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方法文章

腹侧被盖区谷氨酸能神经末梢在海马中的体内解剖与功能联合示踪

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DOI：

10.3791/61282

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2020年9月9日

 ,  , 
1Department of Comparative Biomedical Sciences, Louisiana State University School of Veterinary Medicine

本文内容

摘要

本方案展示了一种追踪腹侧被盖区（VTA）谷氨酸能投射至海马体的简单方法。通过光刺激VTA谷氨酸能神经元并结合CA1区记录，以展示VTA谷氨酸能末梢如何在体内调节CA1区假定锥体神经元的放电频率。

摘要

光遗传学调控脑内神经元亚群使研究人员能够在体内和离体条件下解析神经环路。这为确定特定类型神经元在神经环路中的作用及其在学习相关的信息编码中的意义提供了前提。同样，该方法可用于测试两个或多个相互连接的脑区在清醒或麻醉动物中的生理学意义。本研究展示了腹侧被盖区（VTA）谷氨酸能神经元如何调节麻醉小鼠海马CA1区假定锥体神经元的放电频率。该实验方案采用腺相关病毒（AAV）依赖性标记VTA谷氨酸能神经元，以追踪其在海马各层中的VTA突触前谷氨酸能终末。AAV载体携带的光控视蛋白（通道视紫红质；hChR2）和荧光蛋白（eYFP）的表达，实现了对VTA谷氨酸能终末的顺行性示踪以及对VTA内谷氨酸能神经元胞体的光刺激。使用高阻抗急性硅电极置于CA1区，以记录VTA光刺激诱导的多单位和单单位电生理反应。本研究的结果表明 腹侧被盖区谷氨酸能神经元的突触前末梢在海马区（CA1、CA3和DG）呈层状分布。此外，在体条件下光刺激腹侧被盖区谷氨酸能神经元可增加假定CA1锥体神经元的放电频率和簇状放电率。

引言

在过去十年中，一系列遗传工具被开发出来，以提高神经元类型调控的特异性，并实现对复杂神经网络的绘制1。值得注意的是，嗜神经病毒因其天然具有感染和在神经元细胞中复制的能力，已被用于在特定神经元亚型中表达或消除特定蛋白质。当携带荧光蛋白或基因编码的突触活性指示剂时，转染的腺相关病毒（AAV）载体可在不同脑区中标记并描绘神经网络2,3。在AAV载体中选择特定启动子可使载体在某些神经元类型中实现一定程度的特异性表达（启动子依赖性表达）。然而，通过Cre-lox重组系统，AAV载体在 神经元标记中的应用可实现更高的特异性4,5,6,7。值得注意的是，包装在AAV载体中的光激活微生物视蛋白和荧光蛋白可在多种神经元亚型中表达8，非常适合用于成像、特定神经元类型的环路示踪以及光调控9,10。

将AAV构建体通过立体定位注射至脑区（或核团）后，可在神经元胞体、树突及轴突末梢中驱动报告蛋白的表达。携带报告基因（eYFP）的AAV在神经元中的表达，有助于标记神经元胞体，并对与其他脑区之间的投射通路进行解剖学示踪11,12,13,14。携带光控视蛋白（如hChR2）的AAV-eYFP构建体，可作为工具用于成像6,15，以及基于刺激的神经投射在体生理示踪，以追踪至目标脑区的神经连接16。根据AAV血清型的不同，神经元标记的方向可为顺行性或逆行性11,12。既往研究表明，AAV5在神经元中呈顺行性运输12。因此，对表达hChR2的神经元胞体进行光刺激 ，可在脑内其他部位（目标区域）产生突触前效应17。

本研究中，使用携带 CaMKIIα 启动子的腺相关病毒（AAV，血清型 5）在腹侧被盖区（VTA）谷氨酸能神经元及其轴突投射中表达 eYFP（报告基因）和 hChR2（视蛋白）。研究结果表明，VTA 谷氨酸能神经元的突触前末梢在海马 CA1、CA3 和 DG 区域呈层状分布。此外，与基线值相比，光刺激 VTA 谷氨酸能神经元可显著增加体内 CA1 区域多单元和单单元的放电频率。该实验方案采用价格合理的工具和市售软件，可提高神经环路示踪实验所获数据的质量。

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方案

所有实验和动物操作程序均经路易斯安那州立大学兽医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 实验动物

