高通量图像引导立体定向神经导航和聚焦超声系统，用于在啮齿动物中打开血脑屏障

摘要

血脑屏障 （BBB） 可以通过微泡介导的聚焦超声波 （FUS） 暂时中断。在这里，我们描述了一个逐步协议的高通量BBB打开体内使用模块化FUS系统，为非超声专家访问。

摘要

血脑屏障 （BBB） 是治疗各种脑部疾病的主要障碍。内皮细胞，通过紧密的结点连接，形成生理屏障，阻止大分子（>500 Da）进入脑组织。微泡介导聚焦超声波 （FUS） 可用于诱导局部 BBB 开口，使较大的药物进入大脑帕奇马。

除了用于临床翻译的大型临床设备外，药物候选者治疗反应评估的临床前研究还需要专门的小型动物超声波设置，以便有针对性地打开 BBB。最好是，这些系统允许高吞吐量的工作流，既具有高空间精度，也可进行集成气穴监测，同时在初始投资和运行成本方面仍然具有成本效益。

在这里，我们展示了一个生物发光和X射线引导立体定向小型动物FUS系统，该系统基于市售组件，满足上述要求。特别强调高度自动化，以促进在大量药物前药物评估研究中通常遇到的挑战。这些挑战的例子是需要标准化，以确保数据可重复性，减少组内变异性，减少样本量，从而符合道德要求，减少不必要的工作量。拟议的BBB系统已在BBB开放范围内得到验证，方便了对患者衍生的胶质母细胞瘤多形式和弥漫中线胶质瘤模型的药物输送试验。

引言

血脑屏障 （BBB） 是药物输送到大脑帕伦奇马的主要障碍。大多数已经开发的治疗药物不会越过BBB，因为他们的物理化学参数（如嗜脂，分子量，氢键接受者和捐赠者），或不保留，因为他们的亲和力在大脑^1，2的外流运输器。能穿过BBB的一小群药物通常是小脂质分子，它们只对数量有限的脑部疾病^1、2有效。因此，对于大多数脑部疾病，药理治疗的选择是有限的，需要新的药物输送策略^3，4。

治疗超声波是一种新兴技术，可用于不同的神经学应用，如BBB中断（BBBD），神经调节，和消融^{4，5，6，7。}为了通过颅骨实现BBB开口，通过颅骨发射器，聚焦超声波（FUS）与微泡结合。微泡介导的FUS导致大脑中药物的生物利用率增加，第^5、8、9。在声波的存在下，微泡开始振荡，引发转细胞化，并破坏BBB内皮细胞之间的紧密交汇点，使较大的分子¹⁰的准细胞传输。先前的研究证实了声学发射的强度与生物对BBB开口^{11、12、13、14}的生物影响之间的相关性。FUS与微泡结合已用于临床试验，用于治疗胶质母细胞瘤，使用特莫佐洛米德或脂质多索鲁比辛作为化疗剂，或用于治疗阿尔茨海默氏症和肌萎缩性侧索硬化症^{5，9，15，16。}

由于超声波介质 BBB 的开启为药物治疗提供了全新的可能性，因此需要临床翻译的临床前研究来评估选定药物候选者的治疗反应。这通常需要具有高空间精度的高吞吐量工作流，最好是用于监控具有高可重复性的定向 BBB 开口的集成腔检测。如果可能，这些系统在初始投资和运行成本方面都需要具有成本效益，以便根据研究规模进行扩展。大多数前CFUS系统都与MRI相结合，用于图像指导和治疗规划15、17、18、19。虽然MRI提供了有关肿瘤解剖学和体积的详细信息，但它是一种昂贵的技术，通常由训练有素/熟练的操作员执行。此外，高分辨率MRI可能并不总是可供药物前设施的研究人员使用，并且需要每个动物长时间的扫描时间，因此它不太适合高通量的药理学研究。值得注意的是，对于神经肿瘤学领域的前科研究，特别是渗透肿瘤模型，可视化和瞄准肿瘤的可能性对于^{治疗成功至关重要}。目前，这一要求仅通过 MRI 或用光蛋白转化的肿瘤来实现，从而实现生物发光成像 （BLI） 与光蛋白基板管理相结合的可视化。

