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方法文章

大鼠胰腺组织快速且经济的RNA提取

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DOI：

10.3791/61255

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2020年9月19日

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1Department of Biochemistry, School of Medicine, Shiraz University of Medical Sciences, 2Endocrinology and Metabolism Research Center, Nemazee Hospital, Shiraz University of Medical Sciences, 3English Language Department, Faculty of Paramedical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, 4Department of e-Learning in Medical Sciences, Virtual School and Center of Excellence in e-Learning, Shiraz University of Medical Sciences, 5Autophagy Research Center, School of Medicine, Shiraz University of Medical Sciences

本文内容

摘要

分离RNA的纯度和完整性是依赖RNA的检测中的关键步骤。本文介绍一种实用、快速且经济的方法，用于从小量未受损的胰腺组织中提取RNA。

摘要

无论采用何种提取方法，组织和细胞系中优化的RNA提取均分为四个步骤：1）均质化，2）RNA与蛋白质的有效变性分离，3）核糖核酸酶失活，4）去除DNA、蛋白质和碳水化合物的污染。然而，当组织中RNase含量较高时，维持RNA完整性非常困难。胰腺组织易发生自发性自溶，导致在不破坏RNA的情况下提取极为困难。因此，需要一种实用的RNA提取方法，以在提取过程中保持胰腺组织RNA的完整性。本研究通过在2分钟内获取20–30 mg大鼠胰腺组织并进行RNA提取，对现有方案进行了实验性与比较性研究，结果通过电泳进行评估。为使结果具有普遍性，实验重复三次。将胰腺组织浸入RNA稳定试剂中，在-80 °C下保存24小时后，使用RNA提取试剂进行提取，可获得高完整性的RNA。所得结果与采用商用旋转柱结合试剂盒获得的结果相当。

引言

结构基因数据可通过基因表达转录成功能产物。RNA分析用于发现不同条件下基因表达的差异。核酸提取方法有多种，包括：硫氰酸胍法、苯酚-氯仿提取法、基于纤维素的色谱法、二氧化硅基质提取法以及阴离子交换法1,2。

基因表达的准确检测受组织中分离的RNA完整性的显著影响；因此，在进行后续实验之前，评估从组织中分离的RNA完整性至关重要，因为对低质量RNA进行互补性分子检测可能影响诊断应用的结果。因此，为实现不同诊断应用的分子生物学检测，包括定量RT-PCR、微阵列、核糖核酸酶保护实验、Northern印迹分析、RNA定位分析以及cDNA文库构建，均需要高完整性的RNA3,4。

RNA在长时间存放后会变得极不稳定，长度超过10 kb的长mRNA片段尤其容易发生降解5,6。因此，研究人员必须考虑多种影响纯化RNA完整性的因素。RNA的纯度必须避免受到RNase、蛋白质、基因组DNA以及酶抑制剂污染的影响。此外，RNA在紫外光吸收比值（260/280）方面，最佳且可接受的范围应在1.8–2.0之间，并在电泳检测中保持尽可能少的片段化。近年来发展的实验室技术已使科学家能够更实际地评估分子分析样本的完整性7,8。

由于胰腺组织中含有大量的核糖核酸酶（RNases），从中提取无损伤的RNA比其他组织类型困难得多。然而，现有的提取方法，即快速将胰腺组织从腹腔中取出并在低温下进行匀浆以抑制RNases活性，已被证明效果不佳7,8,9,10,11,12,13,14。

本项比较性实验研究的目的是改进并比较现有方法，以确定最高效的方法。为此，对多种RNA提取方案进行了改进和比较，特别旨在确定所需胰腺组织量最少且成本最低的方法。

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方案

伦理的 批准 用于 本研究 来自设拉子医科大学（批准编号：93-01-01-7178\03-07-2014）。

注意：使用体重为 250 g 的雄性 Sprague–Dawley 大鼠。将含有浸于 RNA 稳定剂中的胰腺组织小片的管置于 -80 °C 的液氮罐中，并使用 RNA 提取试剂溶液以保持 RNA 的完整性。

