需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

靶向神经元损伤实现脑环路的非侵入性断开

4.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/61271

⸱

2020年9月27日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Virginia, 2Department of Radiology, Stanford University, 3Department of Neurology, University of Virginia, 4Global Internship Program, Focused Ultrasound Foundation, 5Department of Medicine, University of Virginia, 6Image Guided Therapy, 7Department of Neurosurgery, University of Virginia, 8Center for Brain, Immunology, and Glia, University of Virginia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本实验方案的目的是提供一种在脑内产生非侵入性神经元损伤的方法。该方法利用磁共振引导聚焦超声（MRgFUS）以短暂且局灶性的方式打开血脑屏障，从而将循环中的神经毒素递送至脑实质。

摘要

手术干预在治疗某些药物难治性神经系统疾病方面可能非常有效。对于癫痫和运动障碍等具有明确神经环路机制的疾病，这一方法尤为适用。目前可用的手术方式虽然有效，但通常需要进行侵入性手术操作，可能导致非靶向组织的手术损伤。因此，若能拓展手术治疗手段，纳入一种既非侵入性又无神经毒性的技术，将具有重要价值。

本文介绍了一种以非侵入性方式在脑内产生局灶性神经元损伤的方法。该方法利用低强度聚焦超声联合静脉注射微泡，实现血脑屏障（BBB）的短暂且局灶性开放。在此短暂的血脑屏障开放期间，可将系统性给予的神经毒素靶向递送至特定脑区。喹啉酸（QA）通常无法透过血脑屏障，静脉或腹腔注射时耐受性良好；然而，当 QA 直接进入脑组织时，会对神经元产生毒性作用。该方法已在大鼠和小鼠中用于靶向特定脑区。在磁共振引导聚焦超声（MRgFUS）后，立即通过增强T1加权成像确认血脑屏障开放的成功。术后T2成像显示脑损伤局限于靶区，且可通过组织学技术在死后验证靶区内神经元的丢失。值得注意的是，注射生理盐水而非 QA 的动物虽表现出血脑屏障开放，但未出现损伤或神经元丢失。该方法被称为精确非侵入性脑内引导手术（Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery, PING），可能为治疗与神经环路异常相关的神经系统疾病提供一种非侵入性手段。

引言

该方法的目的是提供一种在脑部特定区域产生非侵入性神经元损伤的手段。开发此类方法的理论依据是中断参与神经系统疾病的神经环路。例如，手术在治疗某些药物难以控制的神经系统疾病方面可能非常有效，如耐药性癫痫（DRE）1。然而，现有的各种手术方式在避免对脑组织造成不希望的附带损伤方面均存在局限性。传统的切除性手术具有高度侵入性，可能带来出血、感染、血栓、中风、癫痫发作、脑肿胀以及神经损伤等风险2。相较于切除性手术，一些微创或非侵入性替代方案包括激光间质热疗和放射外科手术，这些方法也被证明在抑制DRE癫痫发作方面有效。最近，高强度聚焦超声（HIFU）产生的热损伤在减少癫痫发作方面显示出良好前景。HIFU是一种非侵入性技术；然而，由于存在对邻近颅骨区域的非靶向组织造成热损伤的风险，目前其治疗窗口仅限于脑部更中心的区域。尽管存在这些限制，手术的益处通常超过潜在风险。例如，尽管DRE手术可能导致脑部附带损伤，但其在抑制癫痫发作和改善生活质量方面的有益效果通常超过手术风险。

本文所述的方法——精确非侵入性颅内引导手术（Precise Intracerebral Non-invasive Guided surgery, PING）——旨在切断神经环路的同时，最大限度地减少对脑组织的附带损伤。该方法利用低强度聚焦超声结合静脉注射微泡，以开放血脑屏障（BBB），从而递送神经毒素。该方法不会在脑组织中产生热损伤3,4,5,6,7，且可利用血脑屏障开放的窗口期，将无法透过血脑屏障的化合物递送至脑实质。血脑屏障的开放是短暂的，并可通过磁共振成像引导实现靶向控制。在我们的研究中，已利用血脑屏障开放的窗口期，将循环中的神经毒素递送至大鼠和小鼠脑实质的靶向区域8,9。喹啉酸（Quinolinic acid）是一种神经毒素，静脉注射10、动脉内注射10或腹腔注射8,9,11时耐受性良好。喹啉酸缺乏毒性表现的原因在于其难以透过血脑屏障，已有报道指出其通透性可忽略不计10。相比之下，将喹啉酸直接注射至脑实质可导致神经元损伤，而邻近的轴突则得以保留12,13。因此，当循环中的喹啉酸通过靶向开放的血脑屏障进入脑实质时，即可引发神经元死亡8,9。本方法因而能够以精确靶向且非侵入的方式，实现局灶性神经元丢失。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本文所述所有方法均已获得弗吉尼亚大学动物护理与使用委员会的批准。

