一种用于啮齿类动物血脑屏障开放的高通量图像引导立体定向神经导航与聚焦超声系统

摘要

血脑屏障（BBB）可通过微泡介导的聚焦超声（FUS）实现暂时性开放。本文介绍了一种使用模块化FUS系统在体内进行高通量BBB开放的逐步操作方案，该系统便于非超声专业人员使用。

摘要

血脑屏障（BBB）一直是治疗多种脑部疾病的主要障碍。由紧密连接连接的内皮细胞构成了一道生理屏障，阻止大分子（>500 Da）进入脑组织。微泡介导的聚焦超声（FUS）可用于诱导血脑屏障短暂的局部开放，使较大的药物能够进入脑实质。

除了用于临床转化的大型临床设备外，针对药物候选物治疗反应评估的临床前研究还需要专用的小动物超声装置，以实现靶向血脑屏障开放。理想情况下，这些系统应支持高通量工作流程，兼具高空间精度和集成的空化监测功能，同时在初始投资和运行成本方面具有较高的成本效益。

本文介绍了一种基于商用组件的生物发光与X射线引导的小动物FUS立体定位系统，该系统满足上述各项要求。特别强调了高度自动化，以应对高通量临床前药物评价研究中常见的挑战。这些挑战包括需要实现标准化，以确保数据的可重复性、降低组内变异、减少样本量，从而符合伦理要求并减轻不必要的工作负担。所提出的BBB系统已在胶质母细胞瘤和弥漫性中线胶质瘤的患者来源异种移植模型中，用于BBB开放介导的药物递送试验，完成了验证。

引言

血脑屏障（BBB）是药物递送至脑实质的主要障碍。大多数已开发的治疗药物由于其理化参数（如脂溶性、分子量、氢键受体和供体）无法穿过血脑屏障，或因其对脑内外排转运蛋白具有亲和力而无法在脑内滞留^1,2。能够穿过血脑屏障的药物仅占少数，通常是小分子脂溶性化合物，且仅对有限种类的脑部疾病有效^1,2。因此，针对大多数脑部疾病，药理学治疗选择有限，亟需开发新的药物递送策略^3,4。

治疗性超声是一种新兴技术，可用于多种神经学应用，如血脑屏障破坏（BBBD）、神经调节和消融^4,5,6,7。为了通过颅骨使用体外超声发射器实现血脑屏障开放，通常将聚焦超声（FUS）与微泡联合使用。微泡介导的FUS可提高药物在脑实质中的生物利用度^5,8,9。在声波作用下，微泡开始振荡，从而启动跨细胞转运并破坏血脑屏障内皮细胞间的紧密连接，促进大分子的旁细胞运输¹⁰。先前的研究已证实，声学发射强度与血脑屏障开放所引起的生物学效应之间存在相关性^11,12,13,14。FUS联合微泡技术已在临床试验中用于胶质母细胞瘤的治疗，化疗药物包括替莫唑胺或脂质体多柔比星，同时也用于阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症的治疗^5,9,15,16。

由于超声介导的血脑屏障开放为药物治疗带来了全新的可能性，因此需要开展临床前研究以推动其临床转化，并评估所选药物候选物的治疗反应。这通常需要一个兼具高空间精度和集成空化检测功能的高通量工作流程，以实现对靶向血脑屏障开放的高重复性监测。如果可能，这些系统在初始投资和运行成本方面都应具有成本效益，以便根据研究规模进行扩展。大多数临床前FUS系统均与磁共振成像（MRI）结合，用于影像引导和治疗规划^15,17,18,19。尽管MRI能够提供有关肿瘤解剖结构和体积的详细信息，但它是一种昂贵的技术，通常需要由经过培训或具备专业技能的操作人员来执行。此外，高分辨率MRI在临床前研究机构中并不总是可及，且每只动物的扫描时间较长，使其不太适用于高通量药理学研究。值得注意的是，在神经肿瘤学领域的临床前研究中，特别是对于浸润性肿瘤模型，能够可视化并精确定位肿瘤是治疗成功的关键²⁰。目前，这一需求仅能通过MRI，或通过转导了光蛋白的肿瘤实现，后者可在给予光蛋白底物后利用生物发光成像（BLI）进行可视化。

