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方法文章

成年及早期出生后小鼠肺组织的血管铸型用于显微CT成像

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DOI：

10.3791/61242

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2020年6月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Vascular Medicine Branch, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Mouse Imaging Facility, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 3Division of Pediatric Surgery, Department of Surgery, University of North Carolina at Chapel Hill

本文内容

摘要

该技术旨在通过肺动脉灌注一种基于聚合物的射线不透性化合物，并结合肺组织膨胀，实现对出生后早期及成年小鼠肺动脉网络的离体可视化。本文还讨论了所制备血管铸型组织的潜在应用。

摘要

血管在三维空间中形成复杂的网络。因此，仅通过观察组织表面难以直观理解血管网络之间的相互作用与行为。该方法提供了一种可视化肺部复杂三维血管结构的手段。

为实现这一目标，将导管插入肺动脉，同时冲洗血管中的血液并进行化学扩张，以降低阻力。然后通过气管在标准压力下使肺膨胀，并以标准流速将聚合物化合物注入血管床。待整个动脉网络被填充并充分固化后，可直接观察肺血管结构，或在微型计算机断层扫描（µCT）设备上进行成像。

若操作成功，可清晰观察到从小鼠出生早期至成年期的肺动脉网络。此外，尽管本方法以肺动脉床为例进行演示，但通过优化导管放置位置和终点，该技术可应用于其他任何血管床。

引言

该技术的重点是利用基于聚合物的化合物在小鼠中可视化肺动脉结构。尽管针对脑、心脏和肾脏等全身血管床的研究已十分广泛1,2,3,4,5，但关于肺动脉网络的制备与灌注方法的信息仍较为有限。因此，本研究旨在拓展以往的研究工作6,7,8，并提供一份详细的图文参考，以便研究人员能够轻松遵循，从而获得高分辨率的肺动脉树图像。

尽管目前已存在多种用于标记和成像肺血管的方法，例如磁共振成像、超声心动图或CT血管造影9,10，但这些成像方式中的许多都无法充分灌注和/或清晰捕捉到微小血管，从而限制了可研究的范围。诸如连续切片与三维重建等方法虽能提供高分辨率图像，但耗时且劳动强度大11,12,13。传统的腐蚀铸型技术会破坏周围软组织的完整性10,13,14,15,16。在尝试插入导管时，动物的年龄和体型也会成为影响因素，或导致分辨率不足。相比之下，聚合物注射技术可将动脉灌注至毛细血管水平，结合µCT成像后，可实现无与伦比的分辨率5。已有成功对出生后第14天小鼠肺组织进行铸型8并在数小时内完成处理的案例。这些样本可无限次重复扫描，甚至可用于组织学制备或电子显微镜（EM）分析，而不会破坏原有的软组织结构17。该方法的主要局限性在于CT设备和软件的前期成本较高、难以精确监测血管内压力，以及无法在同一动物体内进行纵向数据采集。

本文在已有研究基础上进一步优化了肺动脉注射技术，将适用的年龄/体型范围下推至出生后第1天（P1），取得了显著成果。该技术对希望研究动脉血管网络的研究团队尤为有用。因此，我们提供了导管放置与固定的新型指导方案，增强了对灌注速率和体积的控制，并指出了若干关键性技术陷阱，以提高血管铸型的成功率。所获得的血管铸型可进一步用于后续的表征与形态学分析。或许更为重要的是，据我们所知，这是首次以可视化方式完整演示并逐步指导用户完成这一复杂操作的技术流程。

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方案

本文所述所有方法均已获得国家心肺血液研究所机构动物护理和使用委员会（ACUC）的批准。

1. 准备

  1. 按每克小鼠体重1单位的剂量，对小鼠进行腹腔注射肝素，并让其自由活动2分钟。
  2. 将动物置于CO2麻醉箱中实施安乐死。
  3. 将小鼠仰卧位固定于手术板上，用胶带固定四肢。精细解剖时使用放大设备。

