简化的大洋广布性尾海鞘动物双生住囊虫 Oikopleura dioica 的采样与培养

摘要

Oikopleura dioica 是生物学多个领域的被囊动物模式生物。本文介绍了该生物及其藻类饲料的取样方法、物种鉴定、培养系统设置以及培养方案。我们强调了有助于增强培养体系稳定性的关键因素，并讨论了可能遇到的问题及解决方案。

摘要

Oikopleura dioica 是一种浮游性脊索动物，具有卓越的滤食能力、快速的世代周期、保守的早期发育过程以及紧凑的基因组。由于这些特性，它被认为是开展海洋生态学、进化发育生物学和基因组学研究的有用模式生物。鉴于研究通常需要稳定的动物资源供应，建立一个可靠且易于维护的培养系统十分必要。本文介绍了一步一步建立 O. dioica 培养体系的方法，包括如何选择潜在的采样地点、采集方法、目标动物的鉴定以及培养系统的搭建。我们结合自身经验提供了常见问题的解决方案，并强调了维持健康稳定培养体系的关键因素。尽管本文所提供的培养方案是针对 O. dioica 优化设计的，但我们希望所介绍的采样技术和培养设置能够为其他脆弱的远洋无脊椎动物的保育提供新的思路。

引言

Model organisms have been instrumental in addressing many biological questions including those relating to development, genetics, and physiology. Moreover, additional model organisms facilitate new discoveries and therefore are crucial to achieve a greater understanding of nature^1,2. Marine zooplankton are diverse groups of organisms that play an important role in ocean ecosystems^3,4,5,6. Despite their abundance and ecological importance, gelatinous organisms such as planktonic tunicates are often under-represented in plankton biodiversity studies because their transparency and fragility make field collection and identification challenging^7,8. Adapted sampling techniques and laboratory culturing allow closer observation of the animals in vitro, which has furthered the knowledge in the biology of planktonic tunicates^9,10,11,12.

Larvaceans (Appendicularians) are a class of free-swimming marine tunicates comprising around 70 described species worldwide^8,13. As they are one of the most abundant groups within zooplankton communities^14,15,16,17, larvaceans represent a primary food source for larger planktonic organisms such as fish larvae^18,19. Unlike ascidians-the sessile tunicates-larvaceans retain a tadpole-like morphology and remain planktonic throughout their lives²⁰. Each animal lives inside a self-built, intricate filter-feeding structure known as a house. They accumulate particulates in their houses by creating water currents through the undulating motion of their tails²¹. Clogged houses are discarded throughout the day, some of which form carbon aggregates and eventually sink to the seabed²²; thus, larvaceans play a major role in global carbon flux²³. Most species are reported to live in the pelagic zone within the upper 100 m of the water column¹³; however, the giant larvacean Bathochordaeus is known to inhabit the depths of 300 m²⁴. A study on Bathochordaeus in Monterey Bay, California revealed that the animals also serve as a biological vector of microplastics, suggesting a potential importance in understanding the role of appendicularians in the vertical transport and distribution of microplastics in the oceans²⁵.

Oikopleura dioica, a species of larvacean, has attracted attention in recent years as a model organism due to several remarkable characteristics. It is commonly reported throughout the world’s oceans. It is especially abundant in coastal waters²⁶, which allows easy sampling from the shore. Long-term, stable culturing is possible with both natural and artificial seawater^27,28,29. Temperature dependent generation times are as short as 4-9 days in laboratory conditions. It has high fecundity with each female capable of producing >300 eggs throughout the year. As a tunicate, it occupies an important phylogenetic position for understanding chordate evolution^30,31. At 70 Mb, O. dioica has the smallest identified genome amongst all chordates³². Among larvaceans, O. dioica is the only described non-hermaphroditic species thus far³³.

The first successful O. dioica culture with laboratory grown microalgae was reported by Paffenhöfer³⁴. The original culture protocol using synchronous motors and paddles was developed by Fenaux and Gorsky³⁵ and later adopted by multiple laboratories. More recently, Fujii et al.³⁶ reported O. dioica culturing in artificial seawater, a robust culture system and field collection were described by Bouquet et al.²⁷ and an optimized protocol for a simplified, affordable system was reported by Marti-Solans et al.²⁹. Aside from the traditional Oikopleura culture system, a newly reported design with a double tube rearing tank also has the potential to culture Oikopleura sp.³⁷.