磁共振引导的聚焦超声（FUS）系统通常采用水浴以确保超声波在经颅应用中的有效传播，其中动物头部部分浸入水中，即所谓的“自下而上”系统^15,17,18。尽管这类设计在小型动物研究中通常表现良好，但在动物准备时间、便携性以及使用过程中实际可维持的卫生标准之间仍存在权衡。作为磁共振成像的替代方案，其他用于立体定向导航的引导方法包括使用大鼠解剖图谱^21,22,23、激光指示器辅助的视觉定位²⁴、针孔辅助的机械扫描装置²⁵，或生物发光成像（BLI）²⁶。这些设计大多为“自上而下”系统，其中换能器置于动物头部上方，动物保持自然体位。“自上而下”工作流程可采用水浴^22,25,26或充满水的锥形容器^21,24。将换能器置于封闭锥形容器内使用的优点在于结构更紧凑、设置时间更短，并且易于去污，从而简化了整个操作流程。

声场与微泡的相互作用依赖于压力，其范围从低振幅振荡（称为稳定空化）到瞬态气泡破裂（称为惯性空化）^27,28。目前已有明确共识：超声诱导血脑屏障开放（ultrasound-BBBD）需要声压显著高于稳定空化的阈值，以实现有效的血脑屏障开放，但同时应低于惯性空化的阈值，因为后者通常与血管/神经损伤相关²⁹。最常见的监测与控制方法是采用被动空化检测（PCD）分析（背向）散射的声学信号，如McDannold等人所建议¹²。PCD依赖于对微泡发射信号傅里叶谱的分析，可实时测量稳定空化的特征信号（谐波、次谐波和超谐波）以及惯性空化的标志信号（宽带响应）的强度与出现情况。

由于微泡制剂的多分散性（振荡幅度强烈依赖于气泡直径）、不同品牌气泡壳层特性的差异，以及声学振荡对频率和压力的高度依赖性，实现精确压力控制的“通用型”PCD分析较为复杂^30,31,32。因此，已提出多种不同的PCD检测方案，这些方案针对上述各项参数的特定组合进行了优化，并已应用于多种场景（从体外实验、小动物研究到临床PCD应用），以实现稳定的空化检测，甚至用于压力的回溯性反馈控制^{11,14,30,31,32,33,34,35}。本研究中所采用的PCD方案直接源自McDannold等人的研究¹²，通过监测谐波发射以检测稳定空化，并通过宽带噪声检测惯性空化。

我们开发了一种基于影像引导的神经导航聚焦超声（FUS）系统，用于暂时性开放血脑屏障（BBB），以增强药物向脑实质的递送。该系统基于 commercially available components（市售组件），可根据动物实验设施中可用的成像技术，轻松适配多种不同的成像模式。由于我们需要高通量的工作流程，因此选择使用X射线和生物发光成像（BLI）进行影像引导和治疗规划。经光蛋白（例如荧光素酶）转导的肿瘤细胞适用于BLI成像²⁰。在给予光蛋白底物后，可在活体中监测肿瘤细胞，并确定肿瘤的生长情况和位置^20,36。BLI是一种低成本的成像方式，能够长期追踪肿瘤生长，具有快速扫描的优势，并且与MRI测量的肿瘤生长结果具有良好相关性^36,37。我们选择用一个连接在换能器上的注水锥形装置替代传统的水浴，以提高灵活性，使安装实验动物的平台可自由移动^8,24。该设计基于一个可拆卸平台，集成了（I）小动物立体定位平台，（II）兼容X射线和光学图像的定位标记物，（III）快速拆卸式麻醉面罩，以及（IV）集成的温度调控动物加热系统。在初始麻醉诱导完成后，动物被精确地固定在平台上，并在整个实验过程中保持该位置不变。因此，整个平台可依次通过干预流程中的各个工作站，同时维持精确且可重复的定位以及持续的麻醉状态。控制软件可自动检测定位标记物，并将所有类型的图像和成像模态（即micro-CT、X射线、BLI和荧光成像）自动注册到立体定位平台的参考坐标系中。借助自动校准程序，超声换能器的焦距被精确定位，从而实现干预规划、声学递送和随访成像分析的自动融合。如图1和图2所示，该装置具有高度灵活性，可用于设计专用的实验工作流程，并支持在不同工作站对动物进行交替操作，从而促进高通量实验的开展。我们已成功将该技术应用于高级别胶质瘤（如弥漫性中线胶质瘤）的小鼠异种移植模型中的药物递送。

