生长的可能性。 - 在去离子水中配制2%琼脂糖溶液并加热融化，随后立即使用1,000 μL移液器将500 μL熔融琼脂糖加入24孔板的每个孔中（图3A,B当琼脂糖开始冷却并堵塞移液器吸头时，重新加热琼脂糖并更换新的移液器吸头。
注意：避免移液器吸头接触孔壁，因为这可能会在孔壁上留下琼脂糖碎片，导致雌性果蝇在该处产卵，从而干扰成像和计数过程。 - 使用前，将孔板置于实验台面上过夜，使孔壁上的冷凝水干燥。图3C,D).....
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结果
通过显微注射将靶向候选铁转运蛋白（FeT）或对照基因（EGFP）的dsRNA注入蚊子体内，随后提供血液饲喂，并采用上述步骤所述的EAgaL板法测定其繁殖力和生育力输出。
注射dsRNA后FeT表达被沉默的蚊虫，其产卵数量和孵化率均显著降低（图11A−C）。所有对照组和处理组蚊虫在吸血后72小时被放置于EAgaL板中。FeT沉默的蚊虫还表现出排泄延迟，以及卵体积较小、颜色较浅（图12A，B）。相关示例结果亦见于Tsujimoto等人的研究8。
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讨论
EAgaL 平板极大地减少了进行个体繁殖力和生育力测定所需的人力、时间和空间 伊蚊 aegypti 与FT方法相比，FT方法与EAgaL板的初步比较结果显示，所有步骤的时间均更短（成像技术已应用于FT方法）表1）。作为参考，可估算启动和 每次检测（一块24孔EAgaL板对比24个FTs）的成本如下所示 表 2.
使用EAgaL板时需考虑几个要点。最初人们担心将蚊子置于如此狭小的空间内，可能因活动受限而无法产下全部卵。为了验证是否存在这种情况，在蚊子于EAgaL板中放置48小时后，将其集体转移到一个更大的笼子中，并提供一个内衬浸水滤纸的产卵杯，继续产卵48小时。结果表明，蚊子确实会继续产卵，但每只雌蚊平均仅额外产下2.1枚卵，这一数量在大多数（即使不是全部）情况下不会对任何统计分析结果产生显著影响。这些数据来自超过500只蚊子的测试（数据未显示）。然而，该结论可能仅适用于在所述条件下培养的埃及伊蚊（Ae. aegypti）“利物浦”品系。各个实验室可能需.......
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披露
作者声明本研究无任何利益冲突。
致谢
我们感谢德克萨斯A&M大学&感谢#38;M 农业生命研究昆虫传播疾病资助计划的经费支持。我们还感谢Adelman实验室成员在本方法开发及论文撰写过程中提供的帮助和建议，以及Kevin Myles实验室成员的支持。同时，我们感谢审稿人和编辑为提升本文质量所提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.6 mm Φ 钻头 | 也可使用加热的金属钉 | ||
| 1000 μL型移液器吸头（长） | 奥林巴斯塑料制品 | 24-165RL | |
| 24孔细胞培养板 | 赛默飞世尔科技 | 930186 | 透明平底带环形盖板 |
| 琼脂糖 | VWR | 0710-500G | |
| 紧凑型数码相机 | Olympus | TG-5/TG-6 | |
| 计算机（Windows、Mac 或 Linux） | |||
| 去离子水 | |||
| Fiji（ImageJ）软件 | 下载地址：https://fiji.sc/ | ||
| 镊子 | Dumont | 锐利的镊子可能会破坏蚊虫的躯体 | |
| 玻璃培养皿 | VWR | ||
| 家用漂白剂 | |||
| 家用电动钻孔机 | |||
| 体视显微镜照明灯（鹅颈管） | |||
| P-1000 移液器 | Gilson | ||
| 画笔 | |||
| 橡皮筋 | |||
| SD卡 | 使用数码相机拍摄图像（建议使用 DSHC、SDXC 格式） | ||
| 电子表格软件（Microsoft Excel） | 微软 | 任何电子表格软件均可使用 | |
| TetraMin 鱼饲料 | 四面体 | 使用咖啡研磨机、搅拌机或研钵研磨 &研钵和研杵 | |
| 移液管 | VWR | 16011-188 |
参考文献
- Bond, J. G., et al. Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program. PLoS One. 14 (2), 0212520(2019).
- Fernandes, K. M., et al. Aedes aegypti....
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