通过颅内注射和磁共振成像对大脑转移进行建模

Summary

颅内脑转移建模由于无法以精确和及时的方法监测肿瘤大小和治疗反应而变得复杂。该方法将颅内肿瘤注射与磁共振成像分析相结合，结合后，培养精确一致的注射，增强动物监测，并精确测量肿瘤体积。

Abstract

癌症的转移性传播是疾病进展、侵略性癌症亚型和/或晚期诊断的不幸后果。脑转移是特别具有破坏性的，难以治疗，并造成不良的预后。虽然美国脑转移的准确发生率仍然难以估计，但随着颅外疗法在治疗癌症方面继续变得更加有效，这种发病率可能会增加。因此，有必要确定并开发新的治疗方法，以治疗转移在这个网站。为此，癌细胞颅内注射已成为模拟脑转移的成熟方法。以前，无法直接测量肿瘤生长一直是该模型的技术障碍;然而，增加小动物成像模式（如磁共振成像（MRI）的可用性和质量，极大地提高了监测肿瘤随时间增长和推断实验期间大脑内变化的能力。在这里，在颅内注射莫林乳腺肿瘤细胞到免疫功能小鼠，其次是MRI证明。提出的注射方法采用异氟兰麻醉和立体定向设置，采用数字控制、自动钻头和针头注射，提高精度，减少技术误差。MRI 是随着时间的推移测量使用 9.4 特斯拉仪器在俄亥俄州立大学詹姆斯综合癌症中心小动物成像共享资源。肿瘤体积测量通过使用 ImageJ 在每个时间点进行演示。总体而言，这种颅内注射方法允许精确的注射、日常监测和精确的肿瘤体积测量，这极大地增强了该模型系统的实用性，以测试大脑转移驱动因素的新假设。

Introduction

脑转移是成人原发中枢神经系统^肿瘤1的10倍，而且几乎每一种实体肿瘤类型中都有肺癌、乳腺癌、黑色素瘤，发病率^最高2。无论原发性肿瘤位点如何，大脑转移的发展导致预后不良，通常与认知衰退、持续性头痛、癫痫发作、行为和/或性格变化^{,1、3、4、534,相关}。¹在乳腺癌方面，在预防和治疗该疾病方面有许多进展。然而，30%的乳腺癌诊断妇女将继续发展转移，和那些有第四阶段疾病，约7%（SEER 2010-2013）有脑转移^6,6，7。目前脑转移的治疗方案包括手术切除、立体定向放射外科和/或全脑放射治疗。然而，即使这种积极的治疗，这些患者的中位数生存是短短的8-11个月^{7,7，8，9。,9}这些严峻的统计数字有力地支持了确定和实施新颖、有效的治疗策略。因此，与转移至大脑的所有癌症一样，在实验室中正确模拟与乳腺癌相关的脑转移 （BCBM） 以确保该领域的显著进展至关重要。

迄今为止，研究人员已经利用各种方法研究转移大脑的机制，每种机制都有其独特的^{优点和局限性,。}实验转移方法，如尾静脉和心内注射将肿瘤细胞扩散到全身，并可能导致其他转移部位的巨大肿瘤负担，具体取决于注射的细胞。如果这些结果被具体研究到大脑的转移，那么这些结果会混淆。胡萝卜内动脉注射方法是有利的，因为它特别针对肿瘤细胞的大脑播种，但是有限的，因为它可能在技术上很难执行。正畸原发肿瘤切除通常被认为是最临床相关的转移模型，因为它重述了整个转移级联。然而，这种方法涉及长时间等待自发转移发生，大脑转移率显著低于其他转移位点，如淋巴结，肺和肝脏。通常，动物必须从研究中去除由于肿瘤负担在这些其他转移位点之前，大脑转移的发展。其他涉及脑热带细胞系的方法在转移至大脑时是有效的;然而，这些模型是有限的，因为它们需要时间来发展，并经常失去他们的tropism与传播。^,鉴于这些局限性，研究人员经常使用颅内注射方法，以不同方法^{,,,,15、16、17、18、19,}等不同方法^{对癌症转移11、12、13、1418进行模型模型}。^{121314 1617}人们承认，这种方法同样有局限性，最重要的是，它不允许调查早期转移步骤，包括从原发性肿瘤中进，通过血脑屏障的切开，以及在大脑内建立。然而，它确实允许研究人员测试（1）哪些肿瘤衍生因素调解大脑内的生长（例如，肿瘤细胞中致癌因子的基因操作），（2）转移性微环境的变化如何改变本部位的癌症生长（例如，转基因小鼠与改变的频基成分的比较）和（3）新治疗策略对既定病变生长的有效性。

