腹侧被盖区谷氨酸能神经末梢在海马中的体内解剖与功能联合示踪

摘要

本方案展示了一种追踪腹侧被盖区（VTA）谷氨酸能投射至海马体的简单方法。通过光刺激VTA谷氨酸能神经元并结合CA1区记录，以展示VTA谷氨酸能末梢如何在体内调节CA1区假定锥体神经元的放电频率。

摘要

光遗传学调控脑内神经元亚群使研究人员能够在体内和离体条件下解析神经环路。这为确定特定类型神经元在神经环路中的作用及其在学习相关的信息编码中的意义提供了前提。同样，该方法可用于测试两个或多个相互连接的脑区在清醒或麻醉动物中的生理学意义。本研究展示了腹侧被盖区（VTA）谷氨酸能神经元如何调节麻醉小鼠海马CA1区假定锥体神经元的放电频率。该实验方案采用腺相关病毒（AAV）依赖性标记VTA谷氨酸能神经元，以追踪其在海马各层中的VTA突触前谷氨酸能终末。AAV载体携带的光控视蛋白（通道视紫红质；hChR2）和荧光蛋白（eYFP）的表达，实现了对VTA谷氨酸能终末的顺行性示踪以及对VTA内谷氨酸能神经元胞体的光刺激。使用高阻抗急性硅电极置于CA1区，以记录VTA光刺激诱导的多单位和单单位电生理反应。本研究的结果表明 腹侧被盖区谷氨酸能神经元的突触前末梢在海马区（CA1、CA3和DG）呈层状分布。此外，在体条件下光刺激腹侧被盖区谷氨酸能神经元可增加假定CA1锥体神经元的放电频率和簇状放电率。

引言

在过去十年中，一系列遗传工具被开发出来，以提高神经元类型调控的特异性，并实现对复杂神经网络的绘制¹。值得注意的是，嗜神经病毒因其天然具有感染和在神经元细胞中复制的能力，已被用于在特定神经元亚型中表达或消除特定蛋白质。当携带荧光蛋白或基因编码的突触活性指示剂时，转染的腺相关病毒（AAV）载体可在不同脑区中标记并描绘神经网络^2,3。在AAV载体中选择特定启动子可使载体在某些神经元类型中实现一定程度的特异性表达（启动子依赖性表达）。然而，通过Cre-lox重组系统，AAV载体在 神经元标记中的应用可实现更高的特异性^4,5,6,7。值得注意的是，包装在AAV载体中的光激活微生物视蛋白和荧光蛋白可在多种神经元亚型中表达⁸，非常适合用于成像、特定神经元类型的环路示踪以及光调控^9,10。

方案

所有实验和动物操作程序均经路易斯安那州立大学兽医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准。

1. 实验动物

1. 使用5–6周龄的小鼠。
2. 每笼饲养3–5只动物，维持12小时光照与12小时黑暗交替的标准环境条件。食物和水自由供应。

2. 开颅手术与动物准备

注意：本节描述小鼠开颅术的术前和术中操作步骤。使用标准的立体定位仪和相应的坐标（前后方向：AP，内外方向：ML，背腹方向：DV）。参考小鼠脑图谱以确定目标脑区的坐标位置。

1. 通过腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）/赛拉嗪（10 mg/kg）混合液麻醉小鼠。在手术开始前，进行脚趾夹捏测试以确认感觉缺失。
   注：也可使用异氟烷麻醉配合适当的鼻腔麻醉室完成此步骤。
2. 将动物头部轻柔地固定在立体定位仪上。
   注：在此过程中务必小心操作动物。手术前应检查呼吸频率及其他生命体征。让动物静置约 7 分钟以减少应激。
   1. 在立体定位仪框架上放置加热垫，使动物身体位于其上。这有助于维持体温，并在整个过程中保持动物温暖。术后护理和恢复期间继续使用加热垫。
3. 使用剪毛器去除头皮区域的毛发，并用碘溶液清洁皮肤。
   1. 在头皮局部涂抹利....

结果

顺行示踪

通过在注射后21天对C57BL/6小鼠VTA区报告蛋白（eYFP）进行免疫荧光成像，验证了AAV的表达（图2）。通过在DG、CA3和CA1各层中检测到eYFP，也证实了VTA谷氨酸能投射至海马区的顺行性标记成功（图6a–d；视频2和3）。

VTA 到海马体的谷氨酸能投射调控 CA1 区域的活性

对VTA谷氨酸能神经元进行光刺激后，CA1区假定的锥体神经元活动增强。这一点在光照开启阶段（影片1）的放电事件增加中表现明显，相较于光照关闭阶段（图5a–b）。为支持该结果，对光刺激前（光照关闭；基线期）和光刺激后（光照开启）C.......

讨论

在过去十年中，AAV 载体的设计取得了显著进展。因此，越来越多的神经元特异性启动子被整合到多种 AAV 血清型中，以提高转染的特异性¹⁴。通过将荧光蛋白、转运蛋白、受体和离子通道的基因组合，现已构建出可用于成像、神经调控以及突触活动检测的 AAV 文库。在商业化的 AAV 载体中，将编码荧光蛋白的基因与离子通道（视蛋白）结合，可实现对神经环路的神经解剖学与电生理学联合示踪^14,18,19。同样，通过选择特定的启动子（或 cre-lox 重组系统），可实现对环路中特定类型神经元投射的示踪。在本研究中，该方案被用于对腹侧被盖区（VTA）谷氨酸能神经元投射至海马（CA1 区域）的解剖学和电生理学特征进行评估。

VTA-海马神经环路

腹侧被盖区（VTA.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3% 过氧化氢	Fisher chemical	H312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP	Addgene	质粒 #26969
BNC 电缆	Amazon
BNC 分路器	Amazon
用于 Ø1.25mm 陶瓷插芯的陶瓷分体对接套筒	Thorlabs	ADAL1-5
钻机	Dremel	LR 39098
明胶包被载玻片	Fisher scientific	OBSLD01CS
Hamilton 注射器（Neuros）	WPI Inc.	06H
前置放大器探头适配器	Neuronexus	Adpt-Q4-OM32
高阻抗硅探针	Neuronexus	Q1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512 通道记录控制器	INTAN	RHD2000
碘溶液	Dynarex	1425
异氟烷	Piramal	NDC 66794-017-25
氯胺酮	Spectrum	K1068
LED 驱动器	Thorlabs	LEDD1B
LED 光源（470 nm）—蓝光	Thorlabs	M470F3
显微操作器	Narishige	M0-203
光纤	Thorlabs	CFMLC14L05
盘头十字螺钉（M0.6 × 2 mm）	Amazon	M0.6 × 2 mm
前置放大器探头（32 通道）	INTAN	C3314
立体定位仪框架	Kopf	1530
TTL 脉冲发生器	Prizmatix	4031
氨基甲酸乙酯	Sigma	U2500
赛拉嗪	Alfa Aesar	J61430
软件	公司	版本
Graphpad Prism	GraphPad Software	版本 8
Intan 记录控制器	Intantech	版本 2.07
Neuroexplorer	Nex Technologies	版本 5.215
Plexon 离线尖峰排序器	Plexon Inc	版本 4.5
ACSF 配方：
持续通入 95% 氧气 / 5% CO2 的含氧 ACSF（ACSF；单位：mM，含 125 NaCl、25 NaHCO3、3 KCl、1.25 NaH2PO4、1 MgCl2、2 CaCl2 和 25 葡萄糖）。