2. 暴露肺和气管

  1. 用70%乙醇喷洒小鼠腹侧，以减少毛发干扰。
  2. 用镊子夹住腹部皮肤，在脐部区域用剪刀做一小切口。将剪刀尖滑入腹肌与皮肤之间的筋膜层，开始分离这两层组织。向头侧方向操作，将皮肤从腹部、肋笼和颈部逐步剥离。
  3. 用剪刀切开腹壁肌肉，并向两侧横向剪开，直至暴露膈肌。
  4. 轻轻夹住剑突并略微抬起肋笼，以通过薄而半透明的膈肌获得尾侧肺叶的最佳视野。在剑突正下方小心地于膈肌上做一小切口。肺将随之塌陷并从膈肌分离。将膈肌从肋笼上仔细解剖分离，注意避免损伤肺实质。
  5. 定位并切断下腔静脉（IVC）和食管穿过膈肌的部位。用纱布清理胸腔内积血，避免接触肺组织。
  6. 再次夹住剑突并轻轻抬起。在两侧沿腋中线附近剪开肋骨，避免接触肺组织。完全移除前部肋笼，最后沿胸骨角在胸骨柄前方做终末切割。
  7. 使用预装好的注射器，用磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）充分润湿肺组织，防止干燥。在整个操作过程中持续重复此步骤。
  8. 用镊子夹住胸骨柄并轻轻抬离身体。用剪刀在胸骨柄外侧1-2 mm处剪断锁骨并移除，从而暴露其下方的胸腺。
  9. 夹住胸腺的每一叶，轻轻拉开并移除。随后以相同方式处理下颌下腺。最后，移除覆盖在气管表面的肌肉组织。
    注意：解剖完成后，心脏、升主动脉（AA）、肺动脉干（PAT）和气管应清晰可见。确保从主干发出的主要动脉分支未被切断或损伤。

3. 肺动脉导管插入术与血液灌注

  1. 组装单元1时，将一段15 cm的PE-10导管穿入30 G针头的针座，并连接至预先装有10-4 M PBS配制的硝普钠（SNP）的1 mL注射器。推动注射器活塞，排出该单元内所有空气，以完成导管的预充（图1）。
    警告：若吞食，硝普钠具有毒性。避免与皮肤和眼睛接触。操作后应彻底清洗皮肤。佩戴适当个人防护装备。
    1. 也可选择组装单元2。对于出生后第7天（P7）及更小的幼鼠，使用止血钳将另一根30 G针头从其针座上拆下，并将该针头穿至单元1导管的开放端（图1）。
  2. 不用针头，改用弯头锐利镊子夹住一段10 cm长的7-0丝线一端。从心脏一侧穿刺心尖部位，使镊子尖端穿过心肌并从另一侧穿出。用另一把镊子夹住丝线，将约2 cm长度拉出并打结固定。将剩余约8 cm的缝线末端向尾侧牵拉心脏，并将线头用胶带固定于手术板上。
    注意：此举可产生张力，进一步暴露大血管，并将心脏固定于原位，便于导管更顺利地插入肺动脉。
  3. 将弯头镊子的尖端钩住主动脉（AA）和肺动脉干（PAT）的根部。将一段3 cm长的7-0丝线从开口处向后拉出，打一个单结松缝线。
  4. 使用剪刀在靠近心尖处做1–2 mm切口，穿透右心室（RV）薄壁，以便插入导管（单元1）。插入前，确认系统内无残留空气。将已预充的导管插入右心室，并轻柔推进至半透明的薄壁肺动脉干（PAT）内。
    1. 目视确认导管未进入左或右肺动脉分支，且未抵住肺动脉分叉处。使用胶带将导管远端固定于手术板上。
      注意：识别右心室时，可用镊子夹捏心脏右侧。与左心室不同，右心室游离壁相对较薄，易于夹持。
    2. 对于小于P7的幼鼠，将单元2连接至显微操作仪，并通过操作仪将该单元的针头端按上述方法插入肺动脉干（PAT）。
  5. 轻柔收紧围绕两条大血管的松缝线，并剪除第3.2步中预留的8 cm缝线，使心脏恢复自然静息位置。此时导管已牢固固定于肺动脉干（PAT）内。
  6. 剪开左心耳，以允许灌注液从系统中流出。
  7. 将含SNP的注射器（单元1或单元2，根据尺寸选择）固定于注射泵上，以0.05 mL/min的速度灌注溶液，以冲洗血液并最大程度扩张血管系统。灌注液/血液将通过剪开的心耳流出。持续灌注直至流出液澄清（成年小鼠约需200 µL，幼龄动物用量更少）。
    注意：在灌注低黏度的PBS/SNP溶液时，为节省时间采用相对较高的输注速率。而黏度更高的聚合物溶液则需以较慢速率输注，以防止过度充盈、血管破裂，并更好地控制远端灌注终点。

