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方法文章

生物噪声的连续测量 大肠杆菌 使用延时显微镜

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DOI：

10.3791/61290

⸱

2021年4月27日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Technion - Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本研究介绍了一种显微镜方法，可对大肠杆菌（Escherichia coli）的单个细胞进行活体成像，用于分析和量化合成基因线路的随机行为。

摘要

本方案提供了一种工具，可实现对 Escherichia coli 分裂过程及荧光水平长达数小时的计算机追踪。该过程首先在最低培养基上筛选能够存活的菌落，假设只有携带正确质粒的 Escherichia coli 才能在特定条件下正常生长。由于构建大型基因线路（需要组装多个DNA元件）具有挑战性，线路组件通常分布在不同拷贝数的多个质粒上，因此需使用多种抗生素。质粒中的突变可能破坏抗生素抗性基因的转录，并干扰细胞内的资源分配，从而导致细胞坏死。选取的单菌落被置于玻璃底培养皿中，并在明场和荧光成像模式下选择若干焦平面用于显微追踪。该方案在初始条件无法调控的情况下，可维持图像聚焦超过12小时，但由此也带来了一些困难。例如，成像数小时后，死亡细胞开始在镜头焦平面内积聚，导致毒素累积，信号模糊并衰减。营养物质的耗尽可能引发新的代谢过程，并抑制基因线路的预期响应。实验温度的降低会影响诱导剂和抗生素的作用效率，进一步损害信号的可靠性。最低培养基凝胶会收缩并干燥，导致光学焦点随时间发生变化。我们开发此方法旨在克服 Escherichia coli 中的上述挑战，类似于先前为其他微生物开发类似方法的研究。此外，该方法还提供了一种算法，用于量化未修饰细胞与修饰细胞中的总随机噪声，结果表明其变异系数（CV）与流式分析仪的预测结果一致。

引言

合成生物学是一个在过去十年中兴起的多学科交叉领域，旨在将工程学设计原理转化为理性的生物学设计1,2,3，以实现在活细胞中对多信号的整合与处理，从而深入理解基础科学问题4,5，并推动诊断、治疗及生物技术应用的发展6,7,8,9,10。近年来，单细胞技术的进步——包括流式分析仪和基于自动延时显微镜的活细胞成像——极大地提升了我们对合成基因线路输入-输出响应进行定量分析的能力11。流式分析仪常用于测量这些线路在稳态条件下的响应1,12，而倒置显微镜则可用于在单细胞水平上测量合成基因线路的动态响应3。例如，合成生物学早期的一项研究通过引入延迟负反馈环路，在活细胞中构建了基因振荡网络3。此后，这些基因振荡线路被进一步应用于研究活细胞动态环境中代谢调控的机制4。自动延时显微镜是表征此类线路的一种方法。我们假设，当大肠杆菌（Escherichia coli）形成微菌落时，宿主细胞会趋于同步，从而可在无需追踪精确母-子代关系的情况下测量信号并计算噪声水平。

噪声是生物系统中一种基本且固有的特性，通常来源于多种因素。例如，涉及信号传递的生化反应，其信号可能源自离散的随机载体的运输过程，如蛋白质的扩散13。这些信号在传播过程中伴随着随机波动14。其他噪声来源包括资源的可获得性、细胞分裂以及环境条件（如温度、湿度和压力）的变化。在合成基因回路中传播的生物信号通常具有非常低的信噪比（SNR），这会干扰此类回路的性能。因此，基因回路的设计仍然是基因工程中最富挑战性的方面之一15。例如，与大多数仅计算整个细胞群体中基因表达平均值的方法不同，现有研究通过考虑测量信号的方差，以期通过合成基因网络实现可预测的行为12。因此，蛋白质表达中变异程度或噪声水平在模拟和数字基因回路的设计与性能中起着主导作用1,16,17。

人们已开发出多种方法来量化细胞间的变异性，包括在Escherichia coli3,7,18中的研究。这些方法常用于研究基因激活和代谢通路，但在随机噪声动力学方面的应用相对较少，例如测量并区分特定的噪声来源，尤其是在活细胞中遗传回路的研究中，这仍是一个基本挑战19,20,21。多种因素，包括回路自身固有的（内在的）以及来自宿主细胞的（外在的）因素，都可能干扰遗传回路的持续性能。本文中，我们开发了一种旨在量化Escherichia coli 细胞中总噪声的方法，包括内在和外在的噪声来源6,22。通过量化总噪声并进一步评估信噪比（SNR）23，可优化基因回路的设计。该方法可通过监测多种荧光蛋白，进一步修改以分别测量独立的噪声来源6,20。在本研究所描述的实验方案中，我们严格控制环境条件，持续测量细胞活性，排除外部因素的干扰。我们随时间测量单个细胞中荧光蛋白的信号，并在琼脂糖基质上同时进行成像。所得图像使用实验室自定义的MATLAB程序进行分析。