  1. 使用5–6周龄的小鼠。
  2. 每笼饲养3–5只动物，维持12小时光照与12小时黑暗交替的标准环境条件。食物和水自由供应。

2. 开颅手术与动物准备

注意：本节描述小鼠开颅术的术前和术中操作步骤。使用标准的立体定位仪和相应的坐标（前后方向：AP，内外方向：ML，背腹方向：DV）。参考小鼠脑图谱以确定目标脑区的坐标位置。

  1. 通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）/赛拉嗪（10 mg/kg）混合液麻醉小鼠。在手术开始前，进行脚趾夹捏测试以确认感觉缺失。
    注：也可使用异氟烷麻醉配合适当的鼻腔麻醉室完成此步骤。
  2. 将动物头部轻柔地固定在立体定位仪上。
    注：在此过程中务必小心操作动物。手术前应检查呼吸频率及其他生命体征。让动物静置约 7 分钟以减少应激。
    1. 在立体定位仪框架上放置加热垫，使动物身体位于其上。这有助于维持体温，并在整个过程中保持动物温暖。术后护理和恢复期间继续使用加热垫。
  3. 使用剪毛器去除头皮区域的毛发，并用碘溶液清洁皮肤。
    1. 在头皮局部涂抹利多卡因以阻断感觉。
    2. 使用手术刀从额部至枕部做正中头皮切口。
    3. 用碘溶液清洁切口区域，然后暴露颅骨。
      注：可使用少量 3% 过氧化氢溶液去除颅骨上的骨膜。这将提高解剖标志（前囟和后囟）及颅缝的可见度。
    4. 参照小鼠脑立体定位图谱，确定相对于前囟的前后（AP）和内外侧（ML）坐标。
    5. 对于腹侧被盖区（VTA）注射，将超细钝头针注射器（例如 Neuros 注射器）定位至相对于前囟的坐标：AP: -3.08 mm / ML: 0.5 mm。
    6. 使用钻头在标记的 AP/ML 坐标处钻出一个 1 mm 的孔（颅骨开孔）。
      注：此步骤需格外谨慎。钻孔时应施加最小压力，防止钻头压碎脑组织。本研究中使用的钻头直径为 0.8 mm，钻速设定为 15,000 rpm。
      警告：如果在清洁切口或颅骨时使用了过氧化氢溶液，钻孔前必须彻底清除该溶液或确保完全干燥。

3. AAV 混合病毒注射

注意：本节描述了将 AAV 注射到成年 C57BL/6 小鼠（23–27 g）腹侧被盖区（VTA）的操作流程。使用标准的立体定位仪和相应的坐标，该方法也可用于将 AAV 注射到任何脑区。 为演示本方案，通过 AAV5 介导的转染，在 CaMKIIα 启动子驱动下于 VTA 谷氨酸能神经元中表达 eYFP 和 hChR2（图 1）。此步骤也可采用 Cre-lox 重组系统。

  1. 将带有超细钝头针头（32 G；5 µL 容量，精度为 100 nL）的注射器安装到注射装置上。将注射器固定器安装在显微操作仪上。
    注意：本实验使用了手动注射器固定器，校准精度为 1.6 nL。也可使用自动注射装置。
  2. 用双蒸水填充注射器，以清洗并测试液体流动情况。
  3. 将腺相关病毒（AAV，血清型 5）混合液分装样品置于冰上解冻。为保持病毒滴度和良好表达效果，AAV 最好保存在 -80 °C 条件下。
  4. 用 1,000 nL 的 AAV 溶液（10 mM 磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4）填充已安装的注射器。在将针头插入注射位点前，先推出 10 nL AAV 溶液以确认液体流动正常。
  5. 使用显微操作仪将 针头立体定位插入至目标深度（DV 坐标）。当针头到达目标深度后，使注射器在原位停留 10 分钟后再开始注射。
    注意：本实验中，针头插入腹侧被盖区（VTA）的深度（DV）为距脑表面 4.5 mm。对于其他脑区，请参考小鼠脑图谱使用相应的背腹向坐标。
  6. 向 VTA 注射 600–800 nL 的 AAV。注射体积可根据靶区大小进行调整。
    1. 以 60 nL/min 的速率递送 AAV 溶液（持续 3 分钟）。
    2. 为在 VTA 谷氨酸能神经元及其投射中表达 eYFP 和 hChR2，需注射 AAV-CaMKIIα-ChR2-eYFP。
      注意：根据实验目的，也可采用 Cre-lox 重组技术。
    3. AAV 注射完成后，使针头在原位保留 15 分钟，以 减少液体扩散和回流。
  7. 撤出注射器针头，然后缝合切口以闭合伤口。
  8. 作为术后护理的一部分，给予抗生素和镇痛药物。将小鼠 置于温暖的软垫平台上，并持续监测直至其清醒。
    注意：注射后 3 周，可通过荧光检测小鼠脑切片中的报告蛋白（eYFP）观察 AAV 表达情况。此外，光刺激实验也可在注射 3 周后进行（图 2）。