MRI制导的FUS系统通常使用水浴来确保超声波传播用于颅面应用，即动物的头部部分淹没在水中，即所谓的"自下而上"系统15、17、18。虽然这些设计在较小的动物研究中通常效果良好，但在动物准备时间、便携性和实际可维护的卫生标准之间是一种妥协。作为核磁共振成像的替代方案，立体定向导航的其他制导方法包括使用啮齿动物解剖图集21、22、23、激光笔辅助目视^24、针孔辅助机械扫描装置²⁵或BLI^26。这些设计大多是"自上而下"的系统，其中传感器被放置在动物的头顶上，动物处于自然位置。"自上而下"的工作流程包括^22、25、26或充满水的圆锥体21、24。在封闭的圆锥体内使用传感器的好处是更紧凑的占地面积、更短的设置时间和直接的净化可能性简化了整个工作流程。

声场与微泡的相互作用是压力依赖的，范围从低振幅振荡（称为稳定气泡）到瞬态气泡崩塌（称为惯性气泡^{）27，28。}有一个既定的共识，超声波BBBD需要一个声压远远高于稳定的气穴阈值，以实现成功的BBBD，但低于惯性气泡阈值，这通常与血管/神经损伤^29。最常见的监测和控制形式是分析（背）散发出声信号使用被动腔检测（PCD），如麦克丹诺德等人^{建议的12。}PCD 依赖于微泡发射信号的 Fourier 光谱分析，其中稳定气泡特征（谐波、亚和声波和超谐波）和惯性气泡标记（宽带响应）的强度和外观可以实时测量。

由于微泡配方的多散射性（振荡幅度强烈取决于气泡直径）、品牌间气泡壳特性的差异以及声学振荡（这在很大程度上取决于频率和压力^{30、31、32），}用于精确压力控制的"一刀切"PCD 分析变得复杂。因此，提出了许多不同的PCD检测方案，这些协议已适应所有这些参数的特定组合，并已用于各种应用方案（从体外实验小动物协议到PCD用于临床使用），用于强力气穴检测，甚至用于压力^{11、14、30、31、32、33、34、35}的追溯性反馈控制。本研究范围内采用的PCD协议直接来自麦克丹诺德等人^12，并监测谐波发射是否存在稳定的空腔和宽带噪声，用于惯性气穴检测。

我们已经开发了一个图像引导神经导航FUS系统，用于BBB的短暂打开，以增加药物输送到大脑的帕奇马。该系统基于市售组件，可根据动物设施中可用的成像技术轻松适应多种不同的成像方式。由于我们需要高通量工作流程，我们选择使用 X 射线和 BLI 进行图像指导和治疗规划。用光蛋白（如红素酶）转化的肿瘤细胞适合BLI成像^20。光蛋白基底施用后，肿瘤细胞可在体内监测，肿瘤生长和位置可确定^20、36。BLI是一种低成本的成像方式，它能够随时间跟随肿瘤生长，具有快速的扫描时间，它与MRI^36，37测量的肿瘤生长密切相关。我们选择用一个装满水的锥体代替水浴池，以灵活地移动安装啮齿动物^的平台。设计基于一个可拆卸平台，配备集成了（I）小动物立体定向平台（II）与X射线和光学图像兼容性（III）快速可拆卸麻醉面膜和（IV）集成温度调节动物加热系统。麻醉后，动物被安装在平台上的精确位置，在整个过程中，它仍然存在。因此，整个平台通过整个干预工作流程的所有站点，同时保持准确和可重复的定位和持续麻醉。控制软件允许自动检测假象标记，并自动将所有类型的图像和图像模式（即微CT、X 射线、BLI 和荧光成像）注册到立体定向平台的参考框架中。在自动校准程序的帮助下，超声波传感器的焦距在内部被精确认识，从而实现了介入规划、声学传输和后续成像分析的自动融合。如图1和图2所示，该设置提供了高度的灵活性，设计专用的实验工作流程，并允许在不同的站点交错处理动物，从而促进高通量实验。我们已使用这项技术成功地在小鼠异种移植的高档胶质瘤，如弥漫中线胶质瘤。