We present a detailed protocol for initiating an O. dioica monoculture based on a combination of protocols developed by major Oikopleura research groups at the Sars International Centre for Marine Molecular Biology²⁷, the University of Barcelona²⁹, Osaka University²⁸, and our own observations. In previously published culture protocols, detailed information regarding the composition of algal media, shore sampling techniques, and Oikopleura identification were only roughly described, leaving a lot of ambiguity. Here, with the aid of visual information in the video protocol, we have assembled all the critical information needed to set up an O. dioica culture from the ground up in a straightforward, step-by-step manner. We describe how to distinguish O. dioica from another commonly reported species, O. longicauda, which is one of the most challenging steps. Although the existing culture systems are applicable for the cultivation of O. dioica worldwide, we highlight the importance of protocol adjustment based on local environmental conditions. The presented information combines widely published data as well as knowledge gained through experience. The current protocol is ideally suited for researchers interested in establishing a culture from scratch.

方案

1. O. dioica 培养设施

1. 水过滤系统（图1)
   1. 从港口2-3米深度采集天然海水。将海水通过砂滤器（孔径1.4 mm）过滤后，输送至实验室的共用水箱。使用滤筒过滤器循环水体，以维持共用水箱中的水质。
   2. 在培养室内，设置一个多级过滤系统，该系统由一个100 L储液罐、磁力驱动泵、5 µm和1 µm聚丙烯缠绕式滤芯、以及一个紫外线灭菌器（100 V）组成图1).
   3. 将海水从公共储水箱转移至培养室储水箱。使海水通过一个25 µm滤器单元（图1A，B在进入培养室储水箱之前，将海水通过5 µm和1 µm滤膜进行过夜循环，以彻底去除可能阻碍动物发育的颗粒物。
      注意：使用孔径更大（25–50 µm）的附加滤膜有助于防止较大颗粒堵塞孔径较小的滤芯。过滤后的海水（fSW）可在次日早晨使用。
2. Oikopleura 培养单元图2)
   1. 将动物饲养在5升或10升的圆形透明塑料烧杯中。
   2. 将培养烧杯放置在稳定的双层不锈钢架（长×宽×高 = 150 cm × 45 cm × 90 cm）上，架面覆盖5 mm厚的透明丙烯酸板。
   3. 在亚克力板下方放置白色荧光灯，从烧杯底部照亮动物。
   4. 在烧杯后方放置一张黑色塑料板。黑色背景可形成对比，增强透明动物的可视性。
   5. 将同步电动机连接到亚克力桨片（长 × 高 = 8 cm × 27 cm）补充文件 2）。将桨叶悬挂在培养烧杯中，桨叶由沿架子单元长度方向安装的平行轨道支撑（图 2A).
   6. 打开电机，使烧杯以15 RPM的转速产生轻柔的圆周运动。
      注意：动物在其纤维素容器中呈中性浮力；然而，水流循环有助于使卵、幼虫和藻类食物保持悬浮状态，并在培养杯中均匀分布。
3. 自动加样泵（可选）
   注意：自动喂食装置可减少人员需求，尤其在周末期间。
   1. 根据制造商的说明，校准自动加样泵的液体 dispensing 体积。
   2. 使用50 mL离心管作为藻类储存容器。
   3. 在50 mL离心管盖上钻两个5 mm的孔，用于穿过通气管。将其中一根管连接至标准水族箱空气泵以引入气泡，另一根管连接至加样泵的进样口图2B).
      注意：引入细小的气流有助于防止藻类在试管底部沉积。
   4. 设定特定日期藻类饲料的投喂时间和投喂量。
4. 藻类培养站
   1. 使用一个置物架（长 × 宽 × 高 = 90 cm × 46 cm × 115 cm）放置四个装有藻类工作培养物的1 L圆底烧瓶（见步骤2.1）。
   2. 通过在烧瓶后方放置荧光灯，对正在培养的样品进行背光照明。
   3. 用双孔橡胶塞密封烧瓶。
   4. 将一支1 mL一次性移液管穿过橡胶塞。使用气管将移液管与水族箱空气泵连接。向烧瓶中通入气泡流。

