一种用于研究伤口诱导多倍体化的 Drosophila 模型

摘要

伤口诱导的多倍体现象是一种保守的组织修复策略，细胞通过增大体积而非分裂来补偿细胞损失。本文详细介绍了如何利用果蝇作为模型，检测上皮伤口修复过程中多倍体化及其遗传调控的实验方案。

摘要

多倍体现象十分普遍，但其对生物体健康和疾病的影响仍知之甚少。当一个细胞所含染色体拷贝数超过二倍体水平时，即被定义为多倍体细胞，这通常由内复制或细胞融合所致。在组织修复过程中，创伤诱导的多倍体化（WIP）已被发现是从果蝇到脊椎动物中保守的愈合策略。与细胞增殖相比，WIP具有多种优势，包括对致癌性生长和基因毒性应激的抵抗能力。目前的研究难点在于明确多倍体细胞产生的原因及其独特功能。本文提供了一套详细的研究方案，用于分析成年果蝇上皮组织中的WIP过程，其中多倍体细胞在穿刺损伤后2天内即可形成。利用黑腹果蝇（D. melanogaster）丰富的遗传工具，已开始鉴定启动和调控WIP所必需的基因，包括Myc基因。通过该方法的进一步研究，有望揭示其他遗传和生理因素（如性别、饮食和年龄）如何调控并影响WIP的功能。

引言

黑腹果蝇 是研究上皮伤口修复细胞与分子机制的理想模型系统。与哺乳动物相似，其组织修复机制的使用取决于 在组织及其发育阶段上均存在差异。在果蝇胚胎中可发生无瘢痕伤口愈合，该过程中存在肌动蛋白-肌球蛋白 "purse string" 在上皮前沿形成，使伤口能够无缝闭合^1,2幼虫、蛹及成体果蝇的胚胎后伤口愈合会导致细胞外基质重塑、黑色素瘢痕形成以及上皮细胞生长^3,4,5,6上皮细胞通过细胞融合和内复制（一种跳过有丝分裂的不完整细胞周期）而增大体积^3,4,7,8因此，细胞损失通过多倍体细胞的生长而非细胞分裂来补偿。果蝇成体的后肠、中肠以及滤泡上皮也依赖多倍体细胞的生长来弥补组织损伤后的细胞丢失。^9,10,11.

多倍性是植物和昆虫生物体发育中一个众所周知的特征，但在过去几年中，人们越来越清楚地认识到，多倍性是一种在脊椎动物中保守的组织修复策略¹²。具有心脏再生能力的斑马鱼依赖多倍体细胞的生长来修复受损的外膜¹³。多倍性还参与哺乳动物肝脏的再生以及急性损伤后肾小管上皮的修复^14,15。在这些例子中，多倍体细胞通过内复制（endoreplication）过程产生，该过程包括内复制周期（endocycle）或内有丝分裂（endomitosis），由于胞质分裂受阻而形成双核细胞¹²。令人困惑的是，为何在伤口修复过程中会出现多倍体细胞，以及多倍性如何影响组织功能。最近的研究为“多倍性在修复中是否具有优势或劣势”这一问题提供了新的见解。在斑马鱼外膜中，多倍性加快了伤口愈合速度¹³。在黑腹果蝇（D. melanogaster）后肠和哺乳动物肝脏中，多倍性被发现可防止致癌性生长^11,14。在成年果蝇上皮中，最近发现多倍性能够在基因毒性应激存在的情况下实现伤口修复¹⁶。内复制对DNA损伤具有抗性，使得在细胞增殖本会受阻的情况下仍能进行伤口愈合¹⁷。然而，在小鼠和斑马鱼心肌细胞中，多倍性会减缓愈合过程，导致瘢痕形成增强^18,19。因此，根据器官和/或细胞类型的差异，多倍性可能是一种有益的或有害的组织修复策略。黑腹果蝇（D. melanogaster）遗传系统的可操作性，结合对损伤诱导多倍化（WIP）反应的分析，使其成为阐明指导这一伤口愈合策略的分子与细胞机制的理想模型系统。

本文介绍了一种用于分析成年D. melanogaster上皮组织中伤口诱导性多倍化（WIP）的实验方案。内容包括果蝇损伤处理、解剖、免疫染色、封片、成像以及再上皮化、细胞融合和内复制（倍性）分析的操作步骤。该成像与倍性分析方法也可适用于其他模型系统，以检测WIP是否发生。需要注意的是，核DNA含量的增加通常伴随着核体积的增大；然而，在生物学中存在大量核体积变化并不反映倍性相应改变的实例²⁰。在伤口微环境中解释核体积变化时需更加谨慎，因为细胞常会铺展或拉伸以覆盖伤口区域。因此，确认倍性变化的唯一确凿证据是通过本方法（或其他方法，如全基因组测序）直接测定DNA含量²¹。该方法增强了成年D. melanogaster腹部上皮作为研究多倍化在伤口修复中作用及其调控机制模型的适用性。