方案

所有体内实验均由荷兰伦理委员会（许可证编号AVD114002017841）和荷兰阿姆斯特丹Vrije大学动物福利机构批准。调查人员接受了FUS系统基础知识的培训，以尽量减少动物的不适。

1. 聚焦超声波系统

注:描述的设置是基于市售组件的内部构建的 BBB 中断系统，包括一个 3D 打印定制圆锥体和可拆卸立体声平台。该系统设计为模块化，可根据现有设备和特定用途进行修改。该协议描述了小鼠大脑庞廷区域较大区域的声波化过程。通过调整目标位置，大脑的不同部分可以成为目标。在这项研究中，使用了1兆赫单元素传感器，焦距为75毫米，光圈为60毫米，焦区为1.5 x 1.5 x 5毫米（峰值压力的FWHM）。传感器的焦点平面通过动物的颅骨定位在与耳栏相交的水平平面上。

1. 为啮齿动物的 BBB 开口选择合适的传感器。
   注:根据微泡的特性和使用频率，声学设置，特别是机械指数（MI），可能会发生变化^13，38。
2. 将传感器放在 3D 打印的圆锥体中。
3. 在圆锥体的底端采用声学透明的 mylar 膜，实现光束传播路径的声学耦合，并在圆锥体中填充脱气水。
4. 将传感器安装在动物上方的机动线性阶段，如 图 1 所示，允许自动垂直定位传感器。
5. 根据研究的要求设计一个可拆卸的立体定向平台，包括温度调节加热、咬合和耳栏、麻醉和多模式的纤维标记，如 图 1 和图 2所示。立体定向平台的安装由二维线性舞台系统组成，允许在光束下精确自动定位（< 0.1 毫米）动物。
6. 将传感器连接到 图 1 中显示的声学发射链，该链由传感器、函数发生器和功率放大器组成。
7. 设计一个图像处理管道来检测多模式的假象标记，使精确的声波瞄准感兴趣的大脑区域，并收集针水听器检测到的腔化数据。
8. 校准系统并确定转导器对应动物在立体定向平台上的垂直定位的焦点。

2. 动物制备

注:以下协议为小鼠指定，但可以适应大鼠。对于这些实验，使用雌性水性裸体Foxn1-/-小鼠（6-8周大）。

1. 允许动物在动物设施中适应至少一周，并定期称体重。
2. 通过皮下注射（s.c.）注射30分钟之前，FUS治疗开始镇痛治疗，管理丁丙诺啡（0.05毫克/千克）。
3. 用3%异氟兰、2L/min O₂ 麻醉动物，验证动物是否深度麻醉。在整个过程中保持动物麻醉，并监测呼吸频率和心率，根据需要调整异氟素的浓度。
4. 涂抹眼药膏，防止眼睛干燥，避免可能的伤害。
5. 用剃须刀和脱毛霜去除头顶上的头发，然后用水清洗，以去除任何残留物，以避免对皮肤造成刺激。
6. 对于BLI肿瘤模型的实验，注射150微L的D-露西芬（30毫克/mL）腹膜内（即.p.），用29G胰岛素注射器进行BLI图像指导。
7. 插入 26-30 G 尾静脉导管，用少量肝素溶液（5 UI/mL）冲洗导管和静脉。用肝素溶液填充导管，以避免血液凝固。
   注意:当血液倒流到导管中时，可以看到良好的导管。避免导管中的气泡，以防止浮雕。为了避免过多的注射压力，请确保导管的长度尽可能短。
8. 将动物放在温度调节立体定向平台上，以避免体温过低。
   注:体温过低可减少血液循环，可影响微泡^{和药物动力}学的注射/循环。
9. 使用耳栏和咬伤杆固定和固定立体定向平台上的动物头部。用带子固定身体，将动物的尾巴绑在平台上。