4. 使用光遗传学进行活体神经记录的设置

注意：本节描述了使用光遗传学示踪技术对脑环路（VTA 谷氨酸能神经元投射至 CA1 区）进行急性神经记录的步骤。如有必要，在开始此步骤前应检查系统（放大器及连接）是否存在电噪声和接地问题。在法拉第笼内进行该步骤可有助于消除记录中的电噪声。

  1. 在 AAV 注射后 3 周，通过腹腔注射乌拉坦（0.2 mg/kg）麻醉小鼠。
    警告：氨基甲酸乙酯具有致癌性，操作时必须佩戴防护装备并谨慎处理。此外，使用该浓度的氨基甲酸乙酯进行麻醉属于非存活性操作。
  2. 将动物头部固定于立体定位仪上，操作步骤如前所述（步骤 2.2）， 图3A）。进行开颅手术以暴露硬脑膜（图3A). 使用钻孔工具（钻头尺寸：0.8 mm，转速：15,000 rpm）去除部分顶骨。
    1. 开颅窗的尺寸应约为 3 mm × 4 mm。在此区域滴加人工脑脊液（aCSF）以防止干燥。
  3. 在解剖（数码）显微镜下，使用弯头针尖（27 G）切除暴露的硬脑膜。注意不要牵拉分离该区域脆弱的软脑膜覆盖物和皮层组织。
  4. 在枕骨上钻孔 骨（钻头尺寸：0.8 mm，转速：10,000 rpm）用于固定接地螺钉（盘头十字螺钉；M0.6 × 2.0 mm）。
  5. 连接一根不锈钢接地线。
    注意：也可使用其他类型的导线（图3b).
  6. 对于联合光刺激（VTA）与神经记录（CA1），使用配备超精细（10 µm 或 1 µm）微操纵器的多轨立体定位仪。将光纤和记录用神经探针分别安装在10 μm量程和1 μm量程的微操纵器上。
    1. 如有需要，使用头部固定装置-探针适配器（图3c).
      注意：在本实验方案中，使用适配器将32通道头部固定装置与4通道记录电极连接图3d）。不锈钢接地线已焊接到适配器的接地连接端口。
  7. 在坐标 AP：-3.08 mm，ML：0.5 mm 处，将直径为 400 μm 的光纤插入 VTA。
    1. 在降低光纤之前，将插芯连接至光纤线缆（带不锈钢或陶瓷插芯），该线缆连接至 光纤耦合LED光源
      注意：确保光照强度和焦点已调节至所需水平。LED光源的选择应与目标视蛋白相匹配。此处使用470 nm（蓝光）LED驱动器进行hChR2的光激活（图 4a).
    2. 为了同步光脉冲与神经信号记录，将LED驱动器与记录控制器的数字信号连接 在 连接至晶体管-晶体管逻辑（TTL）脉冲发生器图4b可使用BNC分配器实现。
      注意：使用TTL脉冲发生器可灵活地通过数字方式设定所需的脉冲序列频率和持续时间。在本方案中，以50 Hz的频率触发持续时间为10 ms的光脉冲。18将LED驱动器切换至“触发”模式，以实现对LED驱动器的TTL控制。在此模式下，可通过旋转“旋钮”调节光照强度。刺激频率可根据实验变量进行调整。 频率范围可从1到100 Hz。对于神经环路示踪，刺激频率为 >建议使用 20 Hz。
    3. 调节旋钮以确定能够引发反应且不产生光电伪迹的有效强度。如有必要，重新调整光纤位置以消除伪迹19.
      注意：本实验方案所用的LED驱动器产生的光功率约为21.8 mW。

5. 神经信号记录

  1. 使用尖端神经探针，探针柄厚度为15–50 µm，长度至少5 mm。
    注意：记录深部脑结构需要使用更长探针柄的神经探针。在本研究中，使用了探针柄长度为20 mm的探针。
  2. 通过串行外设接口（SPI）电缆将前置放大器头级连接至记录控制器。检查记录控制器端口上的LED灯颜色。绿色和黄色LED灯表示连接的放大器板电压正常。红色LED灯表示软件-头级控制工作正常（图5b）。
  3. 使用显微操作器，将电极记录位点定位至CA1区的锥体细胞层（前后向：-1.94 mm，内侧向外侧：+1.0 mm，背侧向腹侧：+1.1 至 1.2 mm）。
    注意：光导纤维和电极也可根据需要定位至其他目标脑区，用于光刺激和记录。