方案

所有体内实验均获得荷兰伦理委员会（许可证编号 AVD114002017841）和荷兰阿姆斯特丹自由大学动物福利机构的批准。研究人员接受了FUS系统基本操作的培训，以尽量减少动物的不适。

1. 聚焦超声系统

注意：所述装置是基于市售组件自制的血脑屏障（BBB）破坏系统，包含一个3D打印的定制锥形聚焦装置和可拆卸的立体定位平台。该系统采用模块化设计，可根据现有设备和特定用途进行调整。本方案描述了对小鼠脑桥区域较大范围进行声孔效应（sonoporation）的操作流程。通过调整靶向位置，可对大脑的不同区域进行靶向处理。本研究中使用的超声换能器为1 MHz单元素换能器，其 焦距为75 mm，孔径为60 mm，焦点区域为1.5 × 1.5 × 5 mm（峰值压力的半高全宽，FWHM）。换能器的焦平面通过动物颅骨，在与耳杆相交的水平面内进行定位。

1. 为啮齿类动物选择合适的用于血脑屏障开放的换能器。
   注意：根据微泡的特性及所用频率，声学参数（特别是机械指数 MI）可能需要相应调整^13,38。
2. 将换能器安装至3D打印的锥形装置中。
3. 在锥形装置的底端使用声学透明的聚酯薄膜（Mylar膜），以实现声束传播路径的声学耦合，并将锥形容器内注满脱气水。
4. 如图1所示，将换能器安装在动物上方的电动线性平台上，以实现换能器的自动垂直定位。
5. 根据研究需求设计可拆卸的立体定位平台，该平台应包括温度可控的加热装置、门齿固定器和耳杆、麻醉系统以及多模态定位标记物，如图1和图2所示。立体定位平台的安装采用二维线性平台系统，可在声束下方对动物进行精确的自动定位（< 0.1 mm）。
6. 将换能器连接至如图1所示的声发射链路，该链路由换能器、函数发生器和功率放大器组成。
7. 建立图像处理流程，用于检测多模态定位标记物，从而实现对目标脑区的精确定位超声穿孔，并采集针式水听器检测到的空化信号数据。
8. 校准系统，并确定换能器焦点位置与动物在立体定位平台上垂直位置的对应关系。

2. 动物准备

注意：以下实验方案是针对小鼠设定的，但也可适用于大鼠。本实验使用雌性裸鼠 Foxn1-/-（6-8 周龄）。

1. 让动物在动物房中适应至少一周，并定期称重。
2. 在FUS治疗前30分钟，通过皮下注射给予布托啡诺（0.05 mg/kg）以启动镇痛治疗。
3. 用 3% 异氟烷、2 L/min 氧气麻醉动物₂ 并确认动物已深度麻醉。在整个操作过程中保持动物处于麻醉状态，并监测其呼吸频率和心率，根据需要调整异氟烷浓度。
4. 涂抹眼药膏以防止眼睛干燥并避免可能的损伤。
5. 用剃须刀和脱毛膏去除头部顶部的毛发，然后用水清洗以去除残留物，避免对皮肤造成刺激。
6. 对于使用生物发光成像（BLI）肿瘤模型的实验，采用29 G胰岛素注射器经腹腔注射（i.p.）150 µL D-荧光素（30 mg/mL），用于BLI成像引导。
7. 插入26-30 G尾静脉导管，并用少量肝素溶液（5 UI/mL）冲洗导管和静脉。用肝素溶液充满导管，以防止血液凝固。
   注意：当导管内出现血液反流时，表明导管插入效果良好。应避免导管内存在气泡，以防发生栓塞。为避免注射压力过高，应确保导管长度尽可能短。
8. 将动物置于温度可控的立体定位平台上，以避免低体温。
   注意：低体温会减少血液循环，从而可能影响微泡的注射/循环以及药物的药代动力学³⁹.
9. 使用耳杆和咬合杆将动物头部固定在立体定位仪平台上，并用绑带固定身体，再用胶带将动物尾巴固定在平台上。