4. 气管切开与肺部膨胀

  1. 构建肺膨胀装置（图2）。
    1. 将一根柔性的塑料24 G静脉（IV）导管（针头已移除）/蝶形输液套件连接至一个三通阀，并将该三通阀连接至一个打开的50 mL注射器（无活塞）。将注射器悬挂在铁架台上。
    2. 向注射器中加入10%缓冲福尔马林溶液。打开三通阀，使福尔马林流入导管，排出系统中的所有空气。关闭三通阀，并将注射器抬高，直至液面弯月面位于气管上方20 cm处8。
      警告：福尔马林具有可燃性，属于致癌物，经口摄入时具有急性毒性，可引起皮肤刺激、严重眼损伤、皮肤致敏以及生殖细胞致突变性。避免摄入及与皮肤和眼睛接触。避免吸入其蒸气或雾滴。远离点火源。穿戴适当个人防护装备。
  2. 在环状软骨下方放置两条相距2–4 mm的松缝线。
  3. 使用剪刀，在缝线上方的环甲膜处做一个小切口。
  4. 将静脉导管插入切口，并将导管尖端推进至超过两条松缝线的位置。
  5. 收紧环绕气管的缝线并打开三通阀。通过重力使福尔马林进入肺部，等待5分钟，使肺充分膨胀。若肺在膨胀过程中粘附于胸壁，可用钝头镊子夹住肋骨外侧，向各个方向移动，以帮助分离肺叶。切勿直接接触肺组织。
  6. 5分钟后，将静脉导管后撤至第一条缝线后方并结扎。对第二条缝线重复此操作。此时肺已处于封闭加压膨胀状态。

5. 血管铸型

  1.  在1.5 mL离心管中，配制1 mL的8:1:1聚合物-稀释剂-固化剂溶液8，轻轻颠倒混匀数次，确保充分混合。
  2. 从1 mL注射器中取出活塞，用戴手套的手指堵住另一端，将聚合物化合物倒入注射器中。小心地重新插入活塞，倒置注射器并推动活塞，以排出所有空气，并在注射器尖端形成弯月面。
  3. 将SNP/PBS注射器从针头连接座上取下，在连接座内滴加额外的PBS以形成弯月面。仔细检查连接座内是否有气泡滞留，必要时将其震出，并重新形成弯月面。将连接座与装有聚合物化合物的注射器连接。
    注意：在两端均形成弯月面可显著降低空气进入系统的可能性。
  4. 将装有聚合物化合物的注射器连接至注射泵，以0.02 mL/min的速度灌注。
    注意：对于较小的肺组织，较慢的流速有助于防止过度灌注，但并非必需。
  5. 观察化合物在PE导管中的流动情况，并在进入PAT时记录注射器内的体积。持续灌注直至所有肺叶完全填充至毛细血管水平，然后停止注射泵。再次检查注射器内的剩余体积。
    注意：经过多次操作后，可根据经验估算终点体积（成年小鼠约为35 μL，P1幼鼠约为5 μL）。停止泵送后，系统内残余压力仍会继续推动聚合物化合物进入肺动脉。所有肺叶应以相近的速度完成填充。
  6. 用光纤清洁布覆盖肺组织，大量加入PBS，并将尸体在室温下静置30–40分钟。在此期间，聚合物化合物将固化并变硬。
  7. 移除导管，剪除小鼠的前肢和下半身，将头部和胸腔部分放入盛有50 mL 10%缓冲福尔马林的锥形管中，固定过夜。
  8. 固定完成后，夹住气管，轻轻将心肺组织从残留的肋骨和胸腔中分离出来。将心肺组织块放入盛有福尔马林的闪烁计数瓶中。其余组织丢弃。