3. 体内图像引导聚焦超声波

注意:对于此协议，使用了 1 MHz 单元素传感器，其音冲脉冲持续时间为 10 ms，MI 为 0.4，脉冲重复频率为 1.6 Hz，240s 周期为 40 个周期。该协议被优化为微泡稳定含有硫六氟化物（SF_6）作为无害气体，其中平均气泡直径为2.5微米，超过90%的气泡小于8微米。

1. 将立体定向平台与安装的动物置于成像模式（如 BLI 或 X 射线）中， 并拍摄动物的图像。
2. 使用多模式的假象标记与图像处理管道相结合，根据传感器的对焦点标记动物的位置。
3. 通过在获得的 X 射线图像上放置大脑轮廓或使用 BLI 图像确定肿瘤中心（图 2）来确定目标区域。大脑特定部位的位置在Paxinos大脑图集⁴⁰ 中使用头骨标记布雷格玛和兰姆达作为参考点。例如，庞斯位于 x=-1.0，y=-0.8 和 z=-4.5 从兰姆达。
4. 用胶带屏蔽动物的鼻孔和嘴部，防止超声波凝胶干扰呼吸。
5. 在动物的头顶上涂抹超声波凝胶。
6. 缩回动物颈部的皮肤，用超声波凝胶润滑针水听器，并将针水听器放在眼骨的直接附近。
7. 使用图像处理管道和对焦点引导传感器到正确的位置。
8. 将预配置设置应用到所有附加设备上，并针对感兴趣的大脑区域。
   注:根据研究问题，肿瘤或脑区域可以作为单个焦点或体积形状，如 图2所示。
9. 激活制造商描述的微泡。注入一个120微L（5.4微克）微泡的博卢斯。
10. 用盐水冲洗尾静脉导管，检查导管的开口。
11. 注入微泡并开始共振。
12. 用针水听器记录微泡腔。
13. 声波手术后施用血管内对比剂或药物。剂量、时间和计划取决于研究的目的和药物。
    注:埃文斯蓝是一个常见的颜色代理评估BBB开幕^41。
14. 监视动物，直到预先确定的时间点或人道终点之前。

4. 微泡腔分析

注:这里描述了应用过程，它适用于SF_6-磷脂微泡的体内实验，平均直径为2.5微米（80%的气泡低于8微米），在1MHz的频率下，爆音脉冲为10毫秒，最初由麦克丹诺德等人^建议。

1. 将录制的 PCD 信号从时间域转换为频率域。
2. 集成由此产生的光谱功率，在 2^号 和 3^号 谐波（± 50 kHz）周围进行稳定空腔检测，如 图 3 所示（2 和 3 MHz 的绿色框）。
3. 集成惯性腔检测的光谱功率，在主频、2^号、3^号谐波、1号和2^号超谐波以及第一个亚谐波（±150 kHz）之间，如图3（红色框）所示。
4. 将光谱功率集成在主频（1 MHz ± 50 kHz）周围，实现先前获得的两个 PCD 信号的正常化。
   注:PCD信号，用于SF_6-磷脂微泡在体内实验在1 MHz，不显示超谐波或亚和谐之前惯性气泡设置，如 图3所示。

结果

描述的FUS系统（图1和图2）和相关工作流程已用于100多只动物，并产生了健康小鼠和肿瘤携带小鼠的可重复数据。根据微泡泡泡注注峰值时记录的空腔和谐波的光谱密度，可以使用《议定书》第 4 步中解释的 Fourier 分析计算每个频率的光谱功率。基于声学协议（1 MHz，10ms脉冲持续时间），MI为0.4，结合微泡，^{在第二和第三}谐波的标准化综合功率光谱使图3中观察到的激发频率的综合功率谱正常化。这提供了一种非常敏感和可靠的稳定气泡检测手段，相比之下，在没有注入微泡时没有探测亚和谐论，也没有在应用0.6 MI时观察惯性气泡。在惯性气泡的情况下，检测到高达 25 dB 的广带噪声地板增加，以及超谐波和亚谐波的外观。虽然MI的声压为0.4和0.6，没有造成宏观损害，但从技术上讲，微观损伤在MI为0.6，如图4所示。压力振幅进一步增加至MI为0.8，导致大型血管的宏观...