2. 微藻食物

1. 启动藻类培养
   注意：为三种微藻物种Chaetoceros calcitrans、Isochrysis sp.、Rhinomonas reticulata以及一种蓝细菌Synechococcus sp.分别维持三套培养体系（储备培养、次级培养和工作培养）。储备培养和次级培养用作备份，工作培养用于日常投喂。
   1. 准备微藻和蓝细菌培养所需的试剂（表1）。
   2. 启动储备培养时，在100 mL锥形瓶中加入60–80 mL fSW，121 °C高压灭菌25分钟。无菌条件下加入适量改良Conway培养基²⁷及微藻（表2）。例如，接种C. calcitrans储备培养时，将60 mL海水灭菌后，无菌加入维生素溶液和溶液A各30 µL，硅酸钠15 µL，链霉素60 µL，以及来自前一批储备培养的C. calcitrans 30 µL。
      注意：R. reticulata在光照过强时会由粉红色变为橙褐色。一旦培养液开始由澄清变为浅粉色，应立即将其移离强光环境。
   3. 将储备培养置于17 °C、连续光照的培养箱中。约10天后，培养物颜色变化表明藻类已生长（图3）。一旦出现明显颜色，将其转移至4 °C长期保存，可维持长达1个月。
   4. 在超净工作台上，从储备培养物中无菌接种次级培养（表2）。于17 °C、连续光照条件下培养。待藻类显色后，继续在培养箱中保存，最长可达2周。
   5. 从次级培养物中接种工作培养（表2）。用橡胶塞密封锥形瓶，并插入一支1 mL一次性移液器。将锥形瓶转移至藻类培养站，于室温、8小时光周期条件下维持培养，并持续通气。每4天更新一次工作培养。
   6. 每天摇晃两次储备培养和次级培养物以混匀。
      注意：藻类培养物在固体培养基上的长期保存及冷冻保存分别可维持长达3个月和1年²⁹。
2. 构建藻类生长曲线（可选）
   注意：准确评估投喂量对于维持稳定培养的O. dioica至关重要。我们为两种主要饵料藻类Chaetoceros calcitrans和Isochrysis sp.构建了生长曲线。
   1. 准备C. calcitrans和Isochrysis sp.的工作培养物（表2）。
   2. 对每种工作培养物分别进行三次独立取样，使用分光光度计测定660 nm处的吸光度。取每个工作培养物三次重复测量的平均值。
   3. 按照自动细胞计数仪的说明书制备藻类样品并进行计数。每份样品计数三次，取三次计数的平均值以确定每份样品中的总细胞数。
   4. 持续每日计数，直至记录约50个平均测量值。
   5. 为两种藻类分别绘制生长曲线（图4）。

3. 野生Oikopleura spp. 的野外采集

1. 改良型浮游生物网（图5）
   注意：Oikopleura spp. 成功采样的关键是使用带有配重、非过滤性网底的浮游生物网进行缓慢拖网。图5 展示了一种改良型浮游生物网的示意图。
   1. 将手持式浮游生物网的网底替换为一个改良的500 mL螺口清洗瓶。
   2. 在直径为4 cm的清洗瓶螺口上钻一个直径3 cm的孔，以便水和生物体进入网底。
   3. 将瓶盖安装在浮游生物网末端，并用电工胶带紧密缠绕，再用不锈钢软管夹进一步固定瓶盖。
   4. 使用扎带将一个70 g的配重固定在改良网底的外侧。
   5. 安装安全绳以进一步加固网底。
2. 选择采样地点（图6）
   注意：所有样本采集均经OIST野外工作安全委员会批准。Oikopleura spp. 的出现可能存在季节性变化，具体取决于地理位置（图6）。应避免在极端天气事件（如强暴雨）后立即采样。
   1. 利用地图网站的卫星视图识别潜在的采样地点。我们重点关注了易于驾车到达、位于海湾内或靠近海洋陡坡处的港口和渔码头，这些区域浮游生物容易聚集：日本冲绳县金湾的石川港（GPS：26°25'39.3"N 127°49'56.6"E）。
   2. 实地考察潜在采样点，评估各点的岸边可达性和安全性，并根据需要向当地主管部门申请采集许可。
3. 采样程序
   1. 将浮游生物网投入海中，使网底下沉至水面以下1-2 m处。
   2. 以50-100 cm s^-1的速度手动水平拖网，通过来回走动持续拖曳2-5分钟。根据港内浮游植物的丰度调整拖网时间，浮游植物较多时应缩短拖网时间。
      注意：尾海鞘类动物结构脆弱。快速拖网或反复投网可能会损伤被困在网底中的动物。
   3. 轻柔地提起网具，缓慢将网底内容物转移至一个500 mL的圆形玻璃瓶中，并用海水完全充满样本瓶，避免产生气泡。
      注意：可通过将样本瓶置于黑色背景前观察来确认是否存在Oikopleura spp.。大多数个体在采集过程中会舍弃其住室，因此需要显微观察才能进行物种水平的鉴定。
   4. 重复采样，直至收集到三个500 mL的样本瓶。
   5. 使用CTD剖面仪测量盐度、温度和叶绿素a，记录动物自然生存环境的物理参数范围。
   6. 用桶采集10-15 L表层海水，用于实验室条件下动物的适应性培养。

