通过颅内注射与磁共振成像建立脑转移模型

摘要

颅内脑转移瘤建模因缺乏精确且及时监测肿瘤大小及治疗反应的方法而变得复杂。本研究所展示的方法将颅内肿瘤注射与磁共振成像分析相结合，从而实现精确且一致的注射操作、增强的动物监测以及准确的肿瘤体积测量。

摘要

癌症的转移扩散是疾病进展、侵袭性癌症亚型和/或晚期诊断所带来的不幸后果。脑转移尤其具有破坏性，难以治疗，且预后较差。尽管目前美国脑转移的确切发病率仍难以估计，但随着颅外治疗手段在癌症治疗中效果不断提升，其发生率很可能会持续上升。因此，有必要识别并开发针对该部位转移病灶的新型治疗方法。为此，将癌细胞直接注射入颅内已成为一种成熟的脑转移建模方法。过去，由于无法直接测量肿瘤生长情况，这一模型在技术上受到限制；然而，随着小动物成像技术（如磁共振成像，MRI）的可及性和成像质量不断提高，研究人员现已能够更有效地在实验期间纵向监测肿瘤生长，并推断脑内发生的变化。本文展示了在免疫功能健全的小鼠中通过颅内注射小鼠乳腺肿瘤细胞并随后进行MRI检测的操作流程。该注射方法采用异氟烷麻醉，结合立体定位装置，利用数字控制的自动钻孔设备和针头注射系统，以提高操作精确度并减少技术误差。磁共振成像在俄亥俄州立大学詹姆斯综合癌症中心的小动物成像共享资源平台使用9.4特斯拉仪器进行，随时间序列采集数据。各时间点的肿瘤体积测量通过ImageJ软件实现。总体而言，该颅内注射方法可实现精准注射、逐日监测和准确的肿瘤体积测量，显著提升了该模型系统在探索脑转移驱动机制方面验证新假设的应用价值。

引言

脑转移的发生率比成人原发性中枢神经系统肿瘤高出10倍¹，几乎在所有实体瘤中均有报道，其中肺癌、乳腺癌和黑色素瘤的发病率最高²。无论原发肿瘤位于何处，脑转移的发展通常预后不良，常伴随认知功能下降、持续性头痛、癫痫发作以及行为和（或）人格改变^1,3,4,5。就乳腺癌而言，该疾病的预防与治疗已取得诸多进展。然而，约30%的乳腺癌患者最终会发展为转移性疾病，而在Ⅳ期患者中，约7%（SEER 2010–2013数据）会出现脑转移^6,7。目前脑转移的治疗手段包括手术切除、立体定向放射外科和（或）全脑放疗。然而，即使采用这些积极的治疗方案，患者的中位生存期仍仅为8–11个月^7,8,9。这些严峻的数据充分说明，迫切需要识别并实施新型且有效的治疗策略。因此，与其他转移至脑部的癌症一样，在实验室中建立准....

方案

本文所述所有方法均已获得俄亥俄州立大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准（项目负责人：Gina Sizemore；方案编号：2007A0120）。所有啮齿类动物存活手术均遵循IACUC政策，包括使用无菌技术、无菌物品、无菌器械，以及术前脱毛和切口部位的无菌准备。

1. 乳腺癌细胞的颅内注射

注意：本文所述方法使用了源自原发性MMTV-PyMT肿瘤的小鼠乳腺肿瘤细胞系DB7²³。既往研究已建立DB7细胞的颅内注射模型，该模型的组织病理学特征与人类乳腺癌脑转移（BCBM）相似¹²。重要的是，该模型采用免疫功能健全的FVB/N小鼠，因为DB7细胞系即来源于该小鼠品系。由于这是乳腺癌模型，实验中使用成年雌性小鼠。

1. 准备细胞。
   1. 在无菌操作台中，使用标准技术吸除细胞培养板中的培养基。
   2. 用1×DPBS洗涤细胞，并按照制造商的方案进行胰蛋白酶消化。
   3. 加入适量含FBS的培养基以终止胰蛋白酶反应，并使用血细胞计数板或首选方法测定细胞浓度。
   4. 在4 °C下以300 × g离心4分钟，使细胞沉淀。
   5. 吸除培养基，用1×DPBS洗涤，再次在4 °C下以300 × g