理想情况下，对细胞内荧光蛋白实时活性进行连续测量，将能够获得贯穿细胞生长和分裂过程的准确数据。然而，获取此类数据具有挑战性。这是因为在激发过程中，荧光蛋白暴露于辐射时会发生降解，即所谓的光漂白7。此外，Escherichia coli 细胞对激发光也较为敏感，可能导致光毒性7。这两个问题均限制了可获取的图像帧数以及采集之间的时间间隔。成像过程中用于培养细胞的基质和培养基类型（例如，LB 培养基）也起着关键作用。我们强烈建议使用最小培养基，因其可最大限度减少非荧光背景信号，并延长细胞分裂时间。

此外，样品制备需考虑以下要求：（1）较低的细胞分裂速率可延长分裂周期的成像间隔，从而减少光毒性和光漂白的发生概率。我们将采集时间设定为预计有丝分裂时间的一半；（2）实验开始时较低的细胞密度有助于提高分裂过程的均匀性和可追踪性。细胞密度受接种时稀释比例的影响 大肠杆菌 细胞，这是本方案成功的关键参数，需由每个实验室自行确定。为确定该比例，每批新 大肠杆菌 所使用的菌株或培养基应配有生长速率曲线图（补充图1）。如果从约 OD 的初始密度开始，经过短时间培养后细胞能够在无需额外振荡的情况下生长，则表明已达到适当的比例。600 nm = 0.1。此阶段的细胞分裂仅取决于环境温度。（3）细胞运动的限制：细胞运动强烈依赖于基质（琼脂糖垫）的硬度。基质硬度取决于总琼脂糖含量及凝胶固化时间。凝胶不能在室温下放置过夜固化，因为这会 大肠杆菌 将进行有丝分裂。影响底物稳定性的其他因素包括样品中的含水量和环境湿度。其他问题将在下文中详细讨论。 代表性结果本方案提供了大量细节，逐步引导从一个步骤过渡到下一个步骤。该方案适用于成像实验的长期稳定性，并提供了一种基础的图像处理工具。 

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方案

1. 培养基与培养体系的制备

  1. 配制1,000倍浓缩的羧苄青霉素（50 mg/mL）或相应抗生素的母液。
    1. 称取0.5 g羧苄青霉素，加入10 mL无菌H2O. 完全溶解。
    2. 通过0.22 µm注射器滤器对羧苄青霉素储备液进行灭菌。将抗生素溶液分装后于-20 °C保存。
  2. 制备溶菌性培养基 LB 培养基平板：将 5 g 胰蛋白胨、5 g NaCl、2.5 g 酵母提取物和 7.5 g Bacto 琼脂与 0.5 L 无菌 H₂O 混合2O. 在121 °C下高压灭菌溶液20分钟。
    1. 将熔化的凝胶混合物部分浸入50 °C水浴中。加入1,000 µL羧苄青霉素（50 mg/mL）。
    2. 在无菌环境中制备培养皿。待培养基凝固后，置于冰箱中保存。
  3. 对于M9最小培养基，分别配制以下储存液：5倍浓度M9盐溶液（56.4 g/L）、2 M葡萄糖和2%不含生物素的酪蛋白氨基酸。将溶液在121 °C条件下高压灭菌20分钟。
  4. 准备5个培养皿，将1125 mg低熔点琼脂和400 mg琼脂与89.2 mL基础培养基（1× M9）混合，加入10 mL 2%酪蛋白氨基酸（2% [vol/vol]），置于250 mL锥形瓶中。
    注意：务必将培养基倒入烧瓶的内侧瓶口处。
  5. 将溶液以微波加热，每次持续3至4秒。重复操作直至溶液变澄清。
    注意：切勿达到沸点。
  6. 将250 mL锥形瓶置于60 °C的热水浴中，通过扩散进一步混合，并静置冷却至温度降至约45–50 °C。
  7. 在倒平板工作台处点燃火焰。
  8. 按以下顺序快速加入所有溶液：
    800 µL 的 50% 甘油（0.4% [体积/体积]）
    100 µL 硫胺素（B1）
    1100 µL 葡萄糖（2 M）
    100 µL 氨苄西林（50 mg/mL）。
  9. 轻轻旋动锥形瓶，以确保所有成分在琼脂中均匀分布。
  10. 一次打开一个培养皿，在火焰旁开始倾注。
    1. 将培养皿置于实验台上静置数分钟，直至初步凝固。
    2. 将培养皿倒置，以防止冷凝水滴落到凝胶上。
    3. 将平板在室温下静置约2小时，使其凝固。
    4. 平板凝固并干燥后，可于 4 °C 保存约 3 个月。