方案

1. 成虫果蝇的分期与创伤处理

1. 选择所需的黑腹果蝇（D. melanogaster）品系（例如 epi-Gal4/UAS 品系，参见材料表）。
   注意：本研究使用 Gal4/UAS 系统以实现上皮特异性基因表达（epi-Gal4），即在 UAS 下游编码的基因或 RNAi 的特异性表达。本实验采用荧光膜蛋白（UAS-Cd8.mRFP）、有丝分裂诱导因子（UAS-fzr^RNAi、UAS-stg）以及 WIP 抑制剂（UAS-E2F1^RNAi；UAS-Rac^DN）。
2. 分别收集两瓶新羽化的雌性果蝇，每瓶 10–15 只，并在 25 °C 下于新鲜培养基中饲养至 3–5 日龄。其中一瓶作为未受伤对照组，另一瓶将按以下方法进行创伤处理。雌蝇应与雄蝇共同饲养（约 5 只/瓶）。
3. 为创伤果蝇，准备多个针持器，每个持针器安装一根直径为 0.10 mm 的不锈钢针。确保针的尖端朝外。针在穿刺果蝇后容易弯曲或崩裂，钩状或受损的针应丢弃。
4. 在体视显微镜下，将老化后的雌性果蝇置于 CO₂ 麻醉垫上进行麻醉，并用画笔将其排列成行。佩戴护目镜，一手持针持器，另一手持镊子，用镊子固定一只果蝇，使其腹面朝上。
5. 在腹侧中线腹骨片两侧的第 A4 节背板上皮褶区域穿刺成年雌性果蝇（图 1A）。穿刺该腹侧区域可为后续解剖位点提供充足空间，避免机械处理时组织边缘被撕裂。
6. 将创伤后的果蝇放回培养瓶中，并培养至所需的伤后天数（dpi）。上皮伤口愈合始于伤后第 1 天，至第 3 天结束。内复制在伤后第 2 天达到高峰，此阶段最适合进行 EdU 检测（第 4 节，图 2）。

2. 果蝇腹部解剖

注意：在此步骤中，必须避免使用解剖工具触碰腹部腹侧组织，以免破坏上皮的完整性。

1. 准备解剖所需全部材料：Grace 溶液、镊子、Vanna 弹簧剪、0.10 mm 固定针、解剖板、9 孔玻璃解剖皿、固定液（含 4% 多聚甲醛的 1× PBS）、1× PBS、擦拭纸、30 µm 移液器及吸头，以及手套（参见材料表）。
2. 在体视显微镜下，将受伤果蝇置于 CO₂ 麻醉垫上进行麻醉，检查其腹部是否存在伤口瘢痕（即黑色素斑点，见图 1B），以确认果蝇是否成功受伤。将未成功受伤的果蝇从实验组中剔除。
3. 开始解剖时，向 9 孔玻璃解剖皿中的一个孔加入 Grace 溶液。用镊子夹住受伤雌蝇的胸部背侧，将其浸入盛有 Grace 溶液的孔中。
4. 用另一只手持镊子，在不松开胸部的前提下，刺穿第 6 腹节（A6）背板下方的背表皮，并将果蝇后端的表皮剥离。此时内脏器官（卵巢和肠道）通常会随之脱出；若未完全脱出，可用镊子轻轻挤压腹部背侧，将剩余器官挤出并弃入空孔中。
5. 用镊子在第 2 腹节（A2）背板上方的胸腹连接处折断整个腹部，并将腹部转移至含有约 100 µL Grace 溶液的空孔中。
6. 重复步骤 2.3–2.5，直至完成所有果蝇腹部的解剖。
7. 将汇集了所有解剖后腹部的孔中 Grace 溶液的体积减少至 30 µL。
8. 一只手用镊子固定腹部背侧，另一只手将 Vanna 弹簧剪的下刃插入腹腔，沿背中线剪开腹部，将其剖成开放式片状结构。完全展开腹部可能需要最多三次剪切（图 1C, 1D）。
9. 在干燥的解剖板上设置每个腹部固定区域，每区域使用四根 0.10 mm 固定针。每块 35 mm 解剖板最多可容纳七个固定区域。在每个固定区域滴加 30 µL Grace 溶液，并将一个剖开的腹部转移至每滴溶液中。
10. 用固定针将剖开的腹部固定在解剖皿的四个背角位置（图 1E）。确保组织平整贴附，避免撕裂或过度拉伸腹部组织。
11. 用移液器吸除 Grace 溶液，向已固定的腹部加入 30 µL 固定液以固定组织。
    注意：操作固定液时需佩戴手套，因多聚甲醛具有毒性。
12. 重复步骤 2.10–2.11，直至所有剖开的腹部均被固定于解剖板上。
13. 在每个解剖板底部贴上标签胶带，标记对照组和实验组。在室温（RT）下固定样品 30–60 分钟。
14. 向每块解剖板加入 1.5 mL 1× PBS，洗去固定液。根据机构规定，将固定液及塑料废弃物分别弃置于适当的液体或干性化学废料容器中。
15. 用 1.5 mL 1× PBS 洗涤解剖板两次，然后将固定后的组织置于含 1.5 mL 1× PBS 的带盖塑料容器中保存。在容器底部放置一层湿润的纸巾，并将样品于 4 °C 保存，待解剖后一周内进行免疫染色。

