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方法文章

离体小鼠胫神经中神经丝运输的成像与分析

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DOI：

10.3791/61264

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2020年8月31日

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, The Ohio State University, 2Present address: Interdepartmental Neuroscience Graduate Program and Department of Neurobiology, Northwestern University, 3Quantitative Biology Institute, Ohio University, 4Department of Physics and Astronomy, Ohio University

本文内容

摘要

我们描述了荧光光激活方法，用于分析来自表达光激活神经丝蛋白的转基因小鼠的外周神经有髓轴突中单根轴突内神经丝的轴突运输。

摘要

神经丝蛋白聚合物以轴突运输慢速成分沿轴突移动，平均速度约为0.35–3.5 mm/天。直到最近，原位研究这种运动仅能通过放射性同位素脉冲标记实现，该方法可在整体神经中分析轴突运输，时间分辨率为数天，空间分辨率为毫米级别。为了以更高的时间和空间分辨率原位研究神经丝运输，我们开发了一种hThy1-paGFP-NFM转基因小鼠，该小鼠在神经元中表达带有光激活型GFP标记的神经丝蛋白M。本文描述了荧光光激活脉冲逃逸和脉冲扩散方法，用于分析来自这些小鼠胫神经单个有髓轴突中的神经丝运输。 关键词：神经丝蛋白，轴突运输，光激活GFP，原位分析，有髓轴突，转基因小鼠 离体分离的神经节段通过灌注含氧生理盐水在显微镜载物台上维持，并采用转盘共聚焦荧光显微镜进行成像。使用紫光激活短段轴突区域的荧光，随后对激活区域及其邻近区域的荧光随时间的变化进行分析，从而实现对神经丝运输过程在分钟级时间分辨率和空间分辨率下的研究。 以及微米。数学建模可用于从所得数据中提取神经丝运输的动力学参数，包括速度、方向偏好性和暂停行为。脉冲逃逸法和脉冲扩散法也可被改进用于可视化其他神经中的神经丝运输。随着更多转基因小鼠的开发，这些方法还可用于成像和分析轴突中其他细胞骨架蛋白和胞质蛋白的轴突运输。

引言

神经丝的轴突运输最早于20世纪70年代通过放射性同位素脉冲标记法得以证实1该方法已为神经丝运输的研究提供了大量信息 体内但其空间和时间分辨率相对较低，通常最高也只能达到毫米级和天级2此外，放射性同位素脉冲标记是一种间接方法，需要注射并处死多只动物才能获得单条时间进程数据。随着20世纪90年代荧光蛋白的发现以及荧光显微镜技术的进步，研究人员得以在秒或分钟的时间尺度上，以亚微米级的空间分辨率直接观察培养神经元中的神经丝运输过程，从而更深入地揭示其运动机制3这些研究表明，轴突中的神经丝聚合物在微管轨道上由微管马达蛋白驱动，沿顺向和逆向快速且间歇性地移动。然而，神经丝是直径仅为10 nm的衍射极限结构，通常与其相邻结构相距仅数十纳米；因此，只有在神经丝分布稀疏的培养神经元中，才能将移动的聚合物与其邻近结构区分开来进行追踪。4因此，目前尚无法在含有大量神经丝聚合物（如髓鞘化轴突）的轴突中追踪单根神经丝。

为了利用荧光显微镜分析富含神经丝的轴突中神经丝的轴突运输，我们采用了一种自主研发的荧光光激活脉冲逃逸方法，用于研究培养神经细胞中神经丝的长期暂停行为4,5。通过在轴突的一小段区域内激活带有光可激活荧光标记的神经丝融合蛋白，随后通过测量荧光随时间的衰减来量化这些神经丝从激活区域的离开速率。该方法的优势在于，它是一种群体水平的神经丝运输分析技术，可在数分钟至数小时的时间尺度上应用，而无需追踪单个神经丝多聚体的运动。例如，我们已利用该方法分析了髓鞘化培养体系中神经丝运输的动力学特征6。