4. 动物的分离与鉴定（图7，图8）

1. Oikopleura 物种鉴定
   注意：其他可能与之相似的浮游生物 Oikopleura spp. 初看包括毛颚动物， 贝母 物种、线虫、带卵黄囊的鱼苗以及 海鞘 spp. 幼虫
   1. 为使动物适应实验室条件，将每个500 mL样品转移至含有采样点表层海水与实验室过滤海水（fSW）按1:1比例混合的10 L烧杯中图7A，B）。根据浮游生物样品的浓度，将烧杯的体积调整为5-10 L。
      注意：如果浮游生物样品中含有不需要的碎屑，应在转移至10 L烧杯前先通过粗滤网（孔径约600 µm）过滤。
   2. 使用连接至同步电动机（15 RPM）的搅拌桨，将浮游生物保持悬浮过夜（步骤1.2.5）。
   3. 识别 Oikopleura 通过寻找体长约1-2 mm、呈蝌蚪状、在球形透明住囊内摆动尾部的动物来识别spp.。部分个体可能暂时脱离住囊自由游动。使用钝头移液管将约5只动物轻轻转移至空的培养皿中。
   4. 为了进行属级鉴定，用移液管轻轻戳击蜗牛壳，使其从壳中移出。
   5. 在20-40倍暗视野显微镜下观察无宿主动物并确认 Oikopleura 种（spp）图8).
2. O. dioica 鉴定
   注意： O. dioica 可通过其尾部远端半侧存在完全成熟的雄性和雌性个体，或两个较大的亚软骨细胞来直观识别. 两个亚索细胞之间的距离在不同个体间可能存在差异。
   1. 接下来，检查是否存在完全成熟的 Oikopleura 性腺充满卵子（图8A）或精子（图8B）。如果该动物仅含有卵子或精子，则跳至步骤 4.2.3，因为它是 O. dioica，唯一已描述的非雌雄同体物种。
   2. 如果动物未成熟（图8C），在其尾部末端寻找两个脊索下细胞（图8D).
   3. 物种确认后，将其转移至新的培养皿中。重复步骤 4.1.3–4.2.2，直至有 10–20 个个体被确认到物种水平。
      注意：为便于识别，将动物置于含有0.015%三卡因甲磺酸盐（MS222）的过滤海水（fSW）的培养皿中进行麻醉。
   4. 如果没有 O. dioica 若发现有未成熟个体，需将烧杯继续悬置额外一至两天。可能存在未成熟个体 O. dioica 将继续生长并变得更容易被检测到。如果一周后仍未出现，应丢弃该样品，并重新采样。

5. O. dioica 的培养方案

1. 从野外采集样本建立 O. dioica 单一培养体系（图7）
   注意：藻类食物需每日从工作培养物中制备，每个单一培养烧杯每天分别于上午9点、中午12点和下午5点投喂三次（见步骤5.2）。动物维持在23 °C条件下。在此条件下，冲绳 O. dioica 的生命周期为4天（图7C）。
   1. 为建立 O. dioica 的单一培养，分离120只个体，并转移至含有5 L新鲜fSW的新烧杯中（图7B,C）。
   2. 次日早晨，寻找具有黄色性腺的完全成熟雄性个体，以及卵呈金黄色球状的雌性个体（图8A,B）。
   3. 使用5 mL钝头移液管，将15只雄性和30只雌性轻柔转移至另一个含有2.5 L新鲜fSW的新烧杯中，制备产卵用烧杯。
      注意：若雄性和雌性数量不足，应尽可能多地转移成体至含1 L fSW的烧杯中，使其自然产卵。为尽量减少手动转移过程中对动物造成的物理应激，应缓慢虹吸并在水面下释放动物。
   4. 让动物自然产卵以启动下一代。受精后约3小时应出现具尾幼虫。
      注意：产卵由完全成熟的个体弃舍其住囊、游向水体表层并释放配子完成。可通过从产卵烧杯底部抽取5–10 mL海水并在显微镜下观察是否存在卵裂现象来确认受精是否成功。
   5. 产卵后第一个早晨（第1天），烧杯中应出现带有膨胀住囊的新一代个体。使用500 mL手持烧杯，将产卵烧杯内容物轻柔转移至另一个含有7.5 L新鲜fSW的新烧杯中（总体积达10 L）。倾倒时应倾斜角度，避免溅洒。
   6. 第二天早晨（第2天），手动转移150只个体至另一个含有5 L新鲜fSW的新烧杯中。
   7. 第三天早晨（第3天），手动转移120只个体至另一个含有5 L新鲜fSW的新烧杯中。
      注意：为同步动物发育进程，在第2天和第3天的手动转移过程中，应选择体型相近的个体。单次虹吸转移的个体数不得超过10只。
   8. 第四天早晨（第4天），应出现完全成熟的个体。重复步骤5.1.3以完成生命周期循环。
      注意：可在周末设置自动投喂泵于下午5点进行投喂，无需培养人员在场。
2. 从工作培养物中每日制备藻类食物
   1. 测定工作培养物在660 nm处的吸光度。
   2. 根据每日投喂表，确定特定体型动物所需投喂的藻细胞数量（表3）。
   3. 利用藻类生长曲线（图4），解下列方程以计算当天所需的藻类食物体积（mL）。
      1. 为计算某一天某一投喂时间所需特定藻类的体积，请使用以下方程：
         