鉴于颅内注射模型的潜在效用，绝对有必要减少注射过程中的技术误差，并精确监测肿瘤的生长。本文描述的方法包括连续注射气体麻醉，并使用立体定向钻和注射支架将肿瘤细胞直接植入脑中。管理气体麻醉剂可以微调麻醉的深度和长度，并确保快速和顺利的恢复。数字控制的自动钻头和针注射系统提高了喷注现场的精度，并减少了钻孔和手注射方法经常产生的技术错误。磁共振成像（MRI）的使用进一步提高了监测肿瘤生长、肿瘤体积、组织反应、肿瘤坏死和治疗反应的精度。MRI是软组织^20、21,的^成像方式。这种成像技术不使用电离辐射，比计算机断层扫描 （CT） 更可取，尤其是在研究过程中进行多次成像。MRI 具有比 CT 或超声波成像 （USG） 更大的可用软组织对比度范围，并更详细地呈现解剖学。它更敏感和具体的大脑本身的异常。MRI 可以在任何成像平面上执行，而无需像 2D USG 或 2D 光学成像那样以物理方式移动主体。重要的是要提一下，头骨不像其他成像方式那样衰减MRI信号。MRI 允许评估可能被 CT 或 USG 中骨骼中的伪影遮盖的结构。另一个优点是，有许多对比剂可用于MRI，这增强了病变检测极限，具有相对较低的毒性或副作用。重要的是，MRI 允许实时监测，不像在尸检时进行组织学评估，而肿瘤体积的破译是有限的。其他成像模式，如生物发光成像，确实对早期肿瘤的检测和监测是有效的;然而，这种方法需要细胞系的遗传处理（例如，荧光酶/GFP标记），并且不允许进行体积测量。MRI 是进一步有利的，因为它反映了患者监测和下游体积分析的 MR 图像已知与肿瘤大小在尸检²²强烈相关。使用 MRI 筛查进行串行监测也会增加神经损伤的临床监测（如果出现）。

总的来说，立体定向颅内肿瘤注射方法，以及连续MRI，使我们能够产生可靠、可预测和可测量的结果，以研究癌症中脑转移的机制。

Protocol

本文描述的所有方法均获得俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（P.I.Gina Sizemore;协议#2007A0120）。所有啮齿动物生存手术的 IACUC 政策都遵循，包括使用无菌技术、用品、仪器，以及毛皮去除和切口部位的无菌制备。

1. 乳腺癌细胞颅内注射

注:本文描述的方法利用了从原发 MMTV-PyMT 肿瘤23衍生出的DB7乳腺肿瘤^细胞系。先前的研究已经确定DB7细胞的颅内注射作为BBM的模型，其组织学模仿人类疾病^12。重要的是，免疫能力FVB/N小鼠用于此模型，因为DB7细胞是从这种小鼠菌株派生的。由于这是一个乳腺癌模型，成年雌性小鼠用于这些研究。