最近，我们描述了一种hThy1-paGFP-NFM转基因小鼠模型的建立，该模型在人类神经元特异性Thy1启动子调控下，于神经元中低水平表达一种带有光活化绿色荧光蛋白（paGFP）标记的神经丝蛋白M（paGFP-NFM）7。该小鼠模型可用于利用荧光显微镜原位分析神经丝的运输过程。本文中，我们介绍了两种用于分析这些小鼠胫神经有髓鞘轴突中神经丝运输的实验方法。第一种方法是上述的脉冲逃逸法。该方法可提供关于神经丝暂停行为的信息，但无法检测纤维离开激活区域的方向，因此不能用于测量净方向性和运输速度8。第二种方法是一种新的脉冲扩散法，其中我们不仅分析激活区域内荧光的减少，还分析荧光纤维向顺行和逆行两个方向离开激活区域时，在两侧相邻检测窗口中出现的荧光瞬时增强现象。在这两种方法中，均可通过对测量窗口内荧光变化进行数学分析和建模，获得神经丝运输的相关参数，如平均速度、净方向性和暂停行为。图3 展示了这两种方法。

本方案演示了 神经的解剖与制备、paGFP荧光的激活与成像，以及利用ImageJ的FIJI发行版软件包对所获图像进行神经丝蛋白运输的定量分析9。我们采用胫神经，因其较长（数厘米）且无分支；然而原则上，任何表达paGFP-NFM的神经，只要能够解剖并去鞘且不损伤轴突，均适用于本技术。

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方案

本文所述所有方法均已获得俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 神经生理盐水溶液的制备

  1. 配制 100 mL Breuer’s 生理盐水10：含 98 mM NaCl、1 mM KCl、2 mM KH2PO4、1 mM MgSO4、1.5 mM CaCl2、5.6% D-葡萄糖、23.8 mM NaHCO3 的双蒸水溶液。
  2. 使用前，将盐水溶液通入 95% 氧气和 5% 二氧化碳（碳合气体）混合气至少 30 分钟。剩余盐水可在一周内重复使用，但每次使用前必须重新充氧。
  3. 将充氧后的盐水倒入 60 mL 注射器中，并确保注射器内残留空气尽可能少。

2. 神经灌流室的初始组装

  1. 如图1A所示，连接注射器和管路，并将出流管放入废液瓶中。
  2. 将外密封圈放入灌流室外壳中，确保流体进出口柱与密封圈上的孔对齐。
  3. 将内密封圈（硅胶，100 µm 厚）放置在 #1.5 圆形盖玻片（直径 40 mm）上，仔细抚平密封圈中的任何褶皱，以确保密封紧密。为便于后续组装，将盖玻片和密封圈放置在纸巾或擦拭布上，密封圈朝上。

3. 小鼠胫神经的解剖与制备

  1. 通过吸入二氧化碳或其他机构批准的方法处死动物。当动物停止活动/呼吸时启动计时器，因为实验必须在处死后的3小时内进行7。
  2. 用70%乙醇喷洒毛发，并使用电动剃刀尽可能去除动物腿部和背部的毛发。
  3. 使用一把较大的解剖剪，在脊柱中段附近的皮肤上做一条背侧切口，并继续沿动物腹侧延伸切口。从该切口开始，通过轻轻将皮肤从肌肉上拉开并剪断筋膜，逐步剥离腿部的皮肤。
  4. 将动物仰卧放置在解剖托盘上，并用大头针固定四肢。可选择性地固定尾巴以进一步减少移动。
  5. 使用显微解剖剪，在大腿肌肉中部（尾部与膝盖之间）做一切口，以暴露坐骨神经。确保神经（透过肌肉可见）不被剪断。
  6. 向背侧和腹侧延伸切口以去除肌肉。同样地去除小腿肌肉，切口应浅而短，以避免损伤神经。
  7. 去除肌肉直至胫神经完全暴露，暴露范围从其在膝盖处分出坐骨神经的位置至足跟（图2A）。
    注意：在包括及后续所有涉及胫神经解剖的步骤中，应避免不必要的环境光暴露，以最大限度减少神经中paGFP可能发生的意外激活。
  8. 用一对镊子夹住靠近脊柱端的胫神经，并用显微解剖剪剪断神经。操作时注意不要对神经施加张力，将其从肌肉上轻轻提起，并剪断任何连接组织。
  9. 剪断胫神经远离脊柱的一端，并将其转移至盛有室温充氧生理盐水的小培养皿中。从此步骤开始，务必始终明确区分并追踪神经的近端和远端。
    注意：一种区分方法是在神经远端做一斜切标记，使锥形末端可见。
  10. 从神经近端开始，用一对极细尖的镊子轻轻夹住暴露的轴突末端。
  11. 用第二对镊子在近端夹住神经鞘，并缓慢向神经远端拉动。神经鞘将沿轴突平滑滑动，阻力极小。确保在此过程中不对神经施加过度张力。

