离体小鼠胫神经中神经丝运输的成像与分析

摘要

我们描述了荧光光激活方法，用于分析来自表达光激活神经丝蛋白的转基因小鼠的外周神经有髓轴突中单根轴突内神经丝的轴突运输。

摘要

神经丝蛋白聚合物以轴突运输慢速成分沿轴突移动，平均速度约为0.35–3.5 mm/天。直到最近，原位研究这种运动仅能通过放射性同位素脉冲标记实现，该方法可在整体神经中分析轴突运输，时间分辨率为数天，空间分辨率为毫米级别。为了以更高的时间和空间分辨率原位研究神经丝运输，我们开发了一种hThy1-paGFP-NFM转基因小鼠，该小鼠在神经元中表达带有光激活型GFP标记的神经丝蛋白M。本文描述了荧光光激活脉冲逃逸和脉冲扩散方法，用于分析来自这些小鼠胫神经单个有髓轴突中的神经丝运输。 关键词：神经丝蛋白，轴突运输，光激活GFP，原位分析，有髓轴突，转基因小鼠 离体分离的神经节段通过灌注含氧生理盐水在显微镜载物台上维持，并采用转盘共聚焦荧光显微镜进行成像。使用紫光激活短段轴突区域的荧光，随后对激活区域及其邻近区域的荧光随时间的变化进行分析，从而实现对神经丝运输过程在分钟级时间分辨率和空间分辨率下的研究。 以及微米。数学建模可用于从所得数据中提取神经丝运输的动力学参数，包括速度、方向偏好性和暂停行为。脉冲逃逸法和脉冲扩散法也可被改进用于可视化其他神经中的神经丝运输。随着更多转基因小鼠的开发，这些方法还可用于成像和分析轴突中其他细胞骨架蛋白和胞质蛋白的轴突运输。

引言

神经丝的轴突运输最早于20世纪70年代通过放射性同位素脉冲标记法得以证实¹该方法已为神经丝运输的研究提供了大量信息 体内但其空间和时间分辨率相对较低，通常最高也只能达到毫米级和天级²此外，放射性同位素脉冲标记是一种间接方法，需要注射并处死多只动物才能获得单条时间进程数据。随着20世纪90年代荧光蛋白的发现以及荧光显微镜技术的进步，研究人员得以在秒或分钟的时间尺度上，以亚微米级的空间分辨率直接观察培养神经元中的神经丝运输过程，从而更深入地揭示其运动机制³这些研究表明，轴突中的神经丝聚合物在微管轨道上由微管马达蛋白驱动，沿顺向和逆向快速且间歇性地移动。然而，神经丝是直径仅为10 nm的衍射极限结构，通常与其相邻结构相距仅数十纳米；因此，只有在神经丝分布稀疏的培养神经元中，才能将移动的聚合物与其邻近结构区分开来进行追踪。⁴因此，目前尚无法在含有大量神经丝聚合物（如髓鞘化轴突）的轴突中追踪单根神经丝。

为了利用荧光显微镜分析富含神经丝的轴突中神经丝的轴突运输，我们采用了一种自主研发的荧光光激活脉冲逃逸方法，用于研究培养神经细胞中神经丝的长期暂停行为^4,5。通过在....

方案

本文所述所有方法均已获得俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 神经生理盐水溶液的制备

1. 配制 100 mL Breuer’s 生理盐水¹⁰：含 98 mM NaCl、1 mM KCl、2 mM KH₂PO₄、1 mM MgSO₄、1.5 mM CaCl₂、5.6% D-葡萄糖、23.8 mM NaHCO₃ 的双蒸水溶液。
2. 使用前，将盐水溶液通入 95% 氧气和 5% 二氧化碳（碳合气体）混合气至少 30 分钟。剩余盐水可在一周内重复使用，但每次使用前必须重新充氧。
3. 将充氧后的盐水倒入 60 mL 注射器中，并确保注射器内残留空气尽可能少。

2. 神经灌流室的初始组装

1. 如图1A所示，连接注射器和管路，并将出流管放入废液瓶中。
2. 将外密封圈放入灌流室外壳中，确保流体进出口柱与密封圈上的孔对齐。
3. 将内密封圈（硅胶，100 µm 厚）放置在 #1.5 圆形盖玻片（直径 40 mm）上，仔细抚平密封圈中的任何褶皱，以确保密封紧密。为便于后续组装，将盖玻....