1. 准备单元格。
   1. 在无菌罩中，使用标准技术从细胞培养板中吸气介质。
   2. 使用 1x DPBS 清洗细胞，并使用制造商的协议进行尝试。
   3. 添加适当体积的含 FBS 介质，以停止三辛反应，并使用血细胞计或首选方法确定细胞的浓度。
   4. 在 300 x g 下颗粒 细胞，在 4 °C 下 4 分钟。
   5. 吸气介质，用 1x DPBS 清洗，在 300 x g 下重新 旋转 ，在 4 °C 下旋转 4 分钟。
   6. 将1x DPBS中的细胞重新注入到适当的浓度，每注射量约50，000个细胞，2μL。
      注:细胞号取决于线路的侵略性，需要由调查员确定。我们经常使用2μL，但使用卷<6μL报告15，16，17，18，19。^{15,16,17,18,19}低体积对于保持精度至关重要。
   7. 将重新注入的细胞放在冰上，直到注射以保持活力。
2. 准备小鼠做手术。
   1. 对于有毛皮的老鼠:通过脱毛霜/皮毛或剃须，从化妆水皮中去除毛皮。手术前24-48小时内完成手术，因为执行此步骤太接近手术可能会干扰皮肤质量和缝合强度。
      注:由于研究转移性乳腺癌（一种主要为女性疾病），使用重约25克的雌性FVB/N小鼠。
   2. 管理由 IACUC 确定并参加兽医的镇痛药:布丙诺啡 SR-LAB 皮下注射（0.05-0.1 毫克/千克剂量， 丁丙诺啡库存:0.5毫克/mL，剂量为0.0025-0.088 mL）至少24小时手术前提供高达72小时镇痛，可重复48-72小时后，第一次剂量，如果需要。还要在手术前至少24-48小时服用NSAIDs（饮用水中20%布洛芬，例如1mg/5 mL），术后持续2-7天，以提供至少72小时术后镇痛。
      注:在俄亥俄州立大学，布丙诺啡SR-LAB由大学实验室动物资源兽医工作人员管理，因为它是一种受控物质。
3. 为手术准备立体定向装置。
   1. 打开所有麻醉机、数字 Vernier 秤和数字喷油器。
      注:所有手术工具应在手术前进行充分清洁和消毒。
   2. 在生物安全柜中使用带感应室附件的麻醉机（图1A）。
   3. 确保麻醉机的所有管子都连接到立体定向框架（图1B，内嵌1C），管上的夹子对于使用的所有单元都打开。关闭管子上的任何夹子，这些夹子将放在不用于手术的立体定向框架上。
   4. 根据鼠标重量（例如，25 g 动物重量:鼻锥流速 34 mL/min）将麻醉机设置为制造商推荐的鼻锥流速。
      注:此立体定向设置中包含的头架仅推荐给成年小鼠。确保遵循立体声教学设置中包含的制造商建议。
   5. 确保注射器中预填充的适当麻醉剂（例如异氟兰）附着在麻醉机上（图1B）。
      注:过度吸附注射器会导致手术期间将太多的麻醉送到小鼠体内，并导致麻醉过量。
   6. 通过扭曲舞台锁、将钻头位适配器和 1 mm 钻头插入每个钻头来准备钻头，然后通过手动拧紧钻头来锁定钻头。
   7. 将钻头连接到立体定向帧（图 1C）。
   8. 用 5 个交替洗涤 1x DPBS 的汉密尔顿注射器，然后用 70% 乙醇清洁，然后在 1x DPBS 中再次清洁。放在一边，直到动物准备注射。
   9. 将数字喷油器设置为 0.4 μL/min 和 2 μL 的目标。这种速率和体积允许缓慢地将肿瘤细胞引入大脑，从而减少压力和相关损伤。
4. 将鼠标放在立体定向帧上。
   1. 使用上述感应室麻醉小鼠（例如异氟兰）。
   2. 在整个手术过程中，将小鼠保持深麻醉面。机器麻醉的百分比取决于多种因素，包括:流速、刺激程度和体温。通过评估有节奏的呼吸（动物没有喘气），在整个手术过程中经常监测小鼠的麻醉深度;缺乏眼睑反射（用棉尖施用器刺激眼睑时飘动）;和缺乏头趾捏（在捏着趾的有毒刺激下断肢）。
      注:不同菌株的小鼠对麻醉有不同的反应。
   3. 小鼠处于适当的深麻醉面后，将小鼠转移到立体定向单元。当鼠标在立体定向机器上时，使用加热垫以保持体温和适当的麻醉面。
      注:为了实现低调，我们使用空气激活的暖手器放置在倒置移液器尖端盒内（图 1D中的鼠标提升盒）。
   4. 打开鼠标的嘴，将牙齿放在位于立体定向框架鼻片上的嘴杆的槽中（图2A）。将鼻锥滑过鼠标的鼻子/嘴（图2B）。