6. 放大器和滤波器设置

  1. 通过 USB 3.0 端口将记录控制器放大器系统连接到计算机。使用 SPI 电缆将头级连接至放大器。启动控制器软件。如果连接不正确，系统将显示“未找到设备”的消息。
  2. 点击 运行 以查看各通道的活动。每个波形以电压（y 轴）对时间（x 轴）的形式绘制。根据感兴趣区域，调整电压和时间刻度以优化波形显示。
  3. 如果仅有少数通道处于活动状态，请禁用未使用的通道，以减小存储磁盘上的文件大小。
  4. 通过在采集软件中编辑带宽参数来设置采样率和截止频率。对于单细胞记录，将高通和低通截止频率分别设置为 300 Hz 和 5,000 Hz。将放大器的采样率更改为 30 kS/s。
    注意：选择较高的采样率将产生更大的文件大小。
  5. 在记录前，通过在 1,000 Hz 下测量阻抗来检查电极通道的完整性。此操作可通过用户界面（控制器软件）中的功能启动。正常工作的通道其阻抗值应在 0.1 至 5 MΩ 范围内。
  6. 如果音频输出（扬声器）已连接至 模拟输出 端口，请调节 增益 和 静音器 以获得最佳的尖峰声音效果。
  7. 要在尖峰记录中显示 TTL 脉冲序列标记，请启用 数字输入 标记的显示。如需记录脉冲序列的时间戳，请在主实验开始前启用 数字输入 通道的显示。
    注意：通常存在多个“数字输入”通道（1 或 2）。请确保来自 TTL 脉冲发生器的 BNC 电缆连接至在记录控制器软件中选中用于显示的“数字输入”端口。
  8. 为实时查看尖峰波形，请打开尖峰示波窗口，并使用鼠标点击设置阈值。
  9. 通过监测均方根噪声（RMS，单位为 µV）来检查噪声水平。为获得清晰的尖峰记录，建议神经尖峰阈值至少为 RMS 的 5 倍。
  10. 完成设置后，选择文件输出格式。
    注意：此处 CA1 神经尖峰以 .rhd 格式记录。也可选择其他文件格式（如 .rhs 和 .dat），以匹配分析软件所支持的文件格式。

7. 体内光遗传学记录与设置

  1. 打开脉冲控制软件（TTL），该软件显示多种可调节的脉冲参数。在软件中选择合适的COM端口。通过调整Train和Group设置来设定脉冲参数。
    注意：脉冲条件应根据实验变量和设计来确定。
  2. 在放大器控制器软件中，点击Run以检测海马体或目标脑区的神经放电。如有必要，调整电极深度以检测到可存活且活跃的神经元。
  3. 一旦检测到细胞外电压活动，观察基线放电15分钟，并监测动物的生命体征。同时，测试光脉冲以检测CA1区或目标解剖区域内的响应性神经元。
    注意：检查是否存在光电伪迹，并通过调节光强或光纤位置予以消除。
  4. 在以目标频率触发光脉冲前，记录约10分钟的基线活动（图5a,b）。这将有助于比较有无光照条件下的放电频率或簇状放电率。
    注意：在本研究中，先在无光照条件下记录10分钟基线活动，随后以50 Hz频率进行光照（视频1）。

8. 分析

  1. 转化 将 .rhd 文件导入 Nex5 输出格式
  2. 处理文件名.Nex5 使用离线分选软件文件以检测单个单元的点阵序列和波形（图5a–b).
    1. 从下拉窗口中选择所需的通道。
      注意：持续记录的尖峰数据可在OFSS的单独窗口中查看，时间尺度也可进行调整。若使用四极电极，可将OFSS设置为将4个通道合并为一个四极电极进行分类。
    2. 设置用于阈值交叉波形提取的电压水平。
      注意：为准确检测尖峰信号，至少应使用 5 倍均方根（RMS）作为阈值。
    3. 检测波形，然后使用谷值寻找法（自动）或K均值法（半自动）进行峰电位分类。必要时，合并占据三维主成分分析（PCA）空间相似区域的单元。
    4. 导出已排序的 .Nex 文件5 用于进一步分析的文件（图5c–d).
      注意：峰间间隔、放电频率和簇放电频率的分析结果可导出至其他分析平台。