3. 体内成像引导聚焦超声

注意：本实验方案采用1 MHz单元素换能器，使用持续时间为10 ms的脉冲串脉冲，机械指数（MI）为0.4，脉冲重复频率为1.6 Hz，共40个周期，持续240秒。该方案针对以六氟化硫（SF₆）作为惰性气体、由磷脂稳定的微泡进行优化，微泡平均直径为2.5 μm，且超过90%的微泡直径小于8 μm。

1. 将装有动物的立体定位平台置于成像设备中（例如, 生物发光成像或X射线成像，并对动物进行图像采集。
2. 结合多模态配准标记物与图像处理流程，根据换能器的焦点位置标记动物的位置。
3. 通过将脑部轮廓图覆盖在获取的X射线图像上，或利用BLI图像确定肿瘤中心，以确定目标区域（图2). 特定脑区的位置在Paxinos脑图谱中有明确标注⁴⁰ 以颅骨标记点bregma和lambda作为参考点。例如，脑桥位于相对于lambda的x=-1.0、y=-0.8、z=-4.5处。
4. 用胶带遮住动物的鼻孔和口部，以防止超声耦合剂干扰呼吸。
5. 在动物头部涂抹超声耦合剂。
6. 回缩动物颈部的皮肤，用超声耦合剂润滑针式水听器，并将针式水听器置于枕骨附近。
7. 使用图像处理流程和焦点来引导换能器到达正确位置。
8. 将预设参数应用于所有连接的设备，并定位目标脑区。
   注意：根据研究问题的不同，可对肿瘤或脑区进行单焦点或立体容积形状的声孔效应处理，如图所示 图2.
9. 按照制造商说明激活微泡。注射120 µL（5.4 µg）微泡作为单次推注。
10. 用生理盐水冲洗尾静脉导管，以检查导管是否通畅。
11. 注射微泡并开始超声辐照。
12. 使用针式水听器记录微泡空化现象。
13. 声孔效应后给予血管内对比剂或药物。剂量、给药时机和方案取决于研究目的及所用药物。
    注意：伊文思蓝是一种常用的染色剂，用于评估血脑屏障的开放情况⁴¹.
14. 在预定时间点或人道终点之前持续监测动物。

4. 微泡空化分析

注意：此处描述的是适用于SF体内实验的步骤₆- 平均直径为2.5 µm（80%的微泡直径小于8 µm）的磷脂微泡，采用McDannold等人最初提出的方法，以持续时间为10 ms、频率为1 MHz的脉冲超声激发。¹².

1. 将记录的 PCD 信号从时域通过傅里叶变换转换到频域。
2. 对稳定空化检测的 2^nd 和 3^rd 倍频（± 50 kHz）附近的谱功率进行积分，如 图 3 所示（2 MHz 和 3 MHz 处的绿色框）。
3. 对惯性空化检测的谱功率进行积分，范围包括主频率、2^nd 和 3^rd 倍频、1^st 和 2^nd 超谐波以及第一分谐波（± 150 kHz），如 图 3 所示（红色框）。
4. 对主频率附近（1 MHz ± 50 kHz）的谱功率进行积分，用于归一化先前获得的两个 PCD 信号。
   注：在 1 MHz 条件下，SF₆-磷脂微泡的体内实验中，PCD 信号在惯性空化发生前不显示超谐波或分谐波，如 图 3 所示。

结果

所描述的FUS系统（图1 和 图2）及相关工作流程已在超过100只动物中应用，成功获得了健康小鼠及荷瘤小鼠的可重复数据。根据微泡团注峰值时刻记录的空化信号及其谐波处的谱密度，可通过傅里叶分析计算各频率的谱功率，具体方法见操作步骤4。依据声学参数协议（1 MHz，10 ms脉冲持续时间，机械指数MI为0.4）结合微泡造影剂的使用，可获得归一化的二次谐波积分功率谱^nd 和 3^rd 谐波对观察到的激发频率的积分功率谱进行了归一化处理 图3这提供了一种非常灵敏且可靠的稳定空化检测方法，相比之下，在未注射微泡或施加0.6机械指数（MI）时未检测到次谐波。在发生惯性空化的情况下，可检测到宽带噪声基底升高，最高达25 dB，同时出现超谐波和次谐波。尽管0.4和0.6 MI对应的声压未引起宏观损伤，但在0.6 MI时，组织学检查证实已出现微观损伤，如图所示 图4. 将压力振...