1. 大鼠胰腺组织的切除

  1. 准备手术室，并将所有所需材料放置在超净台内。
  2. 将所有手术器械（敷料镊、Brown-Adson 镊、虹膜剪和 Littler 剪）在 240 °C 的烘箱中灭菌至少 4 小时，以灭活 RN 酶15。在超净台内用 70% 酒精对手术区域表面进行消毒。
  3. 使用胰岛素注射器经腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪 [80/8 mg/kg]。通过轻捏大鼠脚趾检查其无反应，以确认麻醉深度。
  4. 在适当的微量离心管（2 mL）中加入 1 mL RNA 稳定试剂，以抑制切除组织中内切核酸酶的活性。
  5. 立即将大鼠置于手术板上（头部朝向远离术者方向），准备进行正中切口。
  6. 用 70% 酒精对整个腹部表面进行消毒，并使用装有 #40 刀头的电推剪去除大鼠腹部毛发。
  7. 使用敷料镊、Brown-Adson 镊、虹膜剪和 Littler 剪从耻骨区域向双前肢方向做 V 形切口，打开腹腔。
  8. 将腹腔内脏器翻向左侧，以暴露胰腺。仔细寻找散布于腹腔内的胰腺组织，通过定位脾脏下方区域来识别胰腺，避免与脂肪组织混淆。
  9. 立即在 2 分钟内从腹腔中取出 20–30 mg 胰腺组织，迅速将组织放入 2 mL 微量离心管中，并用无菌刀片切割，以便 RNA 稳定试剂充分渗透组织。
  10. 将微量离心管立即放入液氮罐中速冻，并在 -80 °C 冰箱中保存 24 小时16。
  11. 24 小时后，将胰腺组织小块转移至冰容器中。
  12. 手术后经心脏注射氯化钾（KCl）对大鼠实施安乐死。

2. RNA 提取

  1. 在超净工作台内用70%乙醇对表面进行消毒。
  2. 在无菌微量离心管中加入1 mL RNA提取试剂，该试剂含有硫氰酸胍以抑制RNase活性。
  3. 将分离的胰腺组织转移至微量离心管中，并立即将该管转移至液氮中速冻。
  4. 使用微头探针式超声波破碎仪在4 °C条件下，设置功率为20，超声60秒（开启5秒，关闭5秒）以均质化组织。
  5. 将每份均质化样品置于碎冰中（4 °C）孵育5分钟，使核蛋白复合物完全解离。
  6. 每1 mL RNA提取试剂中加入0.2 mL氯仿，盖紧管盖后剧烈振荡15秒。
  7. 将离心管置于碎冰中（4 °C）孵育15分钟，使试剂分为三层。
  8. 在+2至+8 °C条件下以12,000 x g 离心15分钟，将无色水相转移至新的微量离心管中。
  9. 向水相中加入0.5 mL 100%异丙醇，盖紧管盖后至少颠倒混匀3次，使RNA充分混合。
  10. 将样品置于低温冰盒（4 °C）中孵育5–10分钟，以促进RNA沉淀。
  11. 在+2至+8 °C条件下以12,000 x g 离心15分钟，弃去上清液。
  12. 向每个离心管中加入1 mL 75%乙醇。
  13. 通过至少颠倒混匀3次来洗涤RNA沉淀。
  14. 在+2至+8 °C条件下以7,500 x g 离心5分钟，弃去上清液，并通过空气干燥去除RNA沉淀中的过量乙醇。
  15. 用经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的无RNase水重悬RNA沉淀。
  16. 用移液器枪头反复吹打溶液数次以溶解RNA沉淀，随后在+65 °C条件下孵育10–15分钟。

3. 使用变性电泳评估RNA完整性

  1. 制备凝胶电泳缓冲液：将50 mM NaAc（经DEPC处理）和0.5 M EDTA（pH 8.0）溶于DEPC处理过的H₂O中2O.
  2. 配制5倍甲醛凝胶电泳缓冲液（MOPS电泳缓冲液）：0.1 M MOPS（pH 7.0），40 mM NaAc，5 mM EDTA（pH 8.0）。
    1. 将20.6 g MOPS溶解于800 mL经DEPC处理的50 mM醋酸钠溶液中，用2 N NaOH调节pH至7.0。加入10 mL经DEPC处理的0.5 M EDTA（pH 8.0）。用DEPC处理的水定容至1 L。
    2. 使用0.2 µm滤膜过滤溶液，并在避光条件下室温保存以确保无菌。若暴露于光线下或进行高压灭菌，缓冲液会随时间推移变为黄色。淡黄色的缓冲液仍可正常使用，但颜色较深者不宜使用。17.
  3. 制备1.5%琼脂糖凝胶18. 对于50 mL，加入0.75 g琼脂糖和31 mL H2O. 将溶液放入微波炉中加热1分钟。加入9 mL甲醛和10 mL 5× MOPS电泳缓冲液。
  4. 准备凝胶样品。在无菌微量离心管中混合以下组分：
    X µL RNA（最多 30 µg）
    5×上样缓冲液 2 µL
    10 µL 甲酰胺
    4 µL MOPS 电泳缓冲液
    0.1 mg/mL 溴化乙锭（EtBr）溶液 1 µL
    3 µL 甲醛，5-x µL DEPC-H₂O2O
  5. 在65 °C下孵育样品15分钟，然后置于冰上冷却。离心5秒，直至所有液体沉降至管底。
  6. 以 5 V/cm 的电压预电泳 5 分钟。
  7. 将样品立即加入凝胶的加样孔中，然后将凝胶浸入1x甲醛变性电泳缓冲液中。以3–4 V/cm的电压进行电泳。19.