2. 细菌菌株与质粒构建

注意：该基因回路包含一个元件；即由PtetO启动子驱动的绿色荧光蛋白（GFP），可实现组成型表达。本研究中所有质粒均采用基本的分子克隆技术构建，并通过标准热激法转化至Escherichia coli 10β菌株中24。最终构建的质粒被转化至Escherichia coli MG1655野生型菌株中进行测试。

  1. 将目标质粒转化至 大肠杆菌 标准热激处理的MG1655细胞24.
  2. 在37°C下于LB琼脂平板中过夜培养转化后的细胞。
    注意：步骤 2.2 中的培养皿可用于显微镜观察，最多可保存 3 天。
  3. 将单个菌落接种于含有相应抗生素的5 mL LB液体培养基中，置于玻璃试管内。
  4. 在37 °C、250 rpm振荡条件下于培养箱中培养细胞2小时，直至液体变浑浊。
  5. 按下述方法配制1 mL稀释液：
    892 µL 最小培养基（1x M9）
    8 µL 50% 甘油（0.4% [体积/体积]）
    100 µL 的 2% 酪蛋白氨基酸（0.2% [wt/vol]）
    1 µL 硫胺素（B1）
    11 µL 葡萄糖（2 M）
    ​1 µL 相关抗生素
    1. 混合并离心。
  6. 将步骤 2.4 中的细胞培养物用 30 µL 稀释液按 1:30 的比例稀释至 2 mL 离心管中 大肠杆菌 稀释至1000 µL稀释液（步骤2.5）。
  7. 37 °C下振荡（250 rpm）孵育试管1小时。
  8. 在1.10步制备的M9平板上接种40 µL - 60 µL菌液，37 °C过夜培养。
    注意：光密度（OD600 nm铺板时的 OD 值应约为 0.1。
  9. 将最多三个35 mm玻璃底培养皿放置在实验台上。
    注意：确保培养皿的玻璃厚度与所用显微镜物镜的要求相匹配。
  10. 为在凝胶平板上接种培养物，重复步骤2.3至2.6，对步骤2.9制备的平板上的菌落进行显微镜测量。
  11. 配制以下溶液以制备三个显微镜载片。
    1. 将水浴预热至 60 °C。
    2. 将112.5 mg低熔点琼脂和40 mg琼脂与8.92 mL基础培养基（1× M9）混合，加入1 mL 2%酪蛋白氨基酸（终浓度0.2% [vol/vol]），置于25 mL锥形瓶中。
      注意：务必将培养基倒入烧瓶的内唇处。
  12. 将溶液以每次2至3秒的短时间进行微波处理，重复操作直至溶液变澄清。
    注意：切勿达到沸点。
  13. 将25 mL锥形瓶置于60 °C的热水浴中，通过扩散进一步混合，随后将其放在实验台上冷却，直至温度降至约45–50 °C。