3. 免疫荧光

1. 新鲜配制试剂（参见材料表）：洗涤缓冲液（含0.3% Triton X-100和0.3% BSA的1x PBS溶液）。剩余的洗涤缓冲液可保存在4 °C，用于整个为期两天的染色流程。根据每次实验需要，用洗液配制足够量的一抗溶液（图2），其中包含Anti-FasIII（1:50的小鼠抗Fasciclin-III抗体）以及anti-Grh（1:300的亲和纯化兔抗Grainyhead⁸抗体）或anti-RFP（1:1,000的兔抗RFP抗体）。一抗溶液可在4 °C保存，并可重复使用多次，直至信号明显减弱。
2. 通过移液去除1x PBS，加入1.5 mL洗涤缓冲液，在室温下于旋转摇床（80 rpm）上孵育至少30分钟，以通透组织。
3. 去除洗涤缓冲液，加入1.5 mL一抗溶液，在4 °C下于旋转摇床上过夜孵育。收集使用过的一抗溶液，保存于4 °C的离心管中，供后续实验重复使用。
4. 首先用1x PBS快速漂洗样品，然后用1.5 mL洗涤缓冲液洗涤3次。每次洗涤均需在室温下于旋转摇床上孵育至少30分钟。
5. 在最后一次洗涤过程中，配制二抗溶液：将1:1,000的驴抗兔Alexa 488或568抗体和1:1,000的山羊抗小鼠Alexa 488或568抗体（或其他选择的荧光染料）溶于洗涤缓冲液中。
6. 去除洗涤缓冲液，加入1.5 mL二抗溶液对组织进行染色。用铝箔包裹样品，在室温下于旋转摇床上孵育3小时；也可选择在4 °C下于旋转摇床上过夜孵育。
7. 去除二抗溶液后，先用1x PBS快速漂洗样品，再用1.5 mL洗涤缓冲液洗涤3次。每次洗涤均需在室温下于旋转摇床上孵育至少30分钟。
8. 将DAPI用洗涤缓冲液稀释至10 µg/mL，配制成DAPI溶液。最后一次洗涤后，加入1.5 mL DAPI溶液，在室温下孵育30分钟进行染色。
9. 弃去DAPI溶液，用1.5 mL 1x PBS漂洗样品2次。将染色后的组织置于1.5 mL 1x PBS中，避光并用铝箔包裹，于4 °C保存，待后续在载玻片上加盖盖玻片进行封片。封片步骤应在一周内完成。

4. 细胞周期活性（EdU 检测）

1. 使用 Click-iT 试剂盒（见材料表）中的 EdU 粉末，将其溶解于 dH₂O 中，混匀约 15 分钟至完全溶解，配制成 10 mM 的 EdU 储存液。该储存液可分装（每管 250 µL），并于 -80 °C 保存。
2. 通过将 EdU 储存液用 dH₂O 稀释至 5 mM 来喂食果蝇。加入干酵母直至溶液呈浑浊状，并短暂涡旋混匀。剪下 0.5 mL 离心管的管盖，将其置于果蝇食物瓶底部，并将管盖压入食物中以保持稳定。
3. 麻醉果蝇，并将 3–5 日龄的果蝇转移至该培养瓶中。轻敲瓶子使果蝇聚集到一侧，确保没有果蝇卡在管盖内。
4. 用移液器向管盖中加入 75 µL 酵母-EdU 溶液。应每天为果蝇提供新鲜的酵母-EdU 溶液，并每隔一天将果蝇转移至装有新管盖的新鲜食物瓶中，以防止果蝇陷入瓶底。
5. 转移果蝇时，将果蝇翻入带有管盖的新培养瓶中，使其麻醉，轻敲使果蝇集中于一侧，然后加入新鲜的酵母-EdU 溶液。
6. 在第三天对果蝇进行损伤处理，并继续喂食酵母-EdU 溶液，直至 2 dpi（损伤后第 2 天）进行解剖（图 4A）。解剖与固定方法详见第 2 节实验方案。
7. 准备 EdU 染色试剂：洗涤缓冲液（含 0.3% Triton X-100 和 0.3% BSA 的 1×PBS）、通透缓冲液（含 0.5% Triton X-100 的 1×PBS）、封闭缓冲液（含 3% BSA 的 1×PBS），并根据制造商说明配制 EdU 检测试剂盒中的试剂（见材料表），包括 1×反应缓冲液和 1×反应缓冲液添加剂。
8. 在 1.5 mL 洗涤缓冲液中室温混合孵育样本 1 小时。
9. 加入 1.5 mL 通透缓冲液，孵育样本 20 分钟。
   注意：按每孔 500 µL 的用量解冻并配制反应混合液。
10. 用 1×PBS 快速洗涤样本 1 次，再用 1 mL 封闭缓冲液快速洗涤 3 次。
11. 吸除所有残留的封闭缓冲液，每孔加入 500 µL 反应混合液。轻轻摇动培养板，确保组织完全被覆盖。在室温避光条件下于抽屉中孵育 1 小时。
12. 用 1.5 mL 封闭缓冲液快速洗涤样本 1 次。
13. 用 1.5 mL DAPI 溶液（以洗涤缓冲液按 1:5,000 稀释）染色 30 分钟。
14. 用 1×PBS 快速洗涤 2 次，用铝箔包裹，于 4 °C 避光保存，3 天内完成封片。