4. 最终神经灌注室组装

  1. 抓握近端 神经，从生理盐水中取出并缓慢 将其平放于 将灌流室的盖玻片置于内垫圈矩形开口内，保持 轻柔的张力 在放置神经时，应使其保持平直。
  2. 将微流道载玻片有凹槽的一面朝向神经，且流动方向与神经平行，覆盖在神经上。翻转盖玻片与微流道组件，将其放入灌流室外壳中，使微流道载玻片紧贴外层垫圈。此时神经及周围的内层垫圈被夹在盖玻片与微流道载玻片之间，二者由 垫圈，盖玻片朝上（图1B).
  3. 将灌流室放入金属外壳中，并旋转锁定环以固定。确保塑料外壳完全置于所有金属卡扣下方，并充分拧紧以防止盐水泄漏。过度拧紧可能导致微流道载玻片或盖玻片破裂。将灌流室翻转，使盖玻片朝下。
  4. 缓慢按压生理盐水注射器的推杆以填充灌流室。在安装和成像过程中，始终将进液管和出液管、出液烧瓶及注射器保持在灌流室上方。这可以避免虹吸现象的发生，从而防止液体非预期流动 由于腔室内负压而引入气泡或导致焦点不稳定。
  5. 将灌流装置转移至倒置显微镜载物台上，并将生理盐水注射器安装至注射泵中。启动电机，调节至适当速度，使流速为0.25 mL/min。随后连接并开启设置为37 °C的管路加热器。
  6. 连接物镜加热器并设置为 37 °C，向物镜上加油，然后将灌流 chamber 插入载物台固定装置。
  7. 将油涂抹于灌流室加热垫上，并将其连接至灌流室。连接并开启加热装置，设定温度为37 °C。
    注意：温度变化可能导致灌注液脱气而在灌注腔内形成气泡。若出现气泡，可短暂将灌注液流速提高5至10倍，直至气泡排出灌注腔。
  8. 将灌流室锁定在载物台适配器上，并使物镜油与灌流室下方盖玻片接触。
    注意：此处使用的 Bioptechs 培养室及 ASI 载物台适配器专为倒置显微镜配置设计。