         
         
         
         
         
         
         其中 Y_A 表示某一天的藻类浓度，A 表示每次投喂所需的藻类体积。此外，Y_A 与 x 之间的线性关系，以及截距（c）和斜率（m）的数值见于 图4。参见表3获取 K 值。
      2. 例如，计算在5 L培养体系中第3天动物于上午9点投喂时所需 Isochrysis sp. 的体积，已知藻类吸光度为0.234（660 nm测定），计算如下：
         
         
         注意：将这些方程存储于电子表格中，以便根据吸光度测量值、动物体型和培养海水体积自动计算每日投喂量（补充文件1）。
   4. 将计算所得体积的藻液转移至50 mL离心管中，在20 °C下以5000 x g 离心5分钟。
   5. 弃去上清液，用新鲜fSW重新加满至原始体积，替换旧的藻类培养基。
   6. 将制备好的食物储存于冰箱中，待下次投喂时使用。次日早晨新食物制备完成后，丢弃前一天的旧藻类食物。
3. 活性炭处理（可选）
   注意：每个培养烧杯中加入10 g活性炭以维持水质。活性炭可重复使用最多四次。打开活性炭袋时应缓慢操作，防止炭粉进入培养烧杯。
   1. 将约700 g活性炭转移至容器中，用新鲜水（FW）浸泡48小时，并使其沉降至底部。
   2. 用新鲜水冲洗以去除残留的炭粉。
   3. 在新鲜水中煮沸活性炭15–20分钟。停止加热后冷却至室温。
   4. 持续冲洗直至大部分炭粉被去除，且水变清澈。
   5. 将清洁后的活性炭储存于含fSW的2 L烧杯中，并盖上盖子以防灰尘进入。
   6. 在转移动物前，向每个新烧杯中添加活性炭。

结果

可通过小船或在港口使用孔径为 100 µm 的浮游生物网并配以非过滤性网底进行缓慢轻柔拖网采集 Oikopleura（图 5）。由于该动物体质脆弱，必须避免任何可能造成物理损伤的操作，例如粗暴处理网具，或因样品瓶中残留气泡导致的溅洒。

了解当地Oikopleura种群的季节性变化模式以及采样点水体物理特性的相应波动非常重要。2015年至2019年的采样结果显示，冲绳石川港和金港的O. dioica存在一致的季节性变化（图6）。表层海水温度似乎是一个主要影响因素。当表层海水温度达到≥28 °C时，O. dioica为优势物种；在24 °C至27 °C之间，O. longicauda与O. dioica共存；然而，在低于23 °C时，O. longicauda占主导地位（图6A）。连续数天强降雨后盐度的逐渐变化与O. dioica的丰度无明显相关性（图6B）。

根据上述采样程序，我们获得的大多数 O. dioica 处于其 4 天生命周期中的第 2 至第 3 天（图 7C）。成熟雄性通过性腺呈现黄色来识别，而雌性性腺因含有直径为 70–80 µm 的卵而呈现金色光泽（图 8A,B）。未成熟 O. dioica 可通过尾部的两个脊索下细胞加以确认（图 8D）。当地海水中另一种优势物种 O. longicauda 在大小和形态上与之相似。我们采用以下标准区分 O. longicauda 与 O. dioica^38,39,40：尾部缺乏脊索下细胞、躯干部具有口前庭（velum），以及存在雌雄同体性腺（图 8E,F）。尾部形态的差异也有助于区分 O. longicauda 与 O. dioica。当一只完整无 house 的裸体动物侧向摆放时，O. longicauda 的尾部更趋笔直且弯曲度较小，与 O. dioica 相比显得更为“僵硬”。

建立稳定的Oikopleura培养体系最重要的三个因素是：(i) 维持高水质，(ii) 确定最佳喂养方案，以及 (iii) 设置含有足够数量雄性和雌性个体的产卵烧杯。引入多级过滤系统（图1）显著改善了培养系统的水质和稳定性。对于人工海水而言，过滤系统并非必需；然而，由于天然海水具有成本低、易获取和使用方便等优势，因此对于位于沿海地区的实验室而言是更优选择。为了建立合适的喂养方案，我们建议测定适用于各实验室具体条件的藻类生长曲线，因为不同实验室的温度和光照条件差异较大。我们将实测的生长曲线与先前发表的喂养时间表相结合，以优化藻类饲料的浓度和组成²⁷（图4）。此外，我们还遵循严格的藻种接种时间表，以确保藻类食物的新鲜供应（表2）。自动化喂养系统使我们能够在无人员值守的情况下维持稳定且规律的每日喂养（图2B）。

