一种用于啮齿类动物血脑屏障开放的高通量图像引导立体定向神经导航与聚焦超声系统

摘要

血脑屏障（BBB）可通过微泡介导的聚焦超声（FUS）实现暂时性开放。本文介绍了一种使用模块化FUS系统在体内进行高通量BBB开放的逐步操作方案，该系统便于非超声专业人员使用。

摘要

血脑屏障（BBB）一直是治疗多种脑部疾病的主要障碍。由紧密连接连接的内皮细胞构成了一道生理屏障，阻止大分子（>500 Da）进入脑组织。微泡介导的聚焦超声（FUS）可用于诱导血脑屏障短暂的局部开放，使较大的药物能够进入脑实质。

除了用于临床转化的大型临床设备外，针对药物候选物治疗反应评估的临床前研究还需要专用的小动物超声装置，以实现靶向血脑屏障开放。理想情况下，这些系统应支持高通量工作流程，兼具高空间精度和集成的空化监测功能，同时在初始投资和运行成本方面具有较高的成本效益。

本文介绍了一种基于商用组件的生物发光与X射线引导的小动物FUS立体定位系统，该系统满足上述各项要求。特别强调了高度自动化，以应对高通量临床前药物评价研究中常见的挑战。这些挑战包括需要实现标准化，以确保数据的可重复性、降低组内变异、减少样本量，从而符合伦理要求并减轻不必要的工作负担。所提出的BBB系统已在胶质母细胞瘤和弥漫性中线胶质瘤的患者来源异种移植模型中，用于BBB开放介导的药物递送试验，完成了验证。

引言

血脑屏障（BBB）是药物递送至脑实质的主要障碍。大多数已开发的治疗药物由于其理化参数（如脂溶性、分子量、氢键受体和供体）无法穿过血脑屏障，或因其对脑内外排转运蛋白具有亲和力而无法在脑内滞留^1,2。能够穿过血脑屏障的药物仅占少数，通常是小分子脂溶性化合物，且仅对有限种类的脑部疾病有效^1,2。因此，针对大多数脑部疾病，药理学治疗选择有限，亟需开发新的药物递送策略^3,4。

治疗性超声是一种新兴技术，可用于多种神经学应用，如血脑屏障破坏（BBBD）、神经调节和消融^4,5,6,7。为了通过颅骨使用体外超声发射器实现血脑屏障开放，通常将聚焦超声（FUS）与微泡联合使用。微泡介导的FUS可提高药物在脑实质中的生物利用度^5,

方案

所有体内实验均获得荷兰伦理委员会（许可证编号 AVD114002017841）和荷兰阿姆斯特丹自由大学动物福利机构的批准。研究人员接受了FUS系统基本操作的培训，以尽量减少动物的不适。

1. 聚焦超声系统

注意：所述装置是基于市售组件自制的血脑屏障（BBB）破坏系统，包含一个3D打印的定制锥形聚焦装置和可拆卸的立体定位平台。该系统采用模块化设计，可根据现有设备和特定用途进行调整。本方案描述了对小鼠脑桥区域较大范围进行声孔效应（sonoporation）的操作流程。通过调整靶向位置，可对大脑的不同区域进行靶向处理。本研究中使用的超声换能器为1 MHz单元素换能器，其 焦距为75 mm，孔径为60 mm，焦点区域为1.5 × 1.5 × 5 mm（峰值压力的半高全宽，FWHM）。换能器的焦平面通过动物颅骨，在与耳杆相交的水平面内进行定位。

1. 为啮齿类动物选择合适的用于血脑屏障开放的换能器。
   注意：根据微泡的特性及所用频率，声学参数（特别是机械指数 MI）可能需要相应调整^13,38。
2. 将换能器安装至3D打印的锥形装置中。
3. 在锥形装置的底端使用声学透明的聚酯薄膜（Mylar膜），以实现声束传播路径的声学耦合，并将锥形容器内注满脱....

结果

所描述的FUS系统（图1 和 图2）及相关工作流程已在超过100只动物中应用，成功获得了健康小鼠及荷瘤小鼠的可重复数据。根据微泡团注峰值时刻记录的空化信号及其谐波处的谱密度，可通过傅里叶分析计算各频率的谱功率，具体方法见操作步骤4。依据声学参数协议（1 MHz，10 ms脉冲持续时间，机械指数MI为0.4）结合微泡造影剂的使用，可获得归一化的二次谐波积分功率谱^nd 和 3^rd 谐波对观察到的激发频率的积分功率谱进行了归一化处理 图3这提供了一种非常灵敏且可靠的稳定空化检测方法，相比之下，在未注射微泡或施加0.6机械指数（MI）时未检测到次谐波。在发生惯性空化的情况下，可检测到宽带噪声基底升高，最高达25 dB，同时出现超谐波和次谐波。尽管0.4和0.6 MI对应的声压未引起宏观损伤，但在0.6 MI时，组织学检查证实已出现微观损伤，如图所示 图4. 将压力振.......