5. 荧光激活与图像采集

  1. 使用明场照明，聚焦于神经靠近盖玻片一侧底部表面的轴突层图2B）。有髓轴突（成年小鼠中直径通常为 1 - 6 µm）可通过可见的髓鞘进行识别，在明场透射光照明下无需对比度增强即可观察到。施密特-兰特曼切迹和郎飞结也清晰可见。无髓轴突更为纤细（通常 <直径为1 µm，通常以束状（Remak束）存在，且因彼此间距过近而难以分辨。
  2. 如果显微镜配备自动聚焦系统，请在延时成像过程中启用该功能以维持聚焦状态。
  3. 获取明场参考图像。记录方向 神经（近脊端和远脊端）相对于图像的位置。
  4. 使用488 nm激光和适用于paGFP的发射滤光片（例如525/50 nm）采集共聚焦图像 记录漂白前的自发荧光。保持较低的激光功率以最小化光漂白，相应调整曝光时间以检测微弱信号。例如，代表性数据在5%激光功率和4秒曝光条件下获得。记录下采集参数，供后续所有实验使用。
    注意：光激活后，理想的成像设置应产生较高的信噪比 > 8，且在连续采集20幅图像过程中光漂白程度低于原始信号的25%。轴突也可采用我们最初使用过的宽场落射荧光显微镜进行成像7但图像质量会因缺乏共焦性而较差。
  5. 将激光功率设置为正常成像功率的约5倍，以3-4分钟的曝光时间采集图像。尽管此步骤并非必需，但建议执行以漂白自发荧光及其他非特异性荧光信号，从而降低背景信号，最大限度提高光激活荧光的信噪比。
  6. 使用步骤5.4中的设置获取图像，以记录此漂白步骤后的激活前自发荧光。
  7. 在明场图像上，绘制一条与轴突平行的线段，其长度等于所需的激活窗口大小。该长度 该窗口的时长将根据实验目标和参数而有所不同，但典型的时长 分别为5 μm（脉冲-逃逸范式）和40 μm（脉冲-扩散范式）。
  8. 以该直线为参考，在视野范围内垂直于轴突方向绘制一个矩形兴趣区域（ROI）。该区域必须包含所有需要进行光激活的轴突。
  9. 确定使用405 nm光照进行光激活的最佳设置。
    注意：此步骤及子步骤仅在首次实验激活前执行。在实验过程中，必须使用相同的光激活设置。
    1. 使用405 nm激光线和低激光功率（例如5%），反复激活感兴趣区域 并设置像素驻留时间（例如，40 µs）和单次脉冲，在每次激活后采集激活的GFP荧光图像。重复此过程直至荧光不再增加，随后对每幅图像中感兴趣区域的荧光进行定量分析。
    2. 绘制平均荧光强度与脉冲次数的关系图。选择荧光不再增加时的脉冲次数作为最佳脉冲次数。 用于激活。
  10. 激活 paGFP 荧光 在5.8步骤中通过405 nm光进行图案化激发划定的区域。确保在激活前和激活后立即各采集一幅图像。
    注意：理想的 paGFP 激活应在 ROI 内产生边界清晰、荧光明确的区域。
  11. 激活完成后启动1分钟计时器。1分钟结束时，开始采集延时成像序列。
    注意：光照激活paGFP后，荧光会逐渐增强，因此需要1分钟的延迟时间以确保荧光充分上升。11. 对于脉冲展宽法，使用 5-10 30秒时间间隔的短时间采集周期足以测量中心窗口和侧翼窗口初始斜率，以评估速度和方向性。对于脉冲逃逸法，30至150分钟的采集周期，配合5或10分钟的时间间隔，可实现对微丝长期暂停行为的分析。
  12. 保存所有获取的图像以及用于荧光激活的感兴趣区域（ROI）。
  13. 移动到神经的另一区域，重复步骤5.1–5.11。若新区域位于同一轴突上，则必须距离先前激活的区域至少500 µm，以避免检测到来自其他激活区域迁移出的荧光神经丝。最终时间序列图像的采集必须在3小时时间窗口结束前完成。
    注意：该制备物的活性可能超过3小时，但我们尚未验证这一点。若解剖和制备操作熟练，可在3小时内获得五至八组每组10分钟的延时成像数据集。
  14. 在获取最终的延时成像序列后，停止生理盐水的流动，断开溶液和腔室加热器，并将灌流装置从显微镜载物台上移除。