一旦达到最佳的海水和喂养条件，应通过在2.5 L fSW中放入15只雄性和30只雌性来建立新的繁殖杯，以启动新一代的繁殖。这可确保次日早晨获得足够数量的第1天个体，足以在第2天分离出150只个体，第3天120只，第4天45只成熟成体用于产卵。如果第4天成熟雄性和雌性数量不足，应尽可能多地收集并转移成熟个体至1 L fSW中，让其自然产卵，以期获得足够数量的幼体延续下一代。根据所提供的实验方案，O. dioica 在23 °C下的生活周期为4天（图7C）。我们已成功建立了六个独立的野生 O. dioica 种群，每个种群均持续超过20代。

图1：海水过滤系统的示意图。
（A 和 B）海水首先通过一个25 µm的过滤单元，然后进入储水箱（C）使用磁力驱动泵从储水箱中抽取海水。随后，海水被推送经过两个聚丙烯过滤器和一个紫外线灭菌器，再回流至储水箱。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：O. dioica 培养系统。
（A）培养系统概览；（B）同步电机与藻类储液器的特写图，用于自动给药泵。硅胶管 A 和 B 的内径分别为 2 mm 和 4 mm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：O. dioica 的保藏培养物。
从左至右分别为 C. calcitrans、Isochrysis sp.、Synechococcus sp. 和 R. reticulata，在 17 °C 恒光照条件下培养约 10 天后的状态。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：两种主要饵料藻类 C. calcitrans 和 Isochrysis sp. 的生长曲线。
在660 nm处测得的光密度（OD）与总细胞浓度的散点图，分别为（A）C. calcitrans 和（B）Isochrysis sp.。每个数据点代表三次测量的平均值。使用细胞计数仪测定活细胞百分比和总细胞浓度（细胞/mL）。连续记录20天的数据（n = 47）。请点击此处查看该图的放大版本。

图5：用于采集Oikopleura的改良式浮游生物网。
手持式浮游生物网（网孔尺寸100 µm）的网底端被替换为一个500 mL的洗瓶。在网底端附加一个70 g的配重。约5 m长的绳子连接在钥匙环上。另设一条安全绳以进一步固定网底端。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：冲绳地区O. dioica的季节性分布。
2015年至2019年间，在石川港（26°25'39.3"N 127°49'56.6"E）和金港（26°26'40.2"N 127°55'00.3"E）记录的O. dioica与O. longicauda的存在与缺失情况，及其与（A）温度和（B）盐度季节性变化的关系。若人工计数超过50个个体，则记录为该物种存在。同时记录表层水的温度和盐度数据。请点击此处查看该图的放大版本。

图7：O. dioica 单培养起始流程图。
（A）从采样点采集三份500 mL的浮游生物样品（B）对每份样品瓶中的样品进行稀释，并从中分离出O. dioica，去除其他浮游生物（C）通过手动将120只第3天的个体转移至含有5 L新鲜过滤海水（fSW）的新烧杯中，启动O. dioica的单培养。准备一个产卵烧杯，其中包含30只雌性、15只雄性和2.5 L新鲜过滤海水（fSW）。产卵后第一天（第1天），小心地将产卵烧杯中的新一代个体倒入另一个含有7.5 L新鲜fSW的烧杯中。产卵后第二天（第2天），将150只个体转移至含有5 L新鲜fSW的烧杯中。产卵后第三天（第3天），将120只个体转移至含有5 L新鲜fSW的烧杯中。在最后一天（第4天），准备一个新的产卵烧杯，其中包含30只雌性、15只雄性和2.5 L新鲜fSW，以准备下一代的繁殖。在23 °C条件下，这些生物的生命周期为4天。请点击此处查看该图的放大版本。

图8：Oikopleura 属物种的鉴定（A-D：O. dioica，E 和 F：O. longicauda）。
（A）携带卵子的雌性 O. dioica（B）携带精子的雄性 O. dioica（C）未成熟 O. dioica 的侧面观（D）未成熟 O. dioica 的腹面观，白色箭头指示两个脊索下细胞（E）携带卵子（箭头1）和精子（箭头2）的成熟 O. longicauda 腹面观（F）O. longicauda 的侧面观，显示口帽结构（箭头3）。请点击此处查看该图的放大版本。

试剂	化学产品	用量	终体积 (mL)	灭菌方式	储存条件 / 开启后
溶液 A	Na2EDTA	45 g	1000	高压灭菌	-20 °C / 4 °C
	NaNO3	100 g
	H3BO3	33.6 g
	NaH2PO4	20 g
	MnCl2·4H2O	0.36 g
	FeCl3·6H2O	1.3 g
	溶液 B	1.0 mL
溶液 B	ZnCl2	2.1 g	1000	高压灭菌	4 °C / 4 °C
	CoCl2·6H2O	2.0 g
	(NH4)6Mo7O24·4H2O	0.9 g
	CuSO4·5H2O	2.0 g
	*HCl	-- mL
维生素	硫胺素 (B1) ·HCl	200 mg	1000	高压灭菌	-20 °C / 4 °C
	生物素	1 mg
	钴胺素 (B12)	1 mg
硅酸钠	Na2SiO3	5%	1000	0.22 µm 滤膜过滤	4 °C / 4 °C
链霉素	C21H39N7O12	25 mg/mL	50	0.22 µm 滤膜过滤	-20 °C / -20 °C

