该技术旨在通过肺动脉灌注一种基于聚合物的射线不透性化合物，并结合肺组织膨胀，实现对出生后早期及成年小鼠肺动脉网络的离体可视化。本文还讨论了所制备血管铸型组织的潜在应用。
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本文内容
摘要
摘要
血管在三维空间中形成复杂的网络。因此，仅通过观察组织表面难以直观理解血管网络之间的相互作用与行为。该方法提供了一种可视化肺部复杂三维血管结构的手段。
为实现这一目标，将导管插入肺动脉，同时冲洗血管中的血液并进行化学扩张，以降低阻力。然后通过气管在标准压力下使肺膨胀，并以标准流速将聚合物化合物注入血管床。待整个动脉网络被填充并充分固化后，可直接观察肺血管结构，或在微型计算机断层扫描（µCT）设备上进行成像。
若操作成功，可清晰观察到从小鼠出生早期至成年期的肺动脉网络。此外，尽管本方法以肺动脉床为例进行演示，但通过优化导管放置位置和终点，该技术可应用于其他任何血管床。
引言
该技术的重点是利用基于聚合物的化合物在小鼠中可视化肺动脉结构。尽管针对脑、心脏和肾脏等全身血管床的研究已十分广泛1,2,3,4,5，但关于肺动脉网络的制备与灌注方法的信息仍较为有限。因此，本研究旨在拓展以往的研究工作6,7,8，并提供一份详细的图文参考，以便研究人员能够轻松遵循，从而获得高分辨率的肺动脉树图像。
尽管目前已存在多种用于标记和成像肺血管的方法，例如磁共振成像、超声心动图或CT血管造影9,10，但这些成像方式中的许多都无法充分灌注和/或清晰捕捉到微小血管，从而限制了可研究的范围。诸如连续切片与三维重建等方法虽能提供高分辨率图像，但耗时且劳动强度大11,
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方案
本文所述所有方法均已获得国家心肺血液研究所机构动物护理和使用委员会（ACUC）的批准。
1. 准备
- 按每克小鼠体重1单位的剂量，对小鼠进行腹腔注射肝素，并让其自由活动2分钟。
- 将动物置于CO2麻醉箱中实施安乐死。
- 将小鼠仰卧位固定于手术板上，用胶带固定四肢。精细解剖时使用放大设备。
2. 暴露肺和气管
- 用70%乙醇喷洒小鼠腹侧，以减少毛发干扰。
- 用镊子夹住腹部皮肤，在脐部区域用剪刀做一小切口。将剪刀尖滑入腹肌与皮肤之间的筋膜层，开始分离这两层组织。向头侧方向操作，将皮肤从腹部、肋笼和颈部逐步剥离。
- 用剪刀切开腹壁肌肉，并向两侧横向剪开，直至暴露膈肌。
- 轻轻夹住剑突并略微抬起肋笼，以通过薄而半透明的膈肌获得尾侧肺叶的最佳视野。在剑突正下方小心地于膈肌上做一小切口。肺将随之塌陷并从膈肌分离。将膈肌从肋笼上仔细解剖分离，注意避免损伤肺实质。
- 定位并切断下腔静脉（IVC）和食管穿过膈肌的部位。用纱布清理胸腔内积血，避免接触肺组织。
- 再次夹住剑突并轻轻抬起。在两侧沿腋中线附近剪开肋骨，避免接触肺组织。完全移除前部肋笼，最后沿胸骨角在胸骨柄前方做终末切割。
- 使用预装好的注射器，用磷酸盐缓冲液（....