6. 平场与暗场图像采集

  1. 将250 mg荧光素粉末加入0.5 mL双蒸水中，配制荧光素溶液。搅拌至无可见颗粒，然后在台式离心机中离心30秒，以沉淀任何未溶解的物质。若避光保存，该溶液可在4 °C下储存数月。
  2. 取8 μL荧光素溶液滴加至载玻片上，覆盖一张#1.5盖玻片。吸去多余液体，用指甲油封片，并静置使其干燥。
    注意：在此高浓度下，荧光素染料的强吸收特性会使激发光束在溶液内部迅速衰减，从而在盖玻片表面形成一个薄而均匀的荧光平面，且由于快速的扩散交换作用，该荧光平面具有较强的抗光漂白能力12。
  3. 将荧光素样品的盖玻片朝下放置于倒置显微镜载物台上，调节焦距至盖玻片表面的薄荧光层。移动载物台以寻找无气泡（暗斑）或大颗粒荧光素（亮斑）的视野。
  4. 采集一个跨度为6 μm、步长为0.2 μm的z轴图像序列，使中间图像对应初始焦平面。由于荧光信号非常强，应使用较短的曝光时间（例如40 ms）。由于盖玻片通常难以完全水平，且荧光素荧光平面极窄，因此必须采集z轴图像序列以覆盖整个视野中的最大荧光信号。重复此过程，共采集25个不同视野，每两个视野之间载物台移动至少20 µm。
  5. 关闭所有光路快门（包括相机快门），并将激光功率和曝光时间设为零。在此条件下采集100张图像。这些图像将被平均以生成暗场图像，用于校正相机芯片上的暗电流和偏置偏移。
    注意：连续采集模式是获取此类图像的理想方式。

7. 用于漂白校正的糖酵解抑制神经成像

  1. 按照步骤1的方法配制并充氧盐溶液；但用2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose）替代D-葡萄糖，并添加0.5 mM碘乙酸钠以抑制糖酵解13。我们将此溶液称为“抑制性盐溶液”。
  2. 使用抑制性盐溶液重复步骤2-5，并在步骤5.11中设置10-30分钟的时间间隔图像采集。在施加抑制性盐溶液后，需等待40-50分钟再开始成像，以确保神经丝运输被完全抑制。
    注意：糖酵解抑制最终会导致轴突死亡，因此在抑制后获取数据的时间窗口较窄，通常约为30分钟。轴突线粒体的黄素自发荧光可作为代谢抑制程度的指标，由于我们采用较长曝光时间来成像paGFP荧光，该自发荧光可在时间间隔成像序列中被检测到14。通常情况下，使用抑制性盐溶液处理期间，线粒体的自发荧光会增强。若观察到线粒体开始变圆或断裂，则应立即停止成像。