      1. 将头部水平的老鼠放在嘴栏上。用棉尖施用器的钝端轻轻张开嘴，然后滑入到位。确保鼻锥完全超过鼠标的鼻子，否则麻醉不会正确传递。如果牙齿不位于此凹槽内（插入图 2A），鼻锥不会与鼻子接触。
   5. 使用无菌棉签，将眼睛润滑剂放在每个小鼠的眼睛上。眼部润滑剂的应用可减轻角膜的干燥，减少角膜损伤和与角膜创伤相关的术后并发症的发生。
   6. 通过将左耳杆压在左耳的中拉器上，用立体图框上的螺钉将其锁定到位，从而稳定鼠标的头骨。然后将右耳杆滑到右耳的中拉器上，拧紧立体定向框架（图 2B）。
      注:放置耳条时，确保鼠标头部平直。如果头部弯曲或倾斜，注射将在大脑中不正确的位置。耳杆应收紧，直到头骨在刺激时通过适度的手动探测固定。
5. 制作一个日历窗口。
   1. 准备和清洁头皮与3倍交替通过每个β丁溶液和70%乙醇。由于手术地点靠近眼睛，在手术磨砂上使用贝塔丁溶液。
   2. 使用无菌手术刀，沿着颅骨的中位线（沿着缝合线）通过皮肤进行3毫米切口。切口的出血应该最小。如果发生这种情况，使用无菌棉尖施用器在出血现场施加一致、坚定的压力，持续 >30 秒。
   3. 识别并定向垂直于啤酒的钻头（图2C），确保将数字Vernier刻度重置为零。
   4. 将钻头 2 mm 横向移动到下垂缝合线，将钻头向前移动 1 mm 至日冕缝合线（图 2C）。为可重复性，确保所有动物的下垂缝合线左侧或右侧的位置保持一致。
   5. 将钻头转动到最高速度。确保皮肤远离钻头，以避免旋转位造成组织损伤，并小心地将钻头启动到头骨上。钻一个大约 0.5 mm 深的孔，通过钙化，导致钙变窗口。小心不要把钻头降得太远，否则它会钻进大脑。在钻头运动时将无菌盐水滴在钻孔现场，可以抵消机器产生的任何热量，这些热量可能会对周围组织造成热损伤。
   6. 制作卡路里窗口后，小心地升起钻头并将其从立体定向框架中拆下。
   7. 使用 70% 乙醇清洁钻头，如果再次使用，请放在一边。如果没有，则去除钻头和 70% 乙醇中的潜水。
6. 将癌细胞注入大脑
   1. 将自动喷油器单元连接到立体定向装置（图 1D）。
   2. 在干净的汉密尔顿注射器中拉起 >2 μL 的细胞，在 1x DPBS 中彻底重新注入。在填充注射器之前，请务必立即重新注入细胞，以减少团块形成，并确保细胞浆质均匀。最好拉起 6-8μL 的电池体积，以确保没有气囊/气泡。
   3. 将 Hamilton 注射器放在喷油器装置上，通过将少量体积分配到一次性无菌窗帘上，将针头用于注射，以确保喷油器正常工作。用棉尖施用器用 70% 乙醇擦拭注射器（图 1D，内嵌）。这可去除针轴外管中的肿瘤细胞，降低肿瘤细胞沿注射区播种的风险。
   4. 将针尖与钙化窗口中心对齐，几乎接触裸露的脑膜。
   5. 将数字Vernier比例重置为零。
   6. 慢慢地将针头插入3毫米的深度进入大脑，让针头在大脑中保持至少60秒，然后再继续。这个时间框架允许大脑帕伦奇玛在针头周围一致，从而减少背部压力和肿瘤细胞沿着针道的潜在驱逐。
   7. 选择 喷 油器屏幕上的"运行"，开始将电池传递到喷射部位。注入此卷大约需要 5 分钟。此步骤的长时间是减少注射力对脑筋造成的二次损伤。
   8. 注射方案完成后，让针头在大脑中至少休息3分钟，再次让大脑帕伦奇玛适应注射。
   9. 至少3分钟后，以0.75毫米/分钟的速度从大脑中抬起针头。以极其缓慢和一致的方式进行此工作，以减少背压和肿瘤追踪针头。
   10. 针头离开大脑后，小心地从喷油器中取出汉密尔顿注射器并清洁，如步骤 1.2.8 中所述。
   11. 使用无菌棉签将温暖的骨蜡涂抹到钙质窗口。骨蜡作为物理屏障，使肿瘤留在头骨内。
   12. 关闭切口（例如，5-0 PDS 可溶解缝合线在一个简单的中断模式或缝合夹，以外科医生最舒适的哪一个）。
   13. 停止麻醉，通过解锁和滑出耳杆、将鼻锥从鼠标上滑下来，以及将牙齿从嘴杆上拔掉，将鼠标从仪器上取下。
   14. 将鼠标放在一个干净的笼子中，该笼子位于 37°C 的加热器上，以便恢复。在恢复过程中监测小鼠，通常在麻醉停止后10-15分钟进行。
   15. 恢复鼠标后，监控由主机机构的 IACUC 确定的早期删除标准。