结果

图3展示了脉冲逃逸和脉冲扩散实验的代表性图像。我们已发表多项研究，描述了使用脉冲逃逸方法所获得的数据及对该类数据的分析方法^5,6,7,8,17。下文将展示脉冲扩散数据如何提供关于神经丝运输方向性和速度的信息，此类信息此前尚未报道。

神经丝在轴突中的运输是间歇性且双向的。这种运输可以通过任一时刻沿顺向和逆向移动的神经丝所占比例来描述，分别记为

讨论

在分析脉冲逃逸和脉冲扩散实验时必须格外谨慎，因为在后期处理过程中，尤其是在平场校正、图像对齐和漂白校正阶段，存在引入显著误差的可能。平场校正对于纠正照明不均匀性是必要的，这种不均匀性会导致视野中从中心到边缘的光强逐渐下降。不均匀性的程度依赖于波长，因此平场校正应始终在用于采集实验数据的相同波长下进行。必须确保平场图像中的不均匀性能够真实反映待校正图像中的不均匀性。脉冲扩散实验尤其容易因不恰当的平场校正而产生误差，因为测量的兴趣区域（ROI）延伸至图像边缘区域，而该区域的光强下降最为显著。

最佳的paGFP激活条件会因激活方法和激光参数的不同而有所变化，必须在首次成像前通过实验经验确定。激活不足会导致激活荧光的信噪比过低，而激活过度则会引起激活荧光的漂白，因为紫光可同时激发未激活和已激活的paGFP。为了选择性地照射图像中的感兴趣区域，我们使用Andor FRAPPA激光振镜扫描系统，该系统可产生边界清晰、定义明确的荧光区域，如代表性结果所示。我们还成功使用了Andor Mosaic数字光阑（一种数字微镜装置），并以汞弧灯作为照明光源⁷.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
14 x 22 矩形垫圈 0.1 mm	Bioptechs	1907-1422-100	内层垫圈
2-脱氧-D-葡萄糖	Sigma	D6134
30 mm 带孔圆形垫圈	Bioptechs	1907-08-750	外层垫圈
35 x 10 mm 培养皿	Thermo Fisher	153066	解剖皿
40 mm 圆形盖玻片	Bioptechs	40-1313-0319
60 mL 注射器 - 鲁尔锁头	BD	309653
Andor Revolution WD 转盘共聚焦系统	Andor		配备 Perfect Focus 和 FRAPPA 系统
氯化钙	Fisher	C79
盖玻片	Fisher	12-541-B	用于荧光素载玻片
D-(+)-葡萄糖溶液	Sigma	G8769
解剖针	Fine Science Tools	26001-70
解剖镊	Fine Science Tools	11251-30	尖头镊子
解剖显微镜	Zeiss	47 50 03
带蜡解剖盘	Ginsberg Scientific	568859
解剖剪刀	Fine Science Tools	14061-09	初段解剖剪刀
FCS2 灌流腔室	Bioptechs	060319-2-03
荧光素钠	Fluka	46960
管路在线加热器	Warner Instruments	SH27-B
椎板切除镊	Fine Science Tools	11223-20	初段解剖镊
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M7506
微流道载玻片	Bioptechs	130119-5
显微镜载玻片	Fisher	12-544-3	用于荧光素载玻片
显微镜载物台插件	Applied Scientific Instrumentation	I-3017
物镜加热系统	Okolab		Oko Touch 配物镜环
物镜油 - A 型	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA 物镜	Nikon	MRD01901
氯化钾	Fisher	P217
磷酸钾	Sigma-Aldrich	P0662
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6297
氯化钠	Sigma-Aldrich	S7653
碘乙酸钠	Sigma-Aldrich	I2512
注射泵	Sage Instruments	Model 355
管路接头 - 雌性	Small Parts Inc.	1005109
管路接头 - 雄性	Small Parts Inc.	1005012
Tygon 管	Bioptechs		1/16" 内径，1/32" 管壁厚度
Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools	15018-10	精细剪刀