1. 试剂的准备

  1. 手术当天，准备 6.0 mL 可注射的喹啉酸（QA）。将 450 mg QA 溶解于 4.0 mL 1.0 N NaOH 中，加入 0.6 mL 10x PBS，调节 pH 至 7.4，再用 dH2O 定容至终体积 6.0 mL。经 0.22 µm 注射器滤器过滤。该溶液在 4 °C 下可稳定保存 2 周。
  2. 通过探头超声将十氟丁烷气体在生理盐水中制备成微泡水分散液，并以 DSPC/PEG 硬脂酸盐单层壳结构进行稳定12。
  3. 在常重力条件下通过浮选法对微泡进行粒径筛选。使用 Multisizer III 计数器通过电阻脉冲感应法测定微泡浓度和粒径分布。微泡浓度应为 6 × 108/mL，平均粒径约为 2 μm。通过浮选排阻/分离法去除较大的气泡。
  4. 或者，可直接购买市售的微泡制剂。

2. 动物准备

  1. 动物（大鼠或小鼠）送达后需适应环境 3 天。本实验所用动物为 Sprague-Dawley 大鼠（5–6 周龄）或端脑内结构异位（tish）大鼠（本单位饲养种群）。
  2. 将动物饲养于 12 小时光照：12 小时黑暗的循环环境中。
  3. 记录动物体重。该信息在实验全程中均至关重要。
  4. 在聚焦超声（FUS）处理前一天获取 T2 加权磁共振图像，以建立术前基线影像。T2 成像参数如下：重复时间/回波时间 [TR/TE] = 3,000/138 毫秒，信号平均次数为 3 次，视野 = 29 x 45 mm2，矩阵大小 = 125 x 192，层厚 = 0.23 mm。
  5. 使用异氟烷对动物进行麻醉（诱导浓度 4%，维持浓度 2%）。通过夹趾反射确认麻醉深度。向眼部涂抹眼用软膏。
  6. 剃除动物头皮毛发，并使用脱毛膏清除残留毛发。
  7. 通过尾静脉导管输注微泡、对比剂及 QA。导管由一段 PE10 管路连接 30 G × ½ 英寸针头构成。导管内预留一支含肝素化生理盐水的 1 mL 注射器，供输注时取下和重新连接使用。