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结果

根据常规和改良手术方案在无RNA稳定剂条件下评估RNA提取试剂中RNA的完整性
采用常规手术方案从RNA提取试剂中提取RNA后，观察到不可接受的条带。泳道1显示作为对照的肝组织RNA。泳道2显示从常规手术方案获得的总RNA中28S/18S rRNA条带的降解状态。当胰腺组织用量减少至50 mg（泳道3）或20–30 mg（泳道4），并在无RNA稳定剂的情况下立即进行手术（改良方案）时，RNA分离效果较肝组织对照差，且观察到非特异性条带。

根据改进的手术方案将组织浸入RNA稳定试剂后评估RNA样本的完整性
使用RNA提取试剂所获得的RNA完整性取决于保存时间和温度（泳道5-8）。与对照肝脏组织相比，当胰腺组织量为50 mg（泳道5）或20-30 mg（泳道6）时，RNA分离未获成功。RNA在组织浸入RNA稳定试剂后立即提取。当20-30 mg组织在-80 °C条件下于RNA稳定试剂中浸泡48小时后，按方案提取RNA，电泳未观察到特异性条带。根据电泳结果，RNA已完全降解（泳道7）。如泳道8所示，将20...

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讨论

在分子生物学中，获得高质量的RNA至关重要。细胞和组织中存在的核糖核酸酶（RNase）会迅速降解RNA，从而使提取过程变得复杂。RNase是无需任何辅因子即可发挥作用的稳定酶类，即使微量的RNase也足以破坏RNA。当从腹腔中取出大鼠胰腺组织时，必须使用强效洗涤剂对手术器械进行消毒，彻底冲洗后置于240 °C的烘箱中至少4小时，以灭活RNase。鉴于胰腺中RNase含量极高，手术区域需用NaOH和稀释漂白剂进行灭菌处理，以去活化RNase。在解剖过程中，一旦胰腺组织被取出，RNA即可能开始降解。为了提高效率，解剖操作必须尽快完成20,21,22,23,24。

胰腺是机体稳态机制的关键组织。因此，改进的胰腺RNA提取方法有助于研究人员更深入地理解其活性通路。本实...

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致谢

本研究由伊朗设拉子医科大学（项目编号：93-01-01-7178\03-07-2014）提供资金支持。我们感谢设拉子医科大学医学电子学习系、虚拟学院及电子学习卓越中心的Zomorodian先生和Rostami先生在视频编辑方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂糖Merck116801德国
灭菌锅Teb Zaim伊朗
离心机Sigma德国
氯仿Merck107024德国
二乙基焦碳酸盐（DEPC）处理水Sigma德国
EDTAsigma60-00-4德国
电泳槽Payapajoohesh伊朗
Eppendorf 微量离心管Extragene中国台湾
溴化乙锭（EtBr）sigmaE 8751德国
乙醇Merck81870德国
Falcon 管Extragene中国台湾
甲醛Merck344198德国
甲酰胺Merck344206德国
匀浆器-超声破碎仪Microson XL 2000美国
异丙醇sigma19516德国
盐酸氯胺酮sigma1867-66-9德国
超净工作台Jal Tajhiz伊朗
磁力搅拌器Labrotechnik美国
微量离心机Eppendorf德国
移液器吸头Extragene中国台湾
MOPSsigma85022106德国
醋酸钠（Na AC）Merck567422德国
氢氧化钠（NaOH）Merck109137德国
烘箱Teb Zaim伊朗
pH 计Knick德国
RNA Later/RNA 稳定试剂Qiagen76104美国
手术器械Agn Thos德国制造
注射器AvaPezeshk伊朗
TriPure 试剂/RNA 提取试剂Roche11667157001美国
涡旋振荡器Labinco荷兰
水浴锅Memmert德国
赛拉嗪（zylazine）sigma7361-61-7德国

参考文献

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