讨论

本研究开发了一种经济高效的基于影像引导的聚焦超声（FUS）系统，用于实现血脑屏障（BBB）的短暂开放，从而提高药物向脑实质的递送效率。该系统主要由市售组件构成，并结合了X射线和生物发光成像（BLI）。所提出的模块化设计支持在高通量工作流程中使用多种成像模态进行治疗规划与评估。该系统可与更全面的高分辨率三维成像模态（如高分辨率磁共振成像或显微CT）联合使用，而在大部分研究中则采用二维成像模态，例如二维X射线和/或BLI。二维X射线和/或BLI不仅成本显著更低，而且由于各自的采集时间较短，非常适合大样本量的研究。本文所述的换能器适用于在脑部较深区域（f数为1.25）产生较大范围的血脑屏障开放（其尺度相当于小鼠脑大小）。我们已将该系统用于脑桥区域弥漫性生长的肿瘤研究^43,44。对于这些区域，需要对脑桥内包含整个肿瘤区域的大体积组织进行声孔效应处理。该模块化系统可轻松调整，适用于大脑幕上其他类型的脑肿瘤。在选择换能器类型时，应综合考虑其f数、焦距和频率。

总体设计相较于先前...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 鲁尔锁注射器	Becton Dickinson	309628	Plastipak
19 G 针头	Terumo Agani	8AN1938R1
23 G 针头	Terumo Agani	8AN2316R1
3M Transpore 外科胶带	科学应用于生命	7000032707	或类似物
任意波形发生器	Siglent	未提供	SDG1025，25 MHz，125 Msa/s
自动立体定位	自制	未提供	立体定位仪的所有部件均为自制
布鲁克In-Vivo Xtreme	Bruker	未提供	包含软件
缓冲氯化钠溶液	B. Braun Melsungen AG	220/12257974/110
盐酸丁丙诺啡	Indivior UK Limited	无可用数据	0.324 mg
笼具环境丰富化：纸浆智能窝	生物服务	无可用数据
碳过滤器	Bickford	NC0111395	Omnicon f/air
陶瓷勺	无	未提供
棉签	未提供	无
D-荧光素钾盐	Gold Biotechnology	LUCK-1
乙醇	VUmc 药房	未提供	70%
伊文思蓝	Sigma Aldrich	E2129
Fresenius 氯化钠 0.9%	Fresenius Kabi	未提供	0.9% NaCl，1000 mL
Histoacryl	Braun Surgical	未提供	Histoacryl 0.5 mL
水听器	精密声学	无可用数据
胰岛素注射器	Becton Dickinson	324825/324826	0.5 mL 和 0.3 mL
异氟烷	TEVA Pharmachemie BV	8711218013196	250 mL
氯胺酮	Alfasan	未提供	10 %，10 mL
小鼠饲料：Teklad 全球 18% 蛋白质啮齿类动物饲料	Envigo	2918-11416M
Neoflon 导管	Becton Dickinson	391349	26 号针头，0.6 mm × 19 mm
示波器	是德科技	未提供	InfiniiVision DSOX024A
塑料管	Greiner bio-one	210261	50 mL
功率放大器	电子学 & Innovation Ltd	210L	Model 210L
前置放大器直流耦合器	精密声学	n..	序列号：DCPS94
剪刀	Sigma Aldrich	S3146-1EA	或类似物
赛拉嗪	AST Farma	未提供	2%
SonoVue 微泡	Bracco	无可用数据	8 µl/ml
无菌水	Fresenius Kabi	无可用数据	1000 mL
注射器	未提供	无可用数据	可以使用各种注射器
丁丙诺啡	Indivior UK limitd	未提供	0.3 mg/ml
传感器	精密声学	未提供	1 MHz
镊子	Sigma Aldrich	F4142-1EA	或类似物
超声耦合剂	Parker Laboratories Inc.	01-02	Aquasonic 100
Vidisic 凝胶	博士伦	无可用数据	10 g