5. 封片染色组织

1. 准备所有封片所需的材料：载玻片、盖玻片、透明指甲油、封片剂、镊子和擦拭纸。
2. 封片染色后的果蝇组织时，在体视显微镜下用镊子将腹部从解剖板上取下。用镊子轻轻夹住组织的背侧边缘，将其转移至盖玻片上约30 µL的封片剂中，注意避免镊子接触腹面区域。
3. 在体视显微镜下调整腹部组织的方向，使组织内面朝下贴向盖玻片（即外部角质层/刚毛朝上）。用镊子将已定向的腹部移至封片剂液滴边缘。表面张力有助于保持组织平整（图1F）。
   注意：此步骤中将腹部排列成列或行，有利于后续成像。
4. 标记载玻片（如对照组或实验组），然后缓慢将载玻片靠近盖玻片并轻轻拾起盖玻片。将载玻片翻转，用擦拭纸轻轻吸去多余的封片剂。
5. 用透明指甲油密封盖玻片边缘，并对所有其余实验组重复此操作。将载玻片置于载玻片盒中，于4 °C保存，直至准备成像。

6. 成像与处理

1. 使用共聚焦显微镜（图1B），通过40倍油镜或干镜（点扫描仪或结构化照明系统，如ApoTome）首先定位果蝇腹部伤口区域的黑色素疤痕，进行成像。
2. 检查每个通道的曝光情况，确保信号未达到饱和。成像参数应基于最亮的样本组进行设置。这对于倍性分析尤为重要，因为DAPI通道必须保持在线性范围内，以准确测量DNA含量。
3. 在三个通道中均采集完整的z轴层扫图像，切片间最优距离至少为0.50 µm。保存采集的图像，并在图像分析软件Fiji（即ImageJ）中打开文件。
4. 对每幅图像，使用“最大投影”中的“切片求和”选项，为所有通道生成z轴投影图像。
5. 根据需要旋转图像，确保各图像中的细胞核呈水平排列（图3A 和 图4E）。
6. 将所有图像裁剪为以伤口部位或未受伤对照中心为中心的300 µm × 300 µm矩形区域。通过绘制矩形并选择编辑 | 选区 | 指定来确定该区域。确认标度单位为微米，以保证所有待分析图像使用相同尺寸的裁剪框。