3. MRI 和 PING 操作流程

  1. 在梯度强度为 600 mT/m/ms 的 7 T 磁共振成像（MRI）设备上进行 MRI 扫描（图 1 和 图 2）。使用集成于聚焦超声（FUS）系统中的表面线圈进行 MRI 数据采集。
    注：本实验所用的 FUS 系统包含三个部分：(i) 激声系统为一个与 MRI 兼容的预聚焦式 8 元环形阵列、1.5 MHz 换能器（球面半径 = 20 mm ± 2 mm，有效直径 = 25 mm（f 数 = 0.8），电声转换效率达 80%），连接至相控阵发生器和射频功率放大器；(ii) 一个与 MRI 兼容的电动定位平台，用于在前后方向和中线-侧向方向移动换能器；(iii) 一个 Thermoguide 工作站，用于控制激声的递送，包括通过相位调制实现电子聚焦以调节焦点深度（图 2）。
  2. 将麻醉后的动物以俯卧位放置于 MRI 兼容 FUS 系统的线圈滑橇组件上（图 1）。使用滑橇支架上的门齿杆和耳杆固定动物。
  3. 在湿润的头皮上涂抹超声耦合凝胶；确保无气泡存在后，将换能器组件中水循环部分的膜屏障置于动物颅骨上方，并尽可能将换能器组件以平行于颅骨板的平面方向下压。将换能器的隔膜牢固地贴合在动物剃毛后的头皮上，正对颅骨板区域。
  4. 使用手术胶带将气动传感器固定于动物体表，以监测呼吸。将气动传感器置于左侧下部肋缘区域。
  5. 将带有线圈、滑橇及动物的 FUS 臂组件推入 7T MRI 设备中（图 1）。
  6. 运行 T2 定位序列，以确定换能器组件相对于动物头部的大致物理位置，并根据需要进行机械调整（图 2）。T2 成像参数如下：重复时间/回波时间 [TR/TE] = 3,000/138 毫秒，信号平均次数 = 3，视野 = 29 x 45 mm2，矩阵大小 = 125 x 192，层厚 = 0.23 mm。本方案中通常不使用温度监测。
  7. 获取 T2 图像以进一步优化换能器定位。利用软件的靶向功能，精确定义换能器位置并设定激声的焦点位置。T2 成像参数如下：重复时间/回波时间 [TR/TE] = 3,000/138 毫秒，信号平均次数 = 3，视野 = 29 x 45 mm2，矩阵大小 = 125 x 192，层厚 = 0.23 mm。
  8. 在激声前立即通过尾静脉注射 300 μL/kg 的微泡制剂14。
  9. 使用 1.5 MHz 换能器产生激声（30 ms 波包，3% 占空比，1 Hz 脉冲重复频率，每次激声持续 240 秒）。
  10. 激声后立即通过尾静脉注射钆双胺对比剂，随后进行 T1 加权增强扫描，以确认血脑屏障（BBB）的开放情况及靶向准确性。T1 加权成像参数如下：TR/TE = 900/12 毫秒，信号平均次数 = 2，视野 = 24 x 30 mm2，矩阵大小 = 208 x 256，层厚 = 0.7 mm。通常仅进行一次 T1 扫描。
  11. 将 FUS 臂和滑橇从 MRI 设备中移出，将动物置于设定为 40 °C 的加热垫上，并持续维持 2% 异氟烷麻醉。
  12. 从激声后 30 分钟开始，使用注射泵以 16.8 µL/min 的速率通过尾静脉输注 QA（储备液浓度为 75 mg/mL），持续 1 小时，以达到最终剂量 225 mg/kg（用生理盐水定容至 1.0 mL）。
  13. 输注完成后停止麻醉，继续将动物置于加热垫上直至其清醒。将动物放入笼中，并在术后数小时内每 15 分钟进行一次常规活动状态检查。
  14. 将动物送回动物饲养室，并在术后第一天内每 6 小时检查一次，观察是否有痛苦表现或异常行为。
  15. 激声后一天，进行 T2 加权磁共振成像，以评估激声区域是否存在损伤。T2 成像参数如下：重复时间/回波时间 [TR/TE] = 3,000/138 毫秒，信号平均次数 = 3，视野 = 29 x 45 mm2，矩阵大小 = 125 x 192，层厚 = 0.23 mm。通过观察高信号区域判断是否存在可能的组织损伤或水肿。

4. 神经元丢失的死后分析

  1. 超声处理后，留出4–5天的存活期，以便使用Fluoro-Jade组织化学法评估神经元丢失。
  2. 用异氟烷深度麻醉动物，随后经心脏灌注0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4），接着灌注含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲液以实施安乐死。
  3. 将脑组织从颅骨中取出，并在4%多聚甲醛中后固定2天。
  4. 将脑组织浸入30%蔗糖溶液中进行冷冻保护，然后使用恒冷切片机切成20–30 μm厚的切片。
  5. 将恒冷切片贴附于明胶包被的载玻片上，室温下晾干过夜。
  6. 用蒸馏水重新水化载玻片，然后依次通过浓度递增的乙醇进行脱水；脱水完成后，再依次通过浓度递减的乙醇重新水化。
  7. 将载玻片转移至含0.06%高锰酸钾的溶液中，在旋转摇床上避光孵育15分钟。
  8. 用蒸馏水冲洗载玻片1分钟，然后转移至含0.001% Fluoro-Jade B的0.1%乙酸溶液中，在室温下轻柔振荡孵育30分钟。随后用蒸馏水冲洗三次，每次1分钟。
  9. 将载玻片在载玻片加热板上烘干，再在二甲苯中平衡3分钟，最后使用DPX封片介质封片。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本部分描述了PING对位于新皮质发育不良区域中神经元的作用。组织发育不良是药物难治性癫痫患者脑部的常见特征，手术切除致痫性发育不良组织可有效控制癫痫发作15。因此，明确PING对发育不良脑组织的影响具有重要意义。为研究这一问题，选择了遗传性皮质发育不良的大鼠模型——tish大鼠，因为tish大鼠脑内存在发育不良组织（皮层下带状异位），位于结构正常的新皮质下方（图3）16。该发育不良区域及其上方的新皮质均含有功能性的神经元，并表现出典型的新皮质连接特性17,18。