8. 使用 ImageJ 进行图像处理与分析

  1. 平场与暗场校正
    1. 打开暗场图像堆栈，通过点击 图像 | 堆栈 | Z 投影 并在下拉菜单中选择 平均强度，对图像进行平均，以生成 暗场 图像。
    2. 打开荧光素平场图像堆栈，通过点击 图像 | 堆栈 | Z 投影 并在下拉菜单中选择 最大强度，对每个堆栈（共25个）创建最大强度投影。
    3. 通过点击 图像 | 堆栈 | 图像到堆栈，将生成的25个最大投影图像合并为一个堆栈。然后点击 图像 | 堆栈 | Z 投影 并在下拉菜单中选择 平均强度，对该堆栈生成平均强度投影，以得到 平场图像。
    4. 通过点击 处理 | 图像计算器，选择 减法 作为操作，将暗场图像从平场图像中减去。确保勾选 32位（浮点）结果 选项。结果即为 校正后的平场图像。
    5. 首先点击 分析 | 设置测量值 并勾选 平均灰度值 选项，然后按“m”键，测量校正后平场图像的平均像素强度。
    6. 通过点击 处理 | 数学 | 除法，输入步骤 7.1.5 中获得的平均灰度值，将校正后的平场图像除以其平均强度。这将生成 逆增益 图像。
    7. 打开激活前和激活后的图像，以及时间序列图像堆栈。通过点击 图像 | 堆栈 | 工具 | 拼接，将这些图像按时间顺序从下拉菜单中选择并合并为单个堆栈。确保未选择 作为4D图像打开 选项。生成的堆栈即为 完整图像集。
    8. 对 完整图像集 重复步骤 8.1.4，然后通过点击 处理 | 图像计算器 并选择 除法 操作，将结果除以 逆增益 图像。这将生成 校正后的完整图像集，其中每幅图像均已针对照明场和探测器上的非均匀性进行了校正。
  2. 图像堆栈对齐
    1. 为校正由于载物台或样品漂移导致的时间序列图像平面错位，通过点击 插件 | 安装插件，导航至包含插件文件的文件夹并选择插件，安装 固定区域对齐 插件（补充文件1）。安装插件后重启 ImageJ。
      注：该插件基于“最小二乘凝聚”原理15进行图像对齐。
    2. 在 校正后的完整图像集 上绘制一个感兴趣区域（ROI），该区域应跨越多条轴突，且不超出每条轴突内激活荧光的近端和远端边界。区域的几何形状不重要，但排除结构形状或大小发生变化的区域可提高对齐质量。
    3. 通过点击 插件 | 固定区域对齐 运行对齐插件。插件默认设置帧间最大位移为2像素，但如果样品漂移显著，可在初始弹出窗口中进行调整。对齐过程可能需要数分钟，具体时间取决于图像堆栈的大小。
    4. 目视检查对齐后的堆栈以评估对齐质量。由于自动对齐在帧间荧光强度大幅波动时可能效果不佳，部分帧可能需要手动对齐。可通过查看需要移动的帧，点击 图像 | 变换 | 平移 实现手动对齐。在随后弹出的窗口中询问是否对整个堆栈进行平移时，点击 否。平移时仅使用整数像素值，并确保下拉插值菜单设置为 无，因为亚像素位移或插值会因像素强度重采样而改变数据。
    5. 将此结果保存为 对齐后的完整图像集。 
  3. 荧光强度测量
    1. 在 对齐后的完整图像集 的第一帧上使用角度工具绘制一个ROI，第一条臂沿激活区域的一侧边缘，垂直于轴突，第二条臂垂直。按“m”键测量角度，该角度描述了视野中轴突的方向。
    2. 通过点击 分析 | 设置比例尺 并输入适当数值，设置图像的比例尺，使尺寸以微米为单位进行测量。
    3. 通过点击 分析 | 工具 | ROI 管理器 打开 ROI 管理器。对于脉冲逃逸范式，跳至步骤 8.3.7；对于脉冲扩散范式，继续至步骤 8.3.4。
    4. 绘制任意尺寸的方形 ROI，然后点击 编辑 | 选择 | 指定。确保勾选 缩放单位 选项，然后将 ROI 设置为宽度 15μm，高度等于或大于图像高度。
    5. 通过点击 编辑 | 选择 | 旋转，将 ROI 旋转至步骤 8.3.1 中测得的角度，使其垂直于轴突，并将 ROI 的一侧沿激活区域的近端边缘放置。按“t”键将此 ROI（称为近端引导 ROI）添加至管理器。
    6. 拖动 ROI 使其与激活区域的远端边缘对齐，并再次按“t”键将其添加至 ROI 管理器。此 ROI 称为远端引导 ROI。近端和远端引导 ROI 将用于后续绘制侧翼测量 ROI。
    7. 使用步骤 5.11 中获取的时间序列图像 序列选择用于定量分析的轴突。该图像序列对此步骤非常有用，因为它捕捉了轴突的微弱自发荧光，揭示了激活区域外的轴突形态。
      注：不符合以下任一标准的轴突将被排除在分析之外：
      1. 轴突必须在整个测量窗口长度范围内均处于焦点。
      2. 轴突必须与激活区域的近端和远端边缘成 ±5° 以内。
      3. 轴突在激活区域近端和远端边缘 5μm 范围内不得有凹陷。 
      4. 在成像过程中明显改变形状的轴突应被排除。
      5. 在激活后图像中未出现明确激活区域的轴突应被排除（图2C，底部），因为这表明激活荧光发生扩散性弥散，是轴突死亡的迹象。 
    8. 观察步骤 5.5 中的长曝光漂白图像，检查轴突内的自发荧光结构。该荧光来源于线粒体内的黄素16。如果这些线粒体呈圆形或碎片状（图2D，底部），而非延伸的线性结构（图2D，顶部），则应将该轴突从分析中排除，因为这是代谢衰退的迹象。
    9. 利用上述创建的近端和远端引导 ROI，为每条待分析的轴突绘制三个测量 ROI：一个中心窗口，覆盖激活区域内 40 μm 范围的轴突；两个侧翼窗口，其宽度由 15 μm 的侧翼 ROI 限定，高度由激活区域边界处轴突的直径限定。将所有三个区域添加至 ROI 管理器。对于糖酵解抑制的轴突，绘制一个宽度不超过 5 μm 的单一区域，位于激活区域中央，且不超出轴突边界。 对于脉冲逃逸范式，激活区域仅 5 μm 宽，因此必须使用整个窗口。
    10. 对所有符合步骤 8.3.7 和 8.3.8 标准的轴突重复步骤 8.3.9。
    11. 通过点击 分析 | 设置测量值 并选择 平均灰度值 选项，将活动测量值设置为平均像素强度。确保未勾选其他任何测量选项。
    12. 在 ROI 管理器窗口中选择所有 ROI，选中窗口后按“Ctrl”+“a”。在 ROI 管理器窗口中点击 更多 | 多重测量 以测量荧光强度。将结果窗口中的数据复制到电子表格中以进行进一步分析。
    13. 通过点击 分析 | 设置测量值 并选择 面积 选项，将活动测量值设置为区域面积。确保未勾选其他任何测量选项。
    14. 重复步骤 8.3.12。由于面积不随时间变化，仅需复制结果中的一行数据即可。