7. 内复制（倍性）分析

1. 使用 Fiji，选择 Grh 通道窗口 并复制该图像。然后使用 阈值工具 创建掩膜。通过滑动顶部滑块手动调整阈值，以尽量减少背景信号，同时避免细胞核显著缩小（图 4D）。
2. 如果在 Grh 通道的阈值图像中存在相互接触的细胞核，请使用 画笔工具（2 像素宽度），以与背景相同颜色在细胞核之间绘制分隔线。完成后单击应用 1 次，以生成最终掩膜。
3. 使用 分析粒子 功能生成感兴趣区域（ROI）图：将大小设置为 5 µm–60 µm，以捕获大多数细胞核，同时排除背景。
4. 根据需要在 ROI 管理器 中手动调整 ROI 图。删除所有非细胞核的选区，并使用自由手绘选择工具圈出未被识别的细胞核，将其添加至 ROI 管理器 中（图 4D）。
5. 选择 DAPI 通道，然后在 ROI 管理器 中点击 显示全部，将 Grh 通道生成的 ROI 图应用到 DAPI 通道上。
6. 从 ROI 图中删除上皮细胞核轮廓与非上皮细胞核（例如肌肉或脂肪细胞的细胞核）重叠的选区。Grainyhead 仅标记上皮细胞核，而 DAPI 可标记所有细胞核。检查每个圈出的选区是否仅包含一个细胞核，并删除或编辑包含多个细胞核的选区。保存编辑后的 ROI 列表。
7. 使用 Fiji 中的分析工具，测量 ROI 图中每个上皮细胞核的面积和积分密度。将数值导出至电子表格程序。
8. 使用圆形选区工具测量平均图像背景。在 DAPI 图像的不同区域绘制三个不与任何细胞核重叠的圆圈。将每个圆圈的面积和积分密度添加至电子表格程序，以确定背景图像亮度。
9. 首先通过将每个背景积分密度值除以其对应的面积，计算每幅图像单位面积的平均背景值。然后对图像中三个单位面积积分密度测量值取平均，得到单位面积的平均背景值。
10. 接下来，将每个 DAPI 细胞核的面积乘以单位面积的平均背景值，计算每个细胞核的总背景值。然后通过从每个细胞核测得的积分密度中减去其总背景值，计算每个细胞核的归一化 DAPI 强度。
11. 对未损伤上皮对照组中所有归一化 DAPI 强度值取平均。先前已确定未损伤上皮细胞核的倍性值为 2C，可作为计算实验条件下上皮细胞核倍性的参考标准⁸。
12. 通过将每个细胞核的归一化 DAPI 强度除以参考未损伤上皮对照组的归一化值（2C），再将结果乘以 2，计算每个细胞核的倍性（即归一化倍性，C 值）：
    （细胞核积分密度 - 背景校正后细胞核积分密度）/ 平均细胞核积分密度（未损伤上皮细胞核 = 2C） × 2 = 上皮细胞核倍性（C）
13. 根据倍性值将细胞核绘制成点图、直方图，或分组为柱状图（例如：2C [0.6–2.9C]、4C [3.0–5.9C]、8C [6.0–12.9C]、16C [13.0–24.9C] 和 >32C [>25.0C]）（图 3F）。

结果

本文提供了一种详细的实验方案，利用D. melanogaster作为研究伤口诱导多倍化（WIP）的模型。该伤口愈合模型相较于哺乳动物及其他果蝇WIP模型具有诸多优势。通过昆虫针进行机械穿刺可轻松诱导多倍化，且多倍体细胞可在较短时间内生成（2–3 dpi）（图1A, 1B）⁴。主要挑战在于完整解剖腹部组织的同时不干扰上皮结构。由于D. melanogaster的上皮组织极易被锋利的解剖工具意外触碰或划伤，因此在正式实验与分析前，应预先练习本方案中的各项操作步骤。

首先，损伤局限于雌性腹部腹侧，该区域具有较大、平坦且不透明的组织，非常适合成像。穿刺伤口位于腹侧中线腹板两侧的侧膜上皮，靶向胸节（T）T4-T5节段之间（图1A-C）。这种伤口位置提供了较大的可视区域，且不会受到解剖操作的干扰。具有挑战性的步骤包括腹部弹簧剪开和固定步骤（图1D, 1E）。在进行弹簧剪切时，将腹部置于较小体积的Grace's溶液（约30 µL）中剪开效果最佳，以减少组织移动。必须沿背侧中线进行居中剪切，以便在腹部背瓣上留出足够面积，从而能够将其展开并固定在解剖板上（图1C）。应轻轻将腹部四角固定，避免施加过大的力量（图1E）。若固定时用力过猛，会导致腹部组织变形，甚至将组织压入解剖板中。一旦发生这种情况，组织必须弃用。腹部组织固定后，需一直保留在解剖板上，直至完成免疫荧光染色，并将腹部转移至玻璃盖玻片上用于成像（图1F）。

伤口愈合需要形成连续的上皮层，这一过程依赖于内复制和细胞融合^4,16。标记细胞间连接的隔状连接蛋白FasIII可作为指标，用于判断样品制备过程中是否发生了处理干扰（图1G, 1H）。若腹部存在较大划痕（未染色区域）并干扰了伤口区域，则必须弃用，不得用于后续分析（图1H）。

下一步是分析完整样品中是否存在WIP缺陷。该方案包括不同的检测方法，用于检测WIP反应的不同方面（图2）。当一个位于中央的大型多核细胞覆盖伤口痂皮时，表明伤口修复已完成（图3A）。此处通过FasIII/Grh染色，并定量FasIII轮廓区域内包含的Grh⁺上皮细胞核数量来检测细胞融合⁴。当观察到上皮层中存在>10 µm的间隙时，即可判定为伤口闭合或再上皮化存在缺陷（图3B，红色箭头）。例如，在通过表达stg, fzr^RNAi激活有丝分裂周期从而抑制WIP的情况下即出现此类缺陷，这在近期已有报道¹⁶。在这种遗传条件下，52%的伤口无法在伤口痂皮上形成连续的上皮层（图3B, 3C）。