针对Tish大鼠脑内异位组织的PING治疗在诱导畸形神经元局灶性丢失方面是有效的（图3）。PING处理后一天获取的T2加权成像显示高信号区域，与靶向超声区域的组织损伤表现一致。PING处理后5天...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

PING 方法旨在产生非侵入性、靶向性的神经元损伤。该方法建立在聚焦超声领域日益坚实且不断扩展的研究基础之上3,4,5,6,7。通过暂时性开放血脑屏障（BBB），实现对脑实质特定区域的局灶性通达，从而为递送多种通常无法进入大脑的物质提供了途径。目前这一机会主要被用于中枢递送那些BBB通透性较差的治疗剂。PING 方法则以不同的方式利用了这一机会，即递送一种神经毒素，最终目的是破坏导致神经功能障碍的神经环路。异常的神经环路是外科干预以减轻某些神经系统疾病影响的有效靶点2,15。PING 方法的长期目标是增强当前可用于切断导致神经功能障碍环路的技术手段。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Rene Jack Roy 在磁共振成像领域提供的出色技术支持。本研究由美国国立卫生研究院（R01 NS102194 项目资助 KSL，R01 CA217953-01 项目资助 MW）、Chester 基金（KSL）以及聚焦超声基金会（KSL 和 JW）提供资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
7T-ClinScan MRI 系统布鲁克生物自旋公司，埃廷根，德国MR图像采集
声学凝胶Litho CLEAR11-601高粘度声学耦合凝胶
DPX 封片介质电子显微镜科学公司13512基于树脂的盖玻片封固剂
氟乳玉BEDM MilliporeAG310高亲和力变性神经元染色法
Fluovac 麻醉吸附器哈佛仪器34-0388有机麻醉废气清除剂
FUS 系统影像引导治疗，佩萨克，法国LabFUS磁共振兼容的小动物聚焦超声系统
钆双胺GE Healthcare AS，挪威奥斯陆Omniscan磁共振造影剂
肝素SAGENTNDC2502140010抗凝剂
30G × 1/2 英寸皮下注射针头Becton-Dickinson26027尾静脉插管
胰岛素注射器 28G1/2（1 ml）EXEL26027尾静脉导管注射给药
异氟烷雾化器SurgiVetVCT302麻醉给药
异氟烷Henry ScheinNDC1169567762麻醉
KMnO4Sigma223468荧光素B染色中使用的试剂
微泡内部制作：A. Klibanov305106血脑屏障破坏剂
微泡（商业来源）Lantheus Medical Imaging，美国马萨诸塞州北比勒里卡Definity 微泡血脑屏障破坏剂
监测 &和门控系统小型动物实验仪器Model 1030呼吸监测
Multisizer 3 库尔特计数器贝克曼库尔特，佛罗里达州海厄利亚Multisizer 3用于测定微泡的平均尺寸
Optixcare 眼部润滑剂CLC MEDICA，加拿大安大略省11611角膜保护剂-眼用润滑剂
PE10导管Becton-Dickinson427401尾静脉导管组件
喹啉酸Santa Cruz Biotechnology，达拉斯，德克萨斯州CAS 89-00-9神经毒素
Sprague-Dawley 大鼠Taconic BiosciencesSD-M大鼠模型
注射泵卡内基医学CMA 100喹啉酸的可控递送
Thermoguide 软件影像引导治疗，佩萨克，法国Thermoguide驱动实验室FUS系统
蒂什大鼠内部品系大鼠模型
Veet 脱毛膏Reckitt Benckiser去除头皮毛发