讨论

本研究开发了一种经济高效的基于影像引导的聚焦超声（FUS）系统，用于实现血脑屏障（BBB）的短暂开放，从而提高药物向脑实质的递送效率。该系统主要由市售组件构成，并结合了X射线和生物发光成像（BLI）。所提出的模块化设计支持在高通量工作流程中使用多种成像模态进行治疗规划与评估。该系统可与更全面的高分辨率三维成像模态（如高分辨率磁共振成像或显微CT）联合使用，而在大部分研究中则采用二维成像模态，例如二维X射线和/或BLI。二维X射线和/或BLI不仅成本显著更低，而且由于各自的采集时间较短，非常适合大样本量的研究。本文所述的换能器适用于在脑部较深区域（f数为1.25）产生较大范围的血脑屏障开放（其尺度相当于小鼠脑大小）。我们已将该系统用于脑桥区域弥漫性生长的肿瘤研究^43,44。对于这些区域，需要对脑桥内包含整个肿瘤区域的大体积组织进行声孔效应处理。该模块化系统可轻松调整，适用于大脑幕上其他类型的脑肿瘤。在选择换能器类型时，应综合考虑其f数、焦距和频率。

总体设计相较于先前.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 mL 鲁尔锁注射器	Becton Dickinson	309628	Plastipak
19 G 针头	Terumo Agani	8AN1938R1
23 G 针头	Terumo Agani	8AN2316R1
3M Transpore 外科胶带	科学应用于生命	7000032707	或类似物
任意波形发生器	Siglent	未提供	SDG1025，25 MHz，125 Msa/s
自动立体定位	自制	未提供	立体定位仪的所有部件均为自制
布鲁克In-Vivo Xtreme	Bruker	未提供	包含软件
缓冲氯化钠溶液	B. Braun Melsungen AG	220/12257974/110
盐酸丁丙诺啡	Indivior UK Limited	无可用数据	0.324 mg
笼具环境丰富化：纸浆智能窝	生物服务	无可用数据
碳过滤器	Bickford	NC0111395	Omnicon f/air
陶瓷勺	无	未提供
棉签	未提供	无
D-荧光素钾盐	Gold Biotechnology	LUCK-1
乙醇	VUmc 药房	未提供	70%
伊文思蓝	Sigma Aldrich	E2129
Fresenius 氯化钠 0.9%	Fresenius Kabi	未提供	0.9% NaCl，1000 mL
Histoacryl	Braun Surgical	未提供	Histoacryl 0.5 mL
水听器	精密声学	无可用数据
胰岛素注射器	Becton Dickinson	324825/324826	0.5 mL 和 0.3 mL
异氟烷	TEVA Pharmachemie BV	8711218013196	250 mL
氯胺酮	Alfasan	未提供	10 %，10 mL
小鼠饲料：Teklad 全球 18% 蛋白质啮齿类动物饲料	Envigo	2918-11416M
Neoflon 导管	Becton Dickinson	391349	26 号针头，0.6 mm × 19 mm
示波器	是德科技	未提供	InfiniiVision DSOX024A
塑料管	Greiner bio-one	210261	50 mL
功率放大器	电子学 & Innovation Ltd	210L	Model 210L
前置放大器直流耦合器	精密声学	n..	序列号：DCPS94
剪刀	Sigma Aldrich	S3146-1EA	或类似物
赛拉嗪	AST Farma	未提供	2%
SonoVue 微泡	Bracco	无可用数据	8 µl/ml
无菌水	Fresenius Kabi	无可用数据	1000 mL
注射器	未提供	无可用数据	可以使用各种注射器
丁丙诺啡	Indivior UK limitd	未提供	0.3 mg/ml
传感器	精密声学	未提供	1 MHz
镊子	Sigma Aldrich	F4142-1EA	或类似物
超声耦合剂	Parker Laboratories Inc.	01-02	Aquasonic 100
Vidisic 凝胶	博士伦	无可用数据	10 g