在此模型中，另一种测量伤口修复的方法是通过 epi-Gal4 驱动 UAS-mCD8-ChRFP 的表达来可视化上皮膜⁴（图2，图3D）。在对照组中，91% 的上皮伤口在 3 dpi 时完全闭合；但如先前报道，通过同时抑制内复制（E2f1^RNAi）和细胞融合（RacDN）来阻断 WIP，会导致 92% 的上皮伤口完全无法闭合（图3D, 3E）^8,16。通过表达 stg, fzr^RNAi 激活有丝分裂细胞周期，同样导致上皮伤口闭合缺陷。然而，通过观察上皮细胞膜，可以确定再上皮化缺陷的程度。WIP 突变体（E2f1^RNAi, RacDN）果蝇的伤口比 stg, fzr^RNAi 伤口更为开放（图3D，红色虚线轮廓）¹⁶。该膜伤口愈合检测方法可提供更多关于伤口修复缺陷程度的信息。因此，再上皮化缺陷可被分为完全开放、部分闭合（即>10 µm 间隙）或完全闭合三类（图3D, 3E）。

除了细胞融合外，上皮细胞还通过内复制（endoreplication）增大体积，这是一种不完整的细胞周期，可使细胞核DNA含量加倍。通过细胞周期活性检测和直接的细胞核DNA倍性测定两种方法对内复制进行了分析（图2 和 图4）。此处，通过掺入胸苷类似物EdU来检测细胞周期活性（图4A，4B）。研究发现，D. melanogaster 的上皮细胞进入内复制周期（endocycle），即一种在S期和G期间交替但不经历M期的不完整细胞周期^4,12。在损伤前，成年 D. melanogaster 的饮食中添加了含EdU⁺的食物，并在损伤后持续喂食EdU⁺饮食直至损伤后2天（2 dpi）进行解剖（图4A）。随后采用厂商提供的Click-iT试剂盒检测EdU的掺入情况。该EdU检测方法用于确定在伤口刺激下，哪些部位、何时以及有多少细胞核被诱导进入S期。利用Gal4/UAS系统，近期研究发现，上皮细胞特异性表达 myc 基因可抑制（myc^RNAi）或增强（Myc过表达）上皮细胞进入S期的能力。因此，已有研究表明，Myc足以诱导终末分化细胞发生内复制，即使在无损伤的情况下亦可实现^16,22。

接下来，通过直接测量细胞核DNA含量来确定上皮细胞的倍性。利用上皮特异性标记物Grh的免疫荧光染色鉴定上皮细胞核（图4D）。在Fiji成像软件中，系统性地识别上皮细胞核，并利用Grh核染色进行阈值设定。随后将细胞核分离，并将感兴趣区域（ROI）叠加至DAPI图像堆栈的投影图上（图4D，绿色箭头）。在测量所选细胞核的积分密度之前，手动删除任何重叠的细胞核（图4D，红色箭头）。这种半自动化方法可定量分析未受伤及修复后果蝇腹部上皮中大多数细胞核的分布与倍性⁸。如近期报道所示，在伤后3天（3 dpi），伤口周围上皮细胞核中44%为多倍体细胞核，其DNA含量超过3C（图4E, 4F）¹⁶。与EdU实验结果一致，敲低myc显著抑制了内复制过程，仅有9%的上皮细胞核表现为多倍体；而过表达Myc则导致伤口周围100%的上皮细胞核均为多倍体（图4F）¹⁶。上皮细胞核的大小也明显受到myc表达的影响，表现为细胞核缩小或增大。然而，细胞核面积并不能准确反映倍性及生理效应，因为细胞拉伸等因素也可影响细胞核大小，而并不改变细胞核DNA含量²⁰。