9. AAV 表达的荧光检测

  1. 记录结束后，在异氟烷麻醉舱中实施安乐死。
  2. 经心脏灌注 10 mM PBS（约 10 mL），随后灌注 4% 磷酸盐缓冲多聚甲醛（PB-PFA，约 10 mL）。
  3. 完整取出全脑，并在 4% PB-PFA 中固定 48 小时。
  4. 将固定后的脑组织转移至含 30% 蔗糖的 4% PB-PFA 溶液中，于 4 °C 下进行冷冻保护。72 小时后，在冷冻切片机中切片，并将脑片贴附于明胶包被的载玻片上。
    注意： 在本实验方案中，选取包含海马闭合部（前侧）的脑片，以展示 AAV 标记的神经末梢在齿状回（DG）、CA3 和 CA1 区的分布。

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结果

顺行示踪

通过在注射后21天对C57BL/6小鼠VTA区报告蛋白（eYFP）进行免疫荧光成像，验证了AAV的表达（图2）。通过在DG、CA3和CA1各层中检测到eYFP，也证实了VTA谷氨酸能投射至海马区的顺行性标记成功（图6a–d；视频2和3）。

VTA 到海马体的谷氨酸能投射调控 CA1 区域的活性

对VTA谷氨酸能神经元进行光刺激后，CA1区假定的锥体神经元活动增强。这一点在光照开启阶段（影片1）的放电事件增加中表现明显，相较于光照关闭阶段（图5a–b）。为支持该结果，对光刺激前（光照关闭；基线期）和光刺激后（光照开启）C...

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讨论

在过去十年中，AAV 载体的设计取得了显著进展。因此，越来越多的神经元特异性启动子被整合到多种 AAV 血清型中，以提高转染的特异性14。通过将荧光蛋白、转运蛋白、受体和离子通道的基因组合，现已构建出可用于成像、神经调控以及突触活动检测的 AAV 文库。在商业化的 AAV 载体中，将编码荧光蛋白的基因与离子通道（视蛋白）结合，可实现对神经环路的神经解剖学与电生理学联合示踪14,18,19。同样，通过选择特定的启动子（或 cre-lox 重组系统），可实现对环路中特定类型神经元投射的示踪。在本研究中，该方案被用于对腹侧被盖区（VTA）谷氨酸能神经元投射至海马（CA1 区域）的解剖学和电生理学特征进行评估。

VTA-海马神经环路

腹侧被盖区（VTA...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由授予OOM的CBS桥梁基金资助。OOM、PAA和AS设计了研究并进行了实验。AS和PAA分析了结果。OOM和PAA撰写了稿件。 我们感谢斯坦福大学Karl Disseroth博士提供供我们使用的AAV病毒。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3% 过氧化氢Fisher chemicalH312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYPAddgene质粒 #26969
BNC 电缆Amazon
BNC 分路器Amazon
用于 Ø1.25mm 陶瓷插芯的陶瓷分体对接套筒ThorlabsADAL1-5
钻机DremelLR 39098
明胶包被载玻片Fisher scientificOBSLD01CS
Hamilton 注射器（Neuros）WPI Inc.06H
前置放大器探头适配器NeuronexusAdpt-Q4-OM32
高阻抗硅探针NeuronexusQ1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512 通道记录控制器INTANRHD2000
碘溶液Dynarex1425
异氟烷PiramalNDC 66794-017-25
氯胺酮SpectrumK1068
LED 驱动器ThorlabsLEDD1B
LED 光源（470 nm）—蓝光ThorlabsM470F3
显微操作器NarishigeM0-203
光纤ThorlabsCFMLC14L05
盘头十字螺钉（M0.6 × 2 mm）AmazonM0.6 × 2 mm
前置放大器探头（32 通道）INTANC3314
立体定位仪框架Kopf1530
TTL 脉冲发生器Prizmatix4031
氨基甲酸乙酯SigmaU2500
赛拉嗪Alfa AesarJ61430
软件公司版本
Graphpad PrismGraphPad Software版本 8
Intan 记录控制器Intantech版本 2.07
NeuroexplorerNex Technologies版本 5.215
Plexon 离线尖峰排序器Plexon Inc版本 4.5
ACSF 配方：
持续通入 95% 氧气 / 5% CO2 的含氧 ACSF（ACSF；单位：mM，含 125 NaCl、25 NaHCO3、3 KCl、1.25 NaH2PO4、1 MgCl2、2 CaCl2 和 25 葡萄糖）。

参考文献

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腹侧被盖区谷氨酸能神经末梢在海马中的体内解剖与功能联合示踪
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