表1：藻类食物培养所需试剂配方。 将溶液B所列所有化学物质溶解后，加入盐酸（HCl）直至溶液澄清、无浑浊。所有试剂均通过高压灭菌（120 °C，25分钟）或使用0.22 µm滤器进行灭菌。除维生素母液外，其余试剂均在添加指定化学物质后进行灭菌。对于维生素母液，应先对水进行高压灭菌，再溶解所列化学物质。母液及已开封试剂的储存温度已在表中列出。

培养类型	藻类物种	ASW (mL)	维生素	溶液A	硅酸钠	链霉素	藻类 (mL) / 培养类型	培养 / 保存	频率
保藏培养	Chaeto	60	1/2000	1/2000	1/4000 (仅限Chaeto)	1/1000 (除Syn外全部)	0.03 / 保藏	17°C / 4°C	每两周一次
	Iso	60					0.03 / 保藏
	Rhino	80					0.06 / 保藏
	Syn	60					0.03 / 保藏
传代培养	Chaeto	500	1/2000	1/2000	1/4000 (仅限Chaeto)	1/1000 (除Syn外全部)	10 / 保藏	17°C / 17°C	每周一次
	Iso	500					10 / 保藏
	Rhino	500					20 / 保藏
	Syn	500					10 / 保藏
工作培养	Chaeto	400	1/2000	1/2000	1/4000 (仅限Chaeto)	1/1000 (除Syn外全部)	100 / 传代	RM / RM	每4天一次
	Iso	400					100 / 传代
	Rhino	400					150 / 传代
	Syn	400					100 / 传代

表2：三种藻类培养类型的维护说明。 将指定量的添加剂加入含有高压灭菌海水的锥形瓶中。用指定量的藻类培养物接种每瓶。在指定温度下培养并保存藻类培养物。从上一代的主培养物接种新的主培养物和传代培养物，从上一代的传代培养物接种新的工作培养物。分别每两周、每周和每四天接种一次新的主培养物、传代培养物和工作培养物。此时间安排可为约10个装有O. dioica培养物的烧杯提供充足的食物。每种藻类培养类型应保留2–3套作为备用。RM – 室温。

天数	藻类物种	上午9点和下午5点	中午12点
1	Chaeto	—	—
	Iso	1000	2000
	Syn	20,000	40,000
2	Chaeto	1000	2000
	Iso	2000	2000
	Rhino	1000	1000
3	Chaeto	3000	4000
	Iso	3000	4000
	Rhino	1500	1500
4	Chaeto	1000	2000
	Iso	1000	2000
	Rhino	1000	1000

表3：每次喂食的藻类浓度——改编自Bouquet等²⁷。 在冲绳O. dioica的4天生活周期中，每日喂食所用的藻类浓度（细胞数 mL^-1）及藻类物种。

补充文件1：每日喂养记录表。 输入每个培养烧杯中微藻的每日吸光度（OD）、动物大小（Day）以及海水体积（SW vol.）后，系统将自动计算每个培养烧杯的每日喂养量。R. reticulata 和 Synechococcus sp. 的生长曲线改编自 Bouquet 等人²⁷。请点击此处下载该文件。

补充文件 2：如何将同步电机连接至亚克力桨叶。 使用六角扳手将桨叶紧密地拧到电机上。 请点击此处下载该文件。

讨论

为了便于灵活建立O. dioica的培养体系，了解该动物的自然生境至关重要。季节性数据可提供物理参数范围的信息，可用于指导实验室培养条件的设置，同时有助于理解动物丰度的季节性波动。在冲绳地区，O. dioica最稳定出现的时间为每年6月至10月；然而，在东京湾，其种群数量在2月和10月达到高峰⁴¹。尽管O. dioica的培养通常在20 °C或更低温度下进行报道^27,28,29，但冲绳地区的O. dioica在高于20 °C的温度下表现出更好的存活率；这可能与冲绳海域表层海水最低温度约为20 °C有关（图6）。O. dioica的丰度还可能受到浮游植物水华⁴²以及捕食者丰度^43,44的影响。无论O. dioica的采集地点为何，了解当地种群的季节性规律均可最大程度地提高采样和培养的成功率。