3. 琼脂糖垫的制备

  1. 用70%乙醇清洁实验台。在清洁后的实验台上贴上胶带，确保胶带平整无褶皱。
  2. 准备两片盖玻片：一片贴在胶带上，另一片放置在附近。同时准备一个盖玻片盖子。
  3. 将步骤2.14中准备的烧瓶从水浴中取出，擦净烧瓶外壁，并静置冷却至温度降至约45–50 °C。
  4. 配制凝胶溶液时，按以下顺序迅速混合所有溶液：
    80 µL 50%甘油（0.4% [vol/vol]）
    1 mL 2%酪蛋白氨基酸（0.2% [wt/vol]）
    10 µL硫胺素（B1）
    110 µL葡萄糖（2 M）
    10 µL相应的抗生素。
  5. 取1.5 mL凝胶溶液滴加到盖玻片上，并用第二片盖玻片覆盖，形成"三明治"结构。
  6. 将锥形瓶放回热水浴中。用盖子盖住“三明治”结构，并设定计时器20分钟。
  7. 同时，将步骤2.11中的试管在37 °C下振荡培养1小时（250 rpm）。
  8. 20分钟后，翻转步骤3.5中的“三明治”结构，盖上盖子并静置1小时。
    注意：为获得更好效果，建议在步骤3.8期间将"三明治"结构置于4 °C下静置。
  9. 用移液器将步骤3.7中的大肠杆菌（Escherichia coli）培养物接种至35 mm培养皿中。
    注意：将6 µL细胞悬液以多个小液滴形式分别滴加可获得最佳效果。
  10. 让液滴自然干燥，时间至少15分钟，最长可达30分钟。
  11. 通过滑动移开盖玻片，暴露出步骤3.8中已固化的凝胶表面。
  12. 使用活检打孔器或枪头将“三明治”结构切割成多个独立的小块凝胶垫。
  13. 轻轻将凝胶垫倾斜靠在样品（步骤3.9）上。将培养皿在实验台上静置20分钟。

4. 为显微镜成像准备样品

  1. 从步骤 3.6 的水浴中取出烧瓶。擦干烧瓶外壁并冷却至室温（25 °C）。
    注意：在计时器结束前约 3 分钟进行步骤 4.1 时取出烧瓶。
  2. 以环形运动方式持续将 3 mL 凝胶倒入培养皿边缘。静置数分钟使其凝固。
  3. 用胶带密封培养皿，并用 25 G 针头刺几个小孔。将所有培养皿倒置，防止冷凝水滴落到凝胶表面。
  4. 将所有培养皿在 4 °C 下孵育 30 分钟，以确保完全凝固，同时抑制细胞有丝分裂。
    注意： 后续测量时样品可保留在 4 °C，但不超过一天。
  5. 按照制造商说明启动显微镜。
  6. 使用最低放大倍数的物镜找到初始焦点，并启动自动对焦系统（AFS）。
  7. 如需使用油镜，将镜油滴加至物镜上，并通过平台控制器（不可手动）移动载物台以均匀铺展镜油，随后可再次启动自动对焦系统（AFS）。
  8. 在 Z 方向上使用相对横截面模式，按照默认建议设置 Z 步长横截面。
    注意：我们每 5 分钟采集一次明场图像，每 20 分钟采集一次荧光图像。在前 30 分钟内有时需要调整焦点。预先加热显微镜孵育箱和镜油，同时对样品进行冷藏，有助于减少初始阶段的失焦现象。

5. 数据分析

注意：为了处理显微镜数据，我们基于 MATLAB 设计了一款计算机软件。该软件可从明场 tiff 图像中识别细胞边界，并根据面积对细胞进行分割和分类。此图像分析的输出结果可用作荧光 tiff 图像的掩膜，以提取细胞的荧光强度水平，并消除荧光图像域中的伪影（例如因显微镜分辨率限制导致的细胞晕轮）。本软件的开发借鉴了类似的研究工作7,25,26,27,28,29,30，并为本实验室提供了量身定制的高效解决方案。

  1. 首先，在 main_code.m 中定义以下参数。
    1. 定义采集图像的文件夹。
    2. 定义图像时间间隔——明场通道的时间步长（单位：分钟）。
    3. 定义 GFP 采集频率——GFP 图像的采集速率。
    4. 定义显微镜分辨率（即多少像素等于 1 µm）。
    5. 定义直方图分组范围——细胞面积范围。
      注意：根据细胞面积对数据进行分类的过程类似于流式细胞术数据分析中的设门原理。通过在具有共同特征（通常为前向散射光和侧向散射光）的细胞群周围设置门控，以分离并定量分析这些目标细胞群。显微镜技术可实现对多个细胞群体的设门、观察和定量。
    6. 定义卷积核（3,3）——该参数通过全局阈值法检测细胞边界（见 count_cells.m）。
      注意：仅在更换实验室或显微镜时需要进行此设置。软件要求输入的明场通道标记为 c1，荧光通道标记为 c2。
  2. 运行 main_code.m，该程序将自动运行所有其他脚本（count_cells.m, cell_growth_rate.m）。
    1. 程序自动对明场图像进行分割（参见 补充图 2-4）。
    2. 将分割后的图像与荧光图像（GFP）叠加，以提取每个细胞的荧光强度值。
    3. 计算细胞数量随时间变化的曲线，并按指数生长模型进行拟合。
    4. 计算每个细胞面积范围内的均值和标准差（STD）。
    5. 计算每个细胞面积范围内的信噪比（SNR）。
    6. 绘制并拟合细胞数量随荧光强度分布的曲线。
    7. 计算变异系数（CV），并与流式分析仪数据进行比较。
      注意：软件将在新文件夹 "yourfolder/Segmented" 中输出最终的分割图像，用于调整 conv_kernel；同时将在新文件夹 "yourfolder/Graphs 中输出所有图表。
  3. 为了比较不同实验之间的结果，请使用 compare_experiments.m。
    1. 定义已保存图表的目录路径以及 \CompareResult 目录的地址。
    2. 运行该文件。