图1：成年果蝇腹部损伤、解剖及组织封片。（A）成年果蝇腹部损伤实验示意图。应在腹部第四背板（T4）的任一侧对果蝇进行损伤。（B）受伤后第3天的成年雌性果蝇，可见由伤口愈合形成的黑色素痂（白色框）。比例尺 = 50 µm。（C）解剖后的成年果蝇腹部，背侧视图，背板已标注。沿背侧中线将腹部纵向剖开（白色虚线）。比例尺 = 50 µm。（D）解剖并剖开后的成年果蝇腹部，准备固定前状态。比例尺 = 50 µm。（E）固定在解剖板上的成年果蝇腹部。在腹部背侧的四个角各插入一枚图钉。组织被轻轻展开但未拉伸，以避免撕裂。（F）将腹部组织封片后置于玻璃盖玻片上，使腹腔内面朝下接触盖玻片，而外表皮面向载玻片。（G）完整伤口区域的FasIII染色图像，未受处理干扰，可见中央合胞体（黄色虚线）。比例尺 = 50 µm。（H）刮擦伤口区域（*）图像，显示FasIII未染色区域，破坏了合胞体结构。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：WIP分析工作流程。 该流程图展示了本研究中描述的三种检测方法，以及用于检测和测量WIP反应的共用和特有步骤。EdU检测用于测量细胞周期活性（蓝色框），通过Grh/FasIII免疫染色检测倍性及再上皮化（绿色框），膜定位RFP的表达可用于测量上皮伤口闭合程度（粉色框）。共用步骤以灰色框表示，D. melanogaster 品系的基因型列于上方。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：检测WIP期间再上皮化的方法。 当WIP被基因抑制时，再上皮化过程受到干扰。对照组（A）和stg, fzr^RNAi（B）在3 dpi时的免疫荧光图像。上皮细胞核和紧密连接分别用Grh（绿色）和FasIII（品红色）染色。（A' 和 B'）单独的FasIII染色显示，stg, fzr^RNAi上皮中的再上皮化受损（红色箭头）。比例尺 = 50 µm。（C）在3 dpi时再上皮化缺陷（%）的定量分析（灰色）：对照组（n = 8），stg, fzr^RNAi（n = 6）。误差线表示标准误差；统计学显著性通过Student's T检验测定，**P < 0.01。伤口修复过程中的再上皮化也可通过epi-Gal4, UAS-mCD8-RFP驱动膜定位RFP的表达来检测。（D）对照组、E2F1^RNAi, RacDN和stg, fzr^RNAi在3 dpi时的免疫荧光图像。比例尺 = 20 µm。伤口痂皮（黄色轮廓）和开放的上皮伤口区域（红色轮廓）。（E）对照组（n = 11）、E2F1^RNAi, RacDN（n = 13）和stg, fzr^RNAi（n = 13）的伤口闭合定量分析。改编自Grendler等¹⁶。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：在WIP过程中检测内复制的方法。（A）EdU检测时间线：成年Drosophila在损伤前每2天饲喂75 µL的5 mM酵母-EdU，并持续至损伤后2天（2 dpi）。（B）在2 dpi时，利用epi-Gal4/UAS系统在果蝇品系中表达的EdU免疫荧光图像。伤口痂皮（W）。比例尺 = 50 µm。（C）在2 dpi时每只果蝇中EdU+上皮细胞核的平均数量：对照组（ctrl，n = 37）、myc^RNAi#1（n = 10）和Myc（n = 8）。误差线表示标准误；统计学显著性通过Student's T检验测定，*P < 0.05，**P < 0.01。（D）上皮细胞核倍性的检测与测量示意图。在Fiji软件中通过抗Grh染色识别并设定上皮细胞核的阈值。重叠的上皮细胞核被分离（绿色箭头）或移除（红色箭头），若其被非上皮细胞核覆盖。测量相应DAPI染色细胞核图像的积分密度和核面积。（E）在3 dpi时，上皮细胞核大小（Grh）因myc的表达而改变。（F）在3 dpi时上皮细胞核倍性（%）：对照组（ctrl，n = 4）、myc^RNAi#1（n = 6）和Myc（n = 3）。改编自Grendler等¹⁶。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍了一种详细的方案，用于解剖和利用成年D. melanogaster腹部上皮组织，以研究基因如何通过改变伤口修复过程中的再上皮化和内复制来调控伤口诱导的多倍化（WIP）¹⁶。利用该方法，近期发现原癌基因Myc是WIP的关键调控因子。Myc在上皮细胞损伤后进行内复制过程中是必需的，并且足以促使静息状态的上皮细胞在成年果蝇上皮组织和附属腺体中进入内复制周期^16,22。研究还发现，通过表达stg, fzr^RNAi将上皮细胞转换为有丝分裂细胞周期会对伤口修复产生不利影响。未来继续利用该方法开展的研究将鉴定出更多调控WIP过程中再上皮化和内复制所需的基因，揭示多倍化在多种组织中调控机制与功能上的共性与差异。

该模型和方法具有独特的优点，包括可通过机械穿刺轻松诱导多倍体，且多倍体细胞可在数天内形成⁴。组织解剖与制备方案基于幼虫解剖技术²³，但成年果蝇腹部更为坚硬，因此更容易受到干扰。因此，本方案需要经过练习和精确操作，才能分离出完整的组织用于研究伤口诱导的多核现象（WIP）。然而，一旦完成解剖，上皮组织便清晰可见，易于成像，可获得伤口愈合过程的瞬时图像。该方法可提供大量关于成年果蝇上皮组织结构、细胞与合胞体大小以及细胞和单个细胞核倍性的信息。尽管由于果蝇体壁不透明，目前尚无法在完整个体中进行活体成像，但本方案可结合现有的黑腹果蝇（D. melanogaster）离体培养条件，用于开展短期的活体成像研究²⁴。