讨论

在这项研究中，我们开发了一个基于成本效益的基于FUS的图像引导系统，用于瞬时BBB中断，以增加药物输送到大脑的帕奇马。该系统主要由市售组件构建，并与 X 射线和 BLI 配合使用。拟议设计的模块化允许在高通量工作流程中使用多种成像模式进行规划和评估。该系统可以与更全面的高分辨率 3D 成像模式（例如高分辨率 MRI 或微型 CT）相结合，而对于大部分研究，2D 成像模式（如 2D X 射线和/或 BLI）都使用。2D X 射线和/或 BLI 由于采集时间短，因此具有更划算的性价比，而且非常适合大容量研究。这里描述的传感器非常适合在大脑深处（f数1.25）的较大区域（小鼠大脑的尺度上）产生BBBD。我们已经使用该系统在庞廷地区^43，44扩散生长肿瘤。对于这些区域，需要进行更大的体积，包括整个肿瘤区域。模块化系统可以很容易地调整为其他类型的脑肿瘤在大脑的更超前的部分。为了决定传感器类型，一人应考虑 f 号、焦距和频率。

因此，与先前建议的设计相比，整体设计提出了两项改进...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 鲁尔锁注射器	Becton Dickinson	309628	Plastipak
19 G 针	Terumo Agani	8AN1938R1
23 G 针	Terumo Agani	8AN2316R1
3M Transpore 手术胶带	应用于生命	7000032707	或类似
任意波形发生器	Siglent	n.a.SDG1025,25	MHz，125 Msa/s
自动立体法	内部构建	n.a.Stereotact	，所有元素均在内部构建
Bruker In-Vivo Xtreme	Bruker	n.a.	包括软件
缓冲 NaCl 溶液	B. Braun Melsungen AG	220/12257974/110
盐酸丁丙诺芬	Indivior UK 限制	n.a.0.324	mg
笼式富集：纸浆智能家居	生物服务	n.a.
碳过滤器	Bickford	NC0111395	Omnicon f/air
陶瓷勺	n.a	n.a.
棉签
-荧光素，钾盐	黄金生物技术	LUCK-1
乙醇	VUmc 药房	n.a.70	%
Evans Blue	Sigma Aldrich	E2129
费森尤斯 NaCl 0.9%	费森尤斯 Kabi	n.a.NaCl	0.9 %， 1000 mL
组织丙烯	Braun 外科	n.a.	组织丙烯酸 0.5 mL
水听器	精密声学	n.a.
胰岛素注射器	Becton Dickinson	324825/324826	0.5 mL 和 0.3 mL
异氟醚	TEVA Pharmachemie BV	8711218013196	250 mL
氯胺酮	Alfasan	n.a.10	%， 10 mL
小鼠食物：Teklad 全球 18% 蛋白质啮齿动物饮食	Envigo	2918-11416M
新氟龙导管	Becton Dickinson	391349	26 GA 0.6 x 19 mm
示波器	Keysight Technologies	n.a.InfiniiVision	DSOX024A
塑料管	Greiner bio-one	210261	50 mL
功率放大器	电子元件 &创新有限公司	210L	型号210L
前置放大器直流耦合器	精密声学	n..	序列号：DCPS94
剪刀	Sigma Aldrich	S3146-1EA	或类似产品
Sedazine	AST Farma	n.a.2	%
SonoVue 微泡	Bracco	n.a.8	µl/ml
无菌水	Fresenius Kabi	n.a.1000	mL
注射器	n.a.n.a	.各种	注射器 可以使用各种注射器
Temgesic	Indivior UK 限制	n.a.0.3	mg/ml
传感器	精密声学	n.a.1	MHz
镊子	Sigma Aldrich	F4142-1EA	或类似
超声凝胶	派克实验室公司	01-02	Aquasonic 100
Vidisic 凝胶	Bausch + Lomb	n.a.10	g