结果

图3展示了单只小鼠在注射鼠源乳腺肿瘤细胞后两个时间点（第7天和第10天）的肿瘤体积定量结果。本实验中注射了50,000个DB7细胞，并通过MRI评估该动物的脑部情况。每次扫描共获取30个切片（厚度为0.5 mm）。对每次扫描的30个切片进行评估后发现，注射后第7天有5个切片显示肿瘤负荷（图3A），而注射后第10天则有9个切片显示肿瘤负荷（图3B）。每个图像的肿瘤区域均按前述方法进行评估，各帧的肿瘤面积如图3C所示。总肿瘤体积根据切片厚度进行计算和校正。图4展示了以发表格式呈现的代表性数据，包括代表性图像（图4A）以及随时间变化的肿瘤体积直方图（图4B）。

讨论

通过颅内注射并结合磁共振成像（MRI）进行连续监测，能够随时间推移以精确的肿瘤体积准确度可视化肿瘤生长过程。数字影像分析技术的应用可对脑部病灶进行解读，评估肿瘤体积、出血、坏死情况以及对治疗的反应。

与任何实验操作一样，成功实施该技术必须遵循若干关键步骤。首先，立体定位装置的精确设置对该技术的成功至关重要。由于小鼠颅骨体积较小，即使存在微小的偏差，也可能导致实验动物中肿瘤生长速度和成瘤率出现显著差异。因此，操作人员必须接受使用这些仪器的正规培训。其次，整个操作过程中应保持热源供应，以确保麻醉深度不会过低。体温过低会因药物代谢减慢而导致麻醉意外过量，增加动物在麻醉状态下突然死亡的风险，或延长苏醒时间。预制的加热垫可能体积较大，在立体定位仪周围操作时不够灵活；而通过商业供应商购买的小型空气激活式暖手袋不仅能够维持稳定的温度，而且体积小巧，可轻松放置于倒置的移液器吸头盒内，该盒子用于将小鼠抬升至立体定位装置所需的合适高度。最后，定量分析本身较为直接，但常常难以区分肿瘤组织与非肿瘤组织。建议研究人员咨询影像学技术人员，以确保评估结果准确可靠。此外，建议多次重复肿瘤体积测量，以减少误差。同时.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
手术材料
贝塔碘（Betadine）	Purdue Products	19-027132	聚维酮碘，7.5%
骨蜡	Surgical Specialities	903	无菌且可塑性蜂蜡与棕榈酸异丙酯
Buponorphine SR-Lab	ZooPharm	N/A	长效注射用镇痛剂，5 mL（0.5 mg/mL）聚合物制剂
棉签	Puritan	25-806 10WC	无菌长柄棉签
眼膏	Puralube	17033-211-38	润滑性凡士林和矿物油基眼用软膏
暖手袋	Hothands	HH2	空气激活发热包
布洛芬	Up & Up	094-01-0245	液体混悬剂，每5 mL含100 mg
异氟烷	Henry Schein INC	1182097	用于麻醉蒸发器的液态麻醉剂
手术刀	Integra Miltex	4-410	#10 一次性手术刀片
皮肤胶	Vetbond	1469SB	适用于皮肤伤口的安全粘合剂
无菌敷料	TIDI Products	25-517	独立包装的无菌铺巾
缝合线	Covidien	SP5686G	45 cm 带针5-0单丝聚丙烯缝合线
立体定位仪
高速钻机（Foredom）	Kopf	Model 1474	最高转速38,000 RPM
小鼠气体麻醉头固定器	Kopf	Model 923-B	带齿孔和鼻罩的口部固定杆
非穿刺式耳杆	Kopf	Model 922	适用于小鼠的耳杆
立体定位仪	Kopf	Model 940	带数字显示 monitor 的底板、框架和线性刻度组件
注射器
注射针头与注射器	Hamilton	80366	26号针头，针长51 mm，10 μL 容量注射器
Legato 130A 自动注射泵	KD Scientific	P/N: 788130	带可编程触摸屏的自动注射泵装置
麻醉机
SomnoSuite 低流量数字蒸发器	Kent Scientific	SS-01	数字式麻醉机
SomnoSuite 小鼠起始套装	Kent Scientific	SOMNO-MSEKIT	包含诱导室、2支麻醉注射器、18" 管路、塑料鼻罩、2个废气吸收罐