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结果

该软件分析明场下的区域图像，图像背景呈灰白色，细胞呈黑色。大肠杆菌（Escherichia coli）在灰白色背景上呈现为黑色的长椭圆形结构，其亮度动态范围在中心位置应出现峰值（图1）。在荧光图像中，细胞可能带有微弱光晕，但仍可分辨出单个长椭圆形的细胞。分裂事件通常应在30分钟后首次被观察到。显微镜的焦距应随时间保持稳定，尽管细胞在30分钟内可能缓慢移动，但一般不会移出视野。满足上述条件的实验被视为合格，示例见图2。在低倍镜下，明场图像中的细胞可能较难识别。我们建议使用高拷贝数（HCN）质粒确定平均焦距，因其在低倍镜下易于观察。同时，应预先在高倍镜下测量低拷贝数（LCN）质粒，以设定平均焦距。该焦距主要取决于培养板、显微镜系统和镜油，而非凝胶厚度或大肠杆菌（Escherichia coli）菌株。

在将本方案应用于其他实验室时，可能会出现以下问题（1） 大肠杆菌 稀释比例不正确的平板（样品）可能显示细胞数量无变...

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讨论

在此研究中，我们建立了一种可实现计算机追踪的实验方案 大肠杆菌 活细胞在分裂后数小时内的荧光水平变化。本方案使我们能够定量分析基因线路的随机动力学行为 大肠杆菌 通过实时测量CV和SNR。在本方案中，我们比较了两种不同电路的随机行为，如图所示 图10已表明，拷贝数较低的质粒更容易受到随机效应的影响，且受细胞分裂的影响较小。第一个电路组成型表达GFP（图10a），第二个电路组成型表达 sfGFP 与 ssrA 降解标签融合（图10b）。为了量化荧光蛋白的随机行为，我们还记录了明场图像。结果表明，GFP 的表达，特别是在其成熟过程中39，是主要的噪声来源。在实验中观察到的周期性锯齿状行为模式 图10a 可归因于细胞分裂的随机过程以及GFP成熟所需较长的时间尺度（约50分钟）。相比之下， sf第二个回路的GFP信号在测量期间保持稳定，因为其成熟时间极短 sfGFP（约6分钟...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢吉尔·格尔伯特先生（以色列理工学院电气工程系）在 MATLAB 代码方面的协助。感谢李西明博士（以色列理工学院生物医学工程系）在本文校对方面提供的帮助。本研究部分得到了诺鲍尔家族基金会和以色列科学部（资助号：2027345）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
35 mm 玻璃培养皿mattekP35G-0.170-14-C厚度与显微镜物镜匹配
Agarose Lonza5004LB 培养基制备
AHL Sigma-AldrichK3007诱导剂
Bacto tryptone BD - Becton, Dickinson and Company 211705LB 培养基制备
CarbInvitrogen10177-012抗生素
CarbFormediumCAR0025抗生素
Casamino acids BD - Becton, Dickinson and Company 223050最小培养基溶液
eclipse Tinikon倒置显微镜
葡萄糖Sigma-AldrichG5767最小培养基溶液
甘油Bio-Lab000712050100最小培养基底物
Immersol 518Fzeiss4449600000000浸油
M9 盐溶液 Sigma-AldrichM6030最小培养基溶液
NaClBio-Lab214010LB 培养基制备
Noble 琼脂Sigma-AldrichA5431最小培养基底物
Parafilm 封口膜BemisPM-996文中简称为封口膜
Seaplaque GTG 琼脂糖Lonza50111最小培养基底物
硫胺素 B1Sigma-AldrichT0376 最小培养基溶液
酵母提取物BD - Becton, Dickinson and Company 212750LB 培养基制备

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