在合适的季节和地点，使用网具采样是一种以最小 effort 收集大量 Oikopleura 的有效方法。使用网孔更小（60–70 µm）的浮游生物网也可用于采集该动物各个发育阶段的个体。由于生命周期末期个体极为脆弱，成熟个体在网采样品中很少被发现。因此，物种鉴定需在采样后通过显微镜观察尾索细胞（subchordal cells）完成。动物在实验室中会继续生长，通常在采样后一至两天内出现成熟个体。尽管网具采样效率较高，但在不同情况下可能需要采用其他替代采样方法。例如，在城市附近进行网采时可能收集到大量浮游植物，从而难以分离出 Oikopleura。在此类情况下，建议采用简单的水桶采集表层海水，或在港湾以外区域进行船只采样。研究结果表明，连续降雨导致的盐度渐变对 O. dioica 的丰度无显著影响；然而，应避免在热带气旋等极端天气事件发生后立即进行岸边采样。此类事件会导致封闭水体中发生突然而剧烈的生物地球化学变化^45,46。暴雨径流可能携带污染物、沉积物和过量营养物质，导致水体浊度升高、水质下降⁴⁷。由于摄食方式特殊且运动能力有限，滤食性浮游动物（如 Oikopleura）可能对此类变化尤为敏感。在此情况下，建议将采样推迟数天，直至当地环境条件恢复正常。

引入多步过滤系统对于维持小型滤食性生物（如O. dioica）的培养至关重要。在先前的培养系统中，若使用过滤不充分的海水（例如仅用25 µm孔径的筛网），培养过程往往不稳定，尤其在夏季更为明显，这可能与浮游植物丰度较高有关。尽管某些浮游植物有助于O. dioica的生长，但另一些种类可产生生物毒素，导致O. dioica胚胎发育异常⁴⁸。此外，硅藻（如Chaetoceros spp.）浓度过高也可能对O. dioica的生长造成危害，因其具有较长的刚毛，可能堵塞住囊结构，妨碍有效摄食⁴⁹。我们经常观察到小型个体的住囊被C. calcitrans的刚毛堵塞；因此，目前仅在第2天及以后的个体中投喂C. calcitrans（表3）。

尽管本研究中未出现该问题，但小规模长期培养O. dioica可能因遗传瓶颈而导致种群数量突然下降；在此情况下，Martí-Solans 等人²⁹建议每隔20代向培养群体中引入新的野生个体。

Oikopleura 培养系统具有良好的灵活性。稳定的培养可在一周内建立。利用非专用设备和较低的经费即可实现 O. dioica 的长期培养。两人每日维护 5–10 个烧杯中的 Oikopleura 培养物所需工作时间通常少于 2 小时。O. dioica 也可在人工海水中维持培养，这对无法获取天然海水的研究者尤为有利²⁸。藻类饵料可通过固体培养和冷冻保存实现长期储存²⁹。此外，O. dioica 的精子可进行冷冻保存，并保持超过一年的活性⁵⁰。上述所有因素使得培养物能够被轻松重建。最后，以往意外成功培养 Pleurobrachia sp. 的经验表明，为 Oikopleura 所发展的培养体系未来或许可推广应用于更广泛的脆弱浮游生物群体。

O. dioica 继续为各个生物学领域提供重要的研究启示。了解当地的季节性变化、建立精细的培养体系，并依靠少数专注的研究人员，便可轻松建立高效的培养系统。Oikopleura 培养体系为研究这一独特海洋脊索动物的生态学、发育学、基因组学和进化生物学等广泛领域提供了基础资源。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
活性炭	Sigma	C2764-2.5KG
铝制滑轮	Rainbow Products	10604-10607
生物素	Sigma	B4501-100MG
硼酸	Wako	021-02195
钴胺素（B12）	Sigma	V2876-100MG
氯化钴(II)六水合物	Wako	036-03682
五水合硫酸铜(II)	Wako	039-04412
乙二胺四乙酸二钠水合物	Wako	044-29525
四水合七钼酸六铵	Wako	019-03212
六角扳手	Anex	No.6600
盐酸	Wako	080-01066
六水合氯化铁(III)	Wako	091-00872
Jebao 可编程自动加样泵	Jebao	DP-4
磁力泵	REI-SEA	RMD-201
四水合氯化锰(II)	Wako	134-15302
聚丙烯缠绕式滤芯过滤器	Advantec	TCW-10N-PPS
		TCW-5N-PPS
		TCW-1N-PPS
无螺钉接线端子块	SATO PARTS	SL4500
简易浮游生物网	RIGO, Japan	5512-C
偏硅酸钠	Sigma	307815-1KG
硝酸钠	Wako	195-02545
无水磷酸二氢钠	MP Biomedicals	194740
硫酸链霉素盐	Sigma	S6501-25G
同步电动机	Servo	D5N6Z15M
盐酸硫胺素	Wako	201-00852
紫外灭菌器	Iwaki	UVF-1000
氯化锌	MP Biomedicals	194858