9. 漂白校正

  1. 对于糖酵解抑制的轴突数据表格，将每个 ROI 从第 3 帧（首个时间序列帧）开始的各帧平均荧光强度减去第 1 帧（激活前帧）的平均荧光强度。所得结果即为背景校正后的均值。
  2. 以帧编号为横坐标，将数据绘制成散点图。对每个 ROI 的数据拟合指数趋势线（大多数电子表格程序具备此功能），方程形式为Ae-bx。该方程等价于光漂白函数 Ft = F0 × e-tɣ，其中 F0 表示时间序列第一帧的荧光强度，ɣ 为指数漂白速率，t 为时间，e 为自然对数的底。
  3. 对所有糖酵解抑制神经中所有轴突的 ROI 重复步骤 9.1.1–9.1.2。为获得最准确的光漂白速率估计值，应至少使用来自至少 5 个独立神经的总共 15 个轴突。采用所有抑制轴突的指数漂白速率（ɣ）的平均值对实验数据进行光漂白校正。每次实验或研究都必须重新进行一次漂白校准，因为光漂白依赖于图像采集参数和激光功率，而这些参数可能随时间变化。
  4. 对用正常生理盐水成像的轴突区域（即未进行糖酵解抑制）重复步骤 9.1.1。
  5. 将每个数据点除以 e-tɣ，其中 t 使用对应时间，ɣ 使用步骤 9.1.3 中获得的平均值。所得结果即为光漂白校正后的均值。
  6. 将每个数据点乘以对应感兴趣区域的面积，以计算每个时间点该区域的总荧光强度。

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结果

图3展示了脉冲逃逸和脉冲扩散实验的代表性图像。我们已发表多项研究，描述了使用脉冲逃逸方法所获得的数据及对该类数据的分析方法5,6,7,8,17。下文将展示脉冲扩散数据如何提供关于神经丝运输方向性和速度的信息，此类信息此前尚未报道。