2. 磁共振成像

1. 在成像前24 10-20分钟通过标准内丙酮注射²⁴ 10-20分钟，对小鼠施用基于Gadolinium的对比剂（100 μL/20 g体重小鼠0.1 M MultiHance）。然后使用与 95% O₂ 和 5% CO_2（ 即提供的房间空气气体）混合的吸入麻醉剂（例如异氟）的感应室进行麻醉。
2. 将鼠标放在加热支架上以保持体温。用耳塞和咬杆固定头部，并在配备鼠标脑表面线圈的 9.4 T 磁铁中放置支架。在成像期间保持麻醉，研究通常需要每只鼠标约20分钟。使用气动枕头和小型动物监测系统在整个过程中监测呼吸速率和心率（±70 bpm）。
3. 获取本地化图像，然后使用 T2 加权 RARE 序列（TR = 3500-4228 ms，TE=12 ms，RARE 因子 = 8， FOV=2.0 x 2.0 厘米，矩阵大小 = 256 x 256，1 mm 或 0.5 mm 切片厚度，NA=2-4，15-30 连续切片）和后加多利尼姆基对比 T1 加权稀有序列（TR = 1200 ms，TE=7.5 ms，稀有因子 = 4，FOV=2.0 x 2.0 厘米，矩阵尺寸 = 256 x 256，1 mm 或 0.5 mm 切片厚度，NA=2-4，15-30 连续切片）。
4. 成像后，将鼠标放在一个温度为 37 °C 的加热器上的笼子中，以进行恢复。

3. 体积肿瘤测量

1. 获得总肿瘤体积
   1. 在 ImageJ 中打开 MRI DICOM 数据文件，这是一个图像处理软件，可通过国家卫生研究院^{（https://imagej.nih.gov/ij/） 25 免费下载}。
      注:ImageJ 允许查看 DICOM 文件，这是利用嵌入像素尺寸进行肿瘤体积计算所需的（请参阅图像，可根据需要设置"长度单位"的属性（例如 mm）。
   2. 使用 "手绘选择 "工具在肿瘤周围绘制轮廓。在黑暗的房间里执行这些选择，以提高可见性。不要调整亮度/对比度以保持会话之间的一致性。
   3. 在"分析"选项卡下，选择"度量"以获取所选区域的区域。如果在步骤 3.1.1. 中选择了毫米单位，则区域将以立方毫米为单位。如果需要，请通过选择ctrl+D 嵌入手绘选择。通过"编辑" 更改输出颜色|选项|颜色。将图像转换为 RGB 图像（图像|类型|RGB 颜色）在保存为.tif之前。
   4. 继续测量单个鼠标的所有含肿瘤切片，并复制值到适当的数据分析软件程序（例如，Microsoft Excel 或 GraphPad 棱镜）。
   5. 从每个切片的面积相和，以获得总肿瘤体积。确保根据切片厚度（面积/厚度）校正区域。
   6. 完成步骤 3.1.1.-3.1.5。直到所有的老鼠都有总的肿瘤体积鉴于概述肿瘤的主观性，如果采用相同方法重复多次并平均用于减少技术误差，则是理想的选择。
   7. 要设置比例条，请打开 DICOM 数据文件，然后转到 "分析 | " 工具 | 缩放栏。由于尺寸已嵌入到 DICOM 文件中，只需选择所需的长度/宽度。隐藏到 RGB 图像（图像 | 类型 | RGB 颜色）在保存为.tif之前。