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结果
成功的灌注应表现出整个肺动脉网络的均匀填充。我们在不同年龄的 C57Bl/6J 小鼠中展示了这一点：出生后第 90 天（图 4A）、第 30 天（图 4B）、第 7 天（图 4C）和第 1 天（图 4D）。通过控制灌注流速并实时肉眼监测填充过程，可稳定地达到最远端血管的灌注终点（图 5A）。
常见挑战包括肺部损伤、灌注不完全、灌注不足或过度灌注、导管嵌顿以及动物体型等因素。
如果肺/气道受损，微小的泄漏将导致肺无法维持压力（
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讨论
若操作得当，该方法可获得清晰的小鼠肺动脉网络图像，适用于在啮齿类动物模型中进行比较与实验研究。整个过程中有几个关键步骤对成功至关重要。首先，研究人员必须在准备阶段对动物进行肝素化处理，以防止血液在肺血管及心脏腔室内形成凝块，从而确保聚合物化合物能够完全通过动脉系统。其次，在穿刺膈肌并移除肋骨时，需注意保护肺组织，避免意外损伤、切割或创伤。呼吸道的任何泄漏都将导致肺无法充分膨胀，从而使样本间的比较失去准确性。第三，将心脏心尖部固定有助于导管的准确定位。第四，使用强效血管扩张剂（如硝普钠，SNP）有助于清除血液，并促进小动脉和毛细血管的完全充填5,8。第五，在将导管插入肺动脉干（PAT）时，应注意避免将导管尖端插入分叉处，否则会导致血流分布不均，使聚合物偏向左侧或右侧，产生不均衡的压力梯度。第六，使用注射泵可使操作者精确控制注射速率，并根据小鼠品系和年龄调整注射体积。最后，应将心脏和肺组织保留在胸腔其余结构中，固定过夜，次日再行取出。这样可确保肺组织充分固定，并最大限度减少分离过程中因意外划伤导致的塌陷风险。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
本研究部分得到了美国国家心肺血液研究所（NHLBI）院内研究计划（DIR HL-006247）的支持。我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）小鼠影像设施在图像采集与分析方面提供的指导。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1cc 注射器 | Becton Dickinson | 309659 | |
| 20ml 玻璃闪烁瓶 | Fisher | 03-340-25P | |
| 30G 针头 | Becton Dickinson | 305106 | |
| 50mL 锥形管 | Cornin | 352098 | 用于样品储存和扫描 |
| 60cc 注射器 | Becton Dickinson | 309653 | |
| 7-0 丝线缝合线 | Teleflex | 103-S | |
| Analyze 12.0 软件 | AnalyzeDirect Inc. | N/A | 主要软件 |
| Amira 6.7 软件 | Thermo Scientific | N/A | 替代软件 |
| CeramaCut 剪刀 9cm | Fine Science tools | 14958-09 | |
| 陶瓷涂层弯头镊子 | Fine Science tools | 11272-50 | |
| CO2 气罐 | Robert's Oxygen Co. | n/a | |
| 双通道注射泵 | Cole Parmer | EW-74900-10 | |
| Dumont 微型镊子 | Fine Science tools | 11200-14 | |
| 乙醇 | Pharmco | 111000200 | |
| 福尔马林 | Sigma - Life Sciences | HT501128 | |
| 纱布 | Covidien | 441215 | |
| 止血钳 | Fine Science tools | 13013-14 | |
| 肝素（1000USP 单位/ml） | Hospira | NDC 0409-2720-01 | |
| Horos 软件 | Horos Project | N/A | 替代软件 |
| 诱导室 | n/a | n/a | |
| Kimwipe 擦拭纸 | Fisher | 06-666 | 光纤清洁擦拭纸 |
| 标签胶带 | Fisher | 15966 | |
| 磁力底座 | Kanetec | N/A | |
| Micro-CT 系统 | PerkinElmer | Quantum GX | |
| Microfil（聚合物化合物） | Flowech Inc. | Kit B - MV-122 | 8 盎司 MV 化合物；8 盎司稀释剂；MV 固化剂 |
| 显微操作器 | Stoelting | 56131 | |
| Monoject 1/2 ml 胰岛素注射器 | Covidien | 1188528012 | |
| Octagon 直齿镊子 | Fine Science tools | 11042-08 | |
| Parafilm 封口膜 | Bemis company, Inc. | #PM999 | |
| PE-10 管路 | Instech | BTPE-10 | |
| 磷酸盐缓冲液 | BioRad | #161-0780 | |
| 铁架台 | Fisher | S13747 | 高度 24 英寸 |
| 硝普钠 | sigma | 71778-25G | |
| 钢板 | N/A | N/A | 16 x 16 英寸面积，厚 1/16 英寸 |
| 直头弹簧剪刀 | Fine Science tools | 15000-08 | |
| SURFLO 24G 聚四氟乙烯静脉导管 | Santa Cruz Biotechnology | 360103 | |
| 手术板 | Fisher | 12-587-20 | 由载玻片架改装而成 |
| 通用三爪夹 | Fisher | S24280 | |
| 带翼输液器 25X3/4，12" 管路 | Nipro | PR25G19 | |
| Zeiss Stemi-508 解剖显微镜 | Zeiss | n/a |
参考文献
- Vasquez, S. X., et al. Optimization of microCT imaging and blood vessel diameter quantitation of preclinical specimen vasculature with radiopaque polymer injection medium. PLoS One. 6 (4), 19099(2011).
- Hong, S. H., et al.
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重印与许可
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