神经丝在轴突中的运输是间歇性且双向的。这种运输可以通过任一时刻沿顺向和逆向移动的神经丝所占比例来描述，分别记为

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讨论

在分析脉冲逃逸和脉冲扩散实验时必须格外谨慎，因为在后期处理过程中，尤其是在平场校正、图像对齐和漂白校正阶段，存在引入显著误差的可能。平场校正对于纠正照明不均匀性是必要的，这种不均匀性会导致视野中从中心到边缘的光强逐渐下降。不均匀性的程度依赖于波长，因此平场校正应始终在用于采集实验数据的相同波长下进行。必须确保平场图像中的不均匀性能够真实反映待校正图像中的不均匀性。脉冲扩散实验尤其容易因不恰当的平场校正而产生误差，因为测量的兴趣区域（ROI）延伸至图像边缘区域，而该区域的光强下降最为显著。

最佳的paGFP激活条件会因激活方法和激光参数的不同而有所变化，必须在首次成像前通过实验经验确定。激活不足会导致激活荧光的信噪比过低，而激活过度则会引起激活荧光的漂白，因为紫光可同时激发未激活和已激活的paGFP。为了选择性地照射图像中的感兴趣区域，我们使用Andor FRAPPA激光振镜扫描系统，该系统可产生边界清晰、定义明确的荧光区域，如代表性结果所示。我们还成功使用了Andor Mosaic数字光阑（一种数字微镜装置），并以汞弧灯作为照明光源7...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢Paula Monsma在共聚焦显微镜操作和胫神经解剖方面的指导与协助，感谢Atsuko Uchida博士、Chloe Duger和Sana Chahande在小鼠饲养管理方面的帮助。本研究工作部分得到了美国国家科学基金会资助项目IOS1656784（授予A.B.）和IOS1656765（授予P.J.），以及美国国立卫生研究院资助项目R01 NS038526、P30 NS104177和S10 OD010383（均授予A.B.）的支持。N.P.B.获得了俄亥俄州立大学校长博士后学者计划资助的博士后奖学金。

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材料

本文使用的材料清单
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14 x 22 矩形垫圈 0.1 mmBioptechs1907-1422-100内层垫圈
2-脱氧-D-葡萄糖SigmaD6134
30 mm 带孔圆形垫圈Bioptechs1907-08-750外层垫圈
35 x 10 mm 培养皿Thermo Fisher153066解剖皿
40 mm 圆形盖玻片Bioptechs40-1313-0319
60 mL 注射器 - 鲁尔锁头BD309653
Andor Revolution WD 转盘共聚焦系统Andor配备 Perfect Focus 和 FRAPPA 系统
氯化钙FisherC79
盖玻片Fisher12-541-B用于荧光素载玻片
D-(+)-葡萄糖溶液SigmaG8769
解剖针Fine Science Tools26001-70
解剖镊Fine Science Tools11251-30尖头镊子
解剖显微镜Zeiss47 50 03
带蜡解剖盘Ginsberg Scientific568859
解剖剪刀Fine Science Tools14061-09初段解剖剪刀
FCS2 灌流腔室Bioptechs060319-2-03
荧光素钠Fluka46960
管路在线加热器Warner InstrumentsSH27-B
椎板切除镊Fine Science Tools11223-20初段解剖镊
硫酸镁Sigma-AldrichM7506
微流道载玻片Bioptechs130119-5
显微镜载玻片Fisher12-544-3用于荧光素载玻片
显微镜载物台插件Applied Scientific InstrumentationI-3017
物镜加热系统OkolabOko Touch 配物镜环
物镜油 - A 型Nikondiscontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA 物镜NikonMRD01901
氯化钾FisherP217
磷酸钾Sigma-AldrichP0662
碳酸氢钠Sigma-AldrichS6297
氯化钠Sigma-AldrichS7653
碘乙酸钠Sigma-AldrichI2512
注射泵Sage InstrumentsModel 355
管路接头 - 雌性Small Parts Inc.1005109
管路接头 - 雄性Small Parts Inc.1005012
Tygon 管Bioptechs1/16" 内径，1/32" 管壁厚度
Vannas 弹簧剪Fine Science Tools15018-10精细剪刀

参考文献

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