Results

图3概述了一只小鼠在两个时间点（第7天和第10天）注射后乳腺肿瘤细胞的肿瘤体积定量。在这个实验中，注射了50，000个DB7细胞，并且通过MRI对动物的大脑进行了评估。每次扫描，捕获 30 片（0.5 毫米厚度）。对每次扫描30片的评估显示，在注射后的第7天，5片表现出肿瘤负担（图3A），在注射后第10天，9片表现出肿瘤负担（图3B）。每个图像都按描述评估肿瘤区域，图3C中描述了每个帧的面积。根据切片厚度确定和调整肿瘤总体积。图4以公开格式描绘了具有代表性的数据，包括代表性图像（图4A）和肿瘤体积的直方图（图4B）。

Discussion

利用颅内注射，然后使用MRI进行串行监测，为肿瘤生长提供了独特的能力，使肿瘤体积在一段时间内具有准确性。数字成像分析的应用允许解释脑损伤的肿瘤体积，出血，坏死，和治疗的反应。

与任何过程一样，要取得成功，必须遵循一些关键步骤。首先，仔细设置立体定向设备是该技术成功的关键。由于小尺寸的鼠颅，轻微的不协调会导致肿瘤生长速度和实验动物的显著不同的影响。因此，有必要对使用这些文书进行适当的培训。其次，整个程序的加热源可确保麻醉面不会下降过低。低体温使动物面临在麻醉下突然死亡的风险，因为药物代谢减少和意外过量麻醉和/或可以延长恢复时间。预制加热垫可能笨重且难以在立体定向机器上四处操作，但通过任何商业供应商购买的小型空气激活手暖器可保持温度，且足够小，可放置在用于将鼠标提升到立体声设置的适当级别的倒置移液器尖端盒中。最后，量化是简单的，但往往确定什么是肿瘤与什么不是肿瘤可能是具有挑战性的。建议调查人员咨询成像人员，以确保准确的评估。重复肿瘤体积测量多次，以减少误差也很有帮助。此外，每个研究应该由同一个人分析所有图像。

根据用户首选项可以修...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>手术材料
优碘 普	渡产品	19-027132	聚维酮碘，7.5%
骨蜡	外科专业	903	无菌且可延展的蜂蜡和棕榈酸异丙酯
Buponorphine SR-Lab	ZooPharm	N/A	长效注射镇痛药 5 mL （0.5 mg/mL） 多量制剂
棉签涂抹器	Puritan	25-806 10WC	无菌长柄棉签涂抹器
眼药膏	Puralube	17033-211-38	润滑凡士林和矿物油基眼药膏
暖手器	Hothands	HH2	空气激活热敷袋
布洛芬	Up &Up	094-01-0245	每 5mL 100 毫克液体悬浮
异氟醚	Henry Schein INC	1182097	用于麻醉剂蒸发器的液体麻醉剂
手术刀	Integra Miltex	4-410	#10 一次性手术刀刀片
皮肤胶	Vetbond	1469SB	皮肤安全伤口粘合剂
无菌敷料	TIDI 产品	25-517	独立包装的无菌窗帘
缝合	Covidien	SP5686G	45cm 楔形 5-0 单丝聚丙烯缝合
线立体定位装置
高速钻头（Foredom）	Kopf	型号 1474	最大 38,000 RPM
小鼠气体麻醉头支架	Kopf	型号 923-B	带齿孔和鼻锥的口杆
不破裂的耳杆	Kopf	922 型	适合鼠标应用的耳杆
立体定位仪	Kopf	940 型	底板、框架和线性刻度组件，带数字读数监视器
注射器
注射器针和注射器	Hamilton	80366	26 号针头，针头长度为 51 毫米，针头长度为 10 &μ;L 容量注射器
Legato 130A 自动注射泵	KD Scientific	P/N： 788130	带自动注射器
麻醉机
SomnoSuite 低流量数字蒸发器	Kent Scientific	SS-01	数字麻醉机
SomnoSuite小鼠入门套件	Kent Scientific	SOMNO-MSEKIT	包括感应室、2 个麻醉注射器、18 英寸管、塑料鼻锥、2 个废 aneshesia 气体罐