未来，该模型将非常适合利用Gal4/UAS系统在其他感兴趣的细胞类型中调控基因表达，以研究细胞间的串扰以及其他细胞类型对WIP的贡献。通过多种遗传背景和突变体背景，也可回答类似的问题。解剖得到的成年果蝇腹部包含多种可通过本方法轻松观察的细胞类型，包括脂肪体和oenocytes、侧向肌纤维、感觉神经元、气管以及类巨噬细胞的血细胞。此外，该模型将使研究人员能够探究各种生理变量（如性别、饮食、感染、年龄和环境应激因素）如何影响WIP。尽管本实验方案采用成年雌性果蝇（因其体型较大），但WIP在雄性果蝇中同样存在（Gjelsvik和Losick，未发表）。多倍体细胞已被发现在哺乳动物肝脏、脑、眼和心脏的老化及与年龄相关的疾病过程中出现¹²。果蝇模型将使研究人员能够在生理和疾病背景下研究多倍体化过程 ，因为与人类疾病相关的基因具有高度保守性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 培养皿	Fisher Scientific	FB0875713	用于制备解剖用培养板
50 mL 圆底离心管	Fisher Scientific	14-432-22	用于配制染色试剂
AxioImager M2 配 Apotome	Zeiss	NA	用于样本成像
微型吹管	Genesee Scientific	54-104M	用于麻醉黑腹果蝇品系
牛血清白蛋白，30%	Sigma	A7284-500ML	用于免疫染色
二氧化碳气罐	多个供应商	N/A	用于麻醉黑腹果蝇品系
Click-iT EdU 594 试剂盒	Thermofisher	C10339	用于 EdU 检测
盖玻片	Thermofisher	3406	用于封片
DAPI	Sigma	D9542-10MG	用于免疫染色
解剖板（使用 Sylgard 184 Sil 弹性体试剂盒）	Ellsworth Adhesives	184SIL	用于制备解剖用培养板。按说明混合环氧树脂，过夜干燥
驴抗兔 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 488 标记	Thermofisher	A21206	用于二次免疫染色
驴抗兔 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 568 标记	Thermofisher	A10042	用于二次免疫染色
果蝇麻醉管路及配件	Genesee Scientific	59-124C, 59-123, 59-140	用于麻醉黑腹果蝇品系
Dumont #5 镊子	Fine Science Tools	11252-20	用于解剖
epi-Gal4	Bloomington 果蝇品系中心 (b)	b38793	Losick 等，Current Biology, 2013
epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP	Bloomington 果蝇品系中心 (b)	b38793, b27392	Losick 等，Current Biology, 2013
Excel	Microsoft		用于进行倍性计算
Fiji/ImageJ（图像分析软件）	NIH	https://imagej.nih.gov/ij	用于图像分析
果蝇培养基	Archon Scientific	N/A	玉米糖浆/大豆培养基
Flystuff Flypad	Genesee Scientific	59-114	用于麻醉黑腹果蝇品系
玻璃解剖皿	Fisher Scientific	13-748B	用于进行解剖操作
载玻片	Fisher Scientific	12-518-104C	用于封片
羊抗小鼠 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 488 标记	Thermofisher	A11001	用于二次免疫染色
羊抗小鼠 IgG (H+L) 二抗，Alexa Fluor 568 标记	Thermofisher	A11031	用于二次免疫染色
Grace 昆虫培养基（未添加补充物）	Thermofisher	11595030	用于解剖操作
昆虫针	Fine Science Tools	26002-10	用于造成伤口并固定果蝇腹部使其平展
小鼠抗 Fasciclin III（果蝇）一抗	发育研究杂交瘤库	7G10	用于免疫染色上皮细胞间连接
封片介质	Vector Laboratories	H-1000	抗荧光淬灭封片介质，防止成像过程中光漂白
指甲油	Electron Microscopy Sciences	72180	用于密封载玻片
轨道摇床	Fisher Scientific	02-217-988	用于免疫染色
磷酸盐缓冲液，pH 7.4	Sigma	P3813-10PAK	用于染色
持针器	Fine Science Tools	91606-07	用于造成伤口
兔抗 Grainyhead 一抗	N/A	N/A	用于免疫染色上皮细胞核。抗体制备方案见参考文献 #4 和 #8
兔抗 RFP 一抗	MBL	PM005	用于免疫染色 mCD8-RFP 果蝇上皮组织
体视显微镜	Olympus	SZ51	用于果蝇组织的解剖与封片
吐温 X-100	Sigma	10789704001	用于免疫染色
UAS-E2F RNAi, UAS-RacDN	VDRC (v) 和 Bloomington 果蝇品系中心 (b)	v108837, b6292	Losick 等，Current Biology, 2013
UAS-fzr RNAi, UAS-Stg	VDRC (v) 和 Bloomington 果蝇品系中心 (b)	v25550, b56562	Grendler 等，Development, 2019
UAS-Myc	Bloomington 果蝇品系中心 (b)	b9674	Grendler 等，Development, 2019
UAS-myc RNAi	Bloomington 果蝇品系中心 (b)	b36123	Grendler 等，Development, 2019
Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools	15000-00	用于解剖