6. 用于灌注的替代血管床（表1）

注意：每个目标血管床可能需要不同的导管放置位置、灌注速率和最佳充盈时间。因此，需要使用多只动物来制备多个器官的铸型。

  1. 对于膈肌上方或下方的全身血管床，请按照上述步骤 1.1–2.5 操作。参见有关门脉系统和膈肌的附加说明（表 1）。
  2. 用止血钳夹住剑突，并在双侧肋骨（大致位于腋中线处）靠近胸廓内动脉前切断肋骨。
  3. 将仍相连的肋骨向上翻折，使其贴附于动物颈部或头部，充分暴露胸腔。
  4. 执行上述步骤 3.1，随后移除肺脏。当胸主动脉（TA）暴露后，将弯头镊子的尖端插入其下方，位置约在膈肌上方 10 mm 处。取一段 3 cm 长的 7-0 丝线，从 TA 下方穿入并拉出，打一个单结松缝线。在距膈肌约 8 mm 的上方重复此操作。
  5. 对于膈肌上方的结构，在 TA 的腹侧部分制造一个小孔（约占总周长的 30%），位置约在步骤 6.4 所置松缝线下方 2 mm 处。
    1. 对于膈肌下方的结构，则在松缝线上方约 2 mm 处制造小孔。
  6. 根据动物体型，将 Unit 1 或 Unit 2 插入血管，推进至越过松缝线位置，并轻柔地结扎血管。
  7. 执行步骤 3.7，将注射泵设置为 1.0 mL/min 的流速，灌注至少 5 mL 灌注液。灌注液将通过下腔静脉（IVC）流出。
  8. 执行步骤 5.1–5.4，调整输注速率为 0.05 mL/min，并实时肉眼观察目标组织。
    注意：输注体积因器官和动物年龄而异。可通过结扎通向非目标血管床（如脑、肝、肾、肠）的动脉分支进一步限制灌注体积。
  9. 执行步骤 5.6，随后取出目标组织并置于福尔马林中。

7. 微型计算机断层扫描的样本安装、扫描与重建

  1. 使用石蜡膜在扫描床上创建一个平整的表面，并将湿润的样本置于该表面中央（图3A）。
    注意：如果检测到运动伪影，样本可能需要进一步固定。
  2. 用额外的石蜡膜轻轻覆盖样本，以防止脱水。需特别注意不要让石蜡膜直接接触样本，以免造成组织变形（图3B）。
  3. 使用 表2 中列出的设置对样本进行扫描，并在同一次实验中保持这些参数一致。
    注意：具体设置取决于实验目的和终点指标。为便于样本间的比较，应统一所选参数。
  4. 将重建后的扫描数据转移至后续处理与分析。

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结果

成功的灌注应表现出整个肺动脉网络的均匀填充。我们在不同年龄的 C57Bl/6J 小鼠中展示了这一点：出生后第 90 天（图 4A）、第 30 天（图 4B）、第 7 天（图 4C）和第 1 天（图 4D）。通过控制灌注流速并实时肉眼监测填充过程，可稳定地达到最远端血管的灌注终点（图 5A）。