参考文献

  1. Wiebe, S., Eliasziw, M., Matijevic, S. I. Changes in quality of life in epilepsy: How large must they be to be real. Epilepsia. 42, 113-118 (2001).
  2. McClelland, S., Guo, H., Okuyemi, K. S. Population-based analysis of morbidity and mortality following surgery for intractable temporal lobe epilepsy in the United States. Archives of Neurology. 68, 725-729 (2011).
  3. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhotseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220, 640-646 (2001).
  4. McDannold, N., Vykhodtseva, N., Raymond, S., Jolesz, F. A., Hynynen, K. MRI-guided targeted blood-brain barrier disruption with focused ultrasound: histological findings in rabbits. Ultrasound in Medicine & Biology. 31, 1527-1537 (2005).
  5. Park, J., Zhang, Y., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A., McDannold, N. J. The kinetics of blood brain barrier permeability and targeted doxorubicin delivery into brain induced by focused ultrasound. Journal of Controlled Release. 162 (1), 134-142 (2012).
  6. Sheikov, N., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F., Hynynen, K. Cellular mechanisms of the blood-brain barrier opening induced by ultrasound in the presence of microbubbles. Ultrasound in Medicine & Biology. 30, 979-989 (2004).
  7. Vlachos, F., Tung, Y. S., Konofagou, E. E. Permeability assessment of the focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using dynamic contrast-enhanced MRI. Physics in Medicine and Biology. 55 (18), 5451-5466 (2010).
  8. Zhang, Y., et al. focal disconnection of brain circuitry using magnetic resonance-guided low-intensity focused ultrasound to deliver a Neurotoxin. Ultrasound in Medicine & Biology. 42 (9), 2261-2269 (2016).
  9. Zhang, Y., et al. Testing different combinations of acoustic pressure and doses of quinolinic acid to induce focal-neuron loss in mice using transcranial low-intensity focused ultrasound. Ultrasound in Medicine & Biology. 45, 129-136 (2018).
  10. Foster, A. C., Miller, L. P., Oldendorf, W. H., Schwarcz, R. Studies on the disposition of quinolinic acid after intracerebral or systemic administration in the rat. Experimental Neurology. 84, 428-440 (1984).
  11. Beskid, M., Różycka, Z., Taraszewska, A. Quinolinic acid: effect on the nucleus arcuatus of the hypothalamus in the rat (ultrastructural evidence). Experimental and Toxicologic Pathology. 49, 477-481 (1997).
  12. Schwarcz, R., Köhler, C. Differential vulnerability of central neurons of the rat to quinolinic acid. Neuroscience Letters. 38, 85-90 (1983).
  13. Schwarcz, R., Whetsell, W. O., Mangano, R. M. Quinolinic acid: an endogenous metabolite that produces axon-sparing lesions in rat brain. Science. 219, New York, N.Y. 316-318 (1983).
  14. Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
  15. Agari, T., et al. Successful treatment of epilepsy by resection of periventricular nodular heterotopia. Acta Medica Okayama. 66 (6), 487-492 (2012).
  16. Lee, K. S., et al. A genetic animal model of human neocortical heterotopia associated with seizures. The Journal of Neuroscience. 17 (16), 6236-6242 (1997).
  17. Schottler, F., Couture, D., Rao, A., Kahn, H., Lee, K. S. Subcortical connections of normotopic and heterotopic neurons in sensory and motor cortices of the tish mutant rat. The Journal of Comparative Neurology. 395 (1), 29-42 (1998).
  18. Schottler, F., et al. Normotopic and heterotopic cortical representations of mystacial vibrissae in rats with subcortical band heterotopia. Neuroscience. 108 (2), 217-235 (2001).
  19. Zhang, Y., et al. Effects of non-invasive, targeted, neuronal lesions on seizures in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Ultrasound in Medicine and Biology. 46, 1224-1234 (2020).
  20. Holmes, E. W. Determination of serum kynurenine and hepatic tryptophan dioxygenase activity by high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 518-525 (1988).
  21. Shibata, K., Ohno, T., Sano, M., Fukuwatari, T. The urinary ratio of 3-hydroxykynurenine/3-hydroxyanthranilic acid is an index of predicting the adverse effects of D-trytophan in rats. Journal of Nutritional Science and Vitaminology. 60, 261-268 (2014).
  22. Aubry, J. -F., Tanter, M. MR-guided transcranial focused ultrasound. Therapeutic Ultrasound. , 97-111 (2016).
  23. Elias, W. J., et al. A Randomized trial of focused ultrasound thalamotomy for essential tremor. New England Journal of Medicine. 375, 730-739 (2016).
  24. Ghanouni, P., et al. Transcranial MR-guided focused ultrasound: a review of the technology and neuro applications. American Journal of Roentgenology. 205, 150-159 (2015).
  25. Martin, E., Jeanmonod, D., Morel, A., Zadicario, E., Werner, B. High-intensity focused ultrasound for noninvasive functional neurosurgery. Annals of Neurology. 66, 858-861 (2009).
  26. Monteith, S., et al. Transcranial magnetic resonance-guided focused ultrasound for temporal lobe epilepsy: a laboratory feasibility study. Journal of Neurosurgery. 12, 1-8 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

MRgFUS T2
靶向神经元损伤实现脑环路的非侵入性断开
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。