常见挑战包括肺部损伤、灌注不完全、灌注不足或过度灌注、导管嵌顿以及动物体型等因素。

如果肺/气道受损，微小的泄漏将导致肺无法维持压力（

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讨论

若操作得当，该方法可获得清晰的小鼠肺动脉网络图像，适用于在啮齿类动物模型中进行比较与实验研究。整个过程中有几个关键步骤对成功至关重要。首先，研究人员必须在准备阶段对动物进行肝素化处理，以防止血液在肺血管及心脏腔室内形成凝块，从而确保聚合物化合物能够完全通过动脉系统。其次，在穿刺膈肌并移除肋骨时，需注意保护肺组织，避免意外损伤、切割或创伤。呼吸道的任何泄漏都将导致肺无法充分膨胀，从而使样本间的比较失去准确性。第三，将心脏心尖部固定有助于导管的准确定位。第四，使用强效血管扩张剂（如硝普钠，SNP）有助于清除血液，并促进小动脉和毛细血管的完全充填5,8。第五，在将导管插入肺动脉干（PAT）时，应注意避免将导管尖端插入分叉处，否则会导致血流分布不均，使聚合物偏向左侧或右侧，产生不均衡的压力梯度。第六，使用注射泵可使操作者精确控制注射速率，并根据小鼠品系和年龄调整注射体积。最后，应将心脏和肺组织保留在胸腔其余结构中，固定过夜，次日再行取出。这样可确保肺组织充分固定，并最大限度减少分离过程中因意外划伤导致的塌陷风险。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

本研究部分得到了美国国家心肺血液研究所（NHLBI）院内研究计划（DIR HL-006247）的支持。我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）小鼠影像设施在图像采集与分析方面提供的指导。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1cc 注射器Becton Dickinson309659
20ml 玻璃闪烁瓶Fisher03-340-25P
30G 针头Becton Dickinson305106
50mL 锥形管Cornin352098用于样品储存和扫描
60cc 注射器Becton Dickinson309653
7-0 丝线缝合线Teleflex103-S
Analyze 12.0 软件AnalyzeDirect Inc.N/A主要软件
Amira 6.7 软件Thermo ScientificN/A替代软件
CeramaCut 剪刀 9cmFine Science tools14958-09
陶瓷涂层弯头镊子Fine Science tools11272-50
CO2 气罐Robert's Oxygen Co.n/a
双通道注射泵Cole ParmerEW-74900-10
Dumont 微型镊子Fine Science tools11200-14
乙醇Pharmco111000200
福尔马林Sigma - Life SciencesHT501128
纱布Covidien441215
止血钳Fine Science tools13013-14
肝素（1000USP 单位/ml）HospiraNDC 0409-2720-01
Horos 软件Horos ProjectN/A替代软件
诱导室n/an/a
Kimwipe 擦拭纸Fisher06-666光纤清洁擦拭纸
标签胶带Fisher15966
磁力底座KanetecN/A
Micro-CT 系统PerkinElmerQuantum GX
Microfil（聚合物化合物）Flowech Inc.Kit B - MV-1228 盎司 MV 化合物；8 盎司稀释剂；MV 固化剂
显微操作器Stoelting56131
Monoject 1/2 ml 胰岛素注射器Covidien1188528012
Octagon 直齿镊子Fine Science tools11042-08
Parafilm 封口膜Bemis company, Inc.#PM999
PE-10 管路InstechBTPE-10
磷酸盐缓冲液BioRad#161-0780
铁架台FisherS13747高度 24 英寸
硝普钠sigma71778-25G
钢板N/AN/A16 x 16 英寸面积，厚 1/16 英寸
直头弹簧剪刀Fine Science tools15000-08
SURFLO 24G 聚四氟乙烯静脉导管Santa Cruz Biotechnology360103
手术板Fisher12-587-20由载玻片架改装而成
通用三爪夹FisherS24280
带翼输液器 25X3/4，12" 管路NiproPR25G19
Zeiss Stemi-508 解剖显微镜Zeissn/a

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