本研究介绍了一种显微镜方法，可对大肠杆菌（Escherichia coli）的单个细胞进行活体成像，用于分析和量化合成基因线路的随机行为。
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摘要
摘要
本方案提供了一种工具，可实现对 Escherichia coli 分裂过程及荧光水平长达数小时的计算机追踪。该过程首先在最低培养基上筛选能够存活的菌落，假设只有携带正确质粒的 Escherichia coli 才能在特定条件下正常生长。由于构建大型基因线路（需要组装多个DNA元件）具有挑战性，线路组件通常分布在不同拷贝数的多个质粒上，因此需使用多种抗生素。质粒中的突变可能破坏抗生素抗性基因的转录，并干扰细胞内的资源分配，从而导致细胞坏死。选取的单菌落被置于玻璃底培养皿中，并在明场和荧光成像模式下选择若干焦平面用于显微追踪。该方案在初始条件无法调控的情况下，可维持图像聚焦超过12小时，但由此也带来了一些困难。例如，成像数小时后，死亡细胞开始在镜头焦平面内积聚，导致毒素累积，信号模糊并衰减。营养物质的耗尽可能引发新的代谢过程，并抑制基因线路的预期响应。实验温度的降低会影响诱导剂和抗生素的作用效率，进一步损害信号的可靠性。最低培养基凝胶会收缩并干燥，导致光学焦点随时间发生变化。我们开发此方法旨在克服 Escherichia coli 中的上述挑战，类似于先前为其他微生物开发类似方法的研究。此外，该方法还提供了一种算法，用于量化未修饰细胞与修饰细胞中的总随机噪声，结果表明其变异系数（CV）与流式分析仪的预测结果一致。
引言
合成生物学是一个在过去十年中兴起的多学科交叉领域，旨在将工程学设计原理转化为理性的生物学设计1,2,3，以实现在活细胞中对多信号的整合与处理，从而深入理解基础科学问题4,5，并推动诊断、治疗及生物技术应用的发展6,7,8,9,10。近年来，单细胞技术的进步——包括流式分析仪和基于自动延时显微镜的活细胞成像——极大地提升了我们对合成基因线路输入-输出响应进行定量分析的能力11。流式分析仪常用于测量这些线路在稳态条件下的响应1,12，而倒置显微镜则可用于在单细胞水平上测量合成基因线路的动态响应3。例如，....
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方案
1. 培养基与培养体系的制备
- 配制1,000倍浓缩的羧苄青霉素（50 mg/mL）或相应抗生素的母液。
- 称取0.5 g羧苄青霉素，加入10 mL无菌H2O. 完全溶解。
- 通过0.22 µm注射器滤器对羧苄青霉素储备液进行灭菌。将抗生素溶液分装后于-20 °C保存。
- 制备溶菌性培养基 LB 培养基平板：将 5 g 胰蛋白胨、5 g NaCl、2.5 g 酵母提取物和 7.5 g Bacto 琼脂与 0.5 L 无菌 H₂O 混合2O. 在121 °C下高压灭菌溶液20分钟。
- 将熔化的凝胶混合物部分浸入50 °C水浴中。加入1,000 µL羧苄青霉素（50 mg/mL）。
- 在无菌环境中制备培养皿。待培养基凝固后，置于冰箱中保存。
- 对于M9最小培养基，分别配制以下储存液：5倍浓度M9盐溶液（56.4 g/L）、2 M葡萄糖和2%不含生物素的酪蛋白氨基酸。将溶液在121 °C条件下高压灭菌20分钟。
- 准备5个培养皿，将1125 mg低熔点琼脂和400 mg琼脂与89.2 mL基础培养基（1× M9）混合，加入10 mL 2%酪蛋白氨基酸（2% [vol/vol]），置于250 mL锥形瓶中。
注意：务....
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结果
该软件分析明场下的区域图像，图像背景呈灰白色，细胞呈黑色。大肠杆菌（Escherichia coli）在灰白色背景上呈现为黑色的长椭圆形结构，其亮度动态范围在中心位置应出现峰值（图1）。在荧光图像中，细胞可能带有微弱光晕，但仍可分辨出单个长椭圆形的细胞。分裂事件通常应在30分钟后首次被观察到。显微镜的焦距应随时间保持稳定，尽管细胞在30分钟内可能缓慢移动，但一般不会移出视野。满足上述条件的实验被视为合格，示例见图2。在低倍镜下，明场图像中的细胞可能较难识别。我们建议使用高拷贝数（HCN）质粒确定平均焦距，因其在低倍镜下易于观察。同时，应预先在高倍镜下测量低拷贝数（LCN）质粒，以设定平均焦距。该焦距主要取决于培养板、显微镜系统和镜油，而非凝胶厚度或大肠杆菌（Escherichia coli）菌株。
在将本方案应用于其他实验室时，可能会出现以下问题（1） 大肠杆菌 稀释比例不正确的平板（样品）可能显示细胞数量无变.......
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讨论
在此研究中，我们建立了一种可实现计算机追踪的实验方案 大肠杆菌 活细胞在分裂后数小时内的荧光水平变化。本方案使我们能够定量分析基因线路的随机动力学行为 大肠杆菌 通过实时测量CV和SNR。在本方案中，我们比较了两种不同电路的随机行为，如图所示 图10已表明，拷贝数较低的质粒更容易受到随机效应的影响，且受细胞分裂的影响较小。第一个电路组成型表达GFP（图10a），第二个电路组成型表达 sfGFP 与 ssrA 降解标签融合（图10b）。为了量化荧光蛋白的随机行为，我们还记录了明场图像。结果表明，GFP 的表达，特别是在其成熟过程中39，是主要的噪声来源。在实验中观察到的周期性锯齿状行为模式 图10a 可归因于细胞分裂的随机过程以及GFP成熟所需较长的时间尺度（约50分钟）。相比之下， sf第二个回路的GFP信号在测量期间保持稳定，因为其成熟时间极短 sfGFP（约6分钟.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢吉尔·格尔伯特先生（以色列理工学院电气工程系）在 MATLAB 代码方面的协助。感谢李西明博士（以色列理工学院生物医学工程系）在本文校对方面提供的帮助。本研究部分得到了诺鲍尔家族基金会和以色列科学部（资助号：2027345）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 35 mm 玻璃培养皿 | mattek | P35G-0.170-14-C | 厚度与显微镜物镜匹配 |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB 培养基制备 |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | 诱导剂 |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB 培养基制备 |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | 抗生素 |
| Carb | Formedium | CAR0025 | 抗生素 |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | 最小培养基溶液 |
| eclipse Ti | nikon | 倒置显微镜 | |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G5767 | 最小培养基溶液 |
| 甘油 | Bio-Lab | 000712050100 | 最小培养基底物 |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | 浸油 |
| M9 盐溶液 | Sigma-Aldrich | M6030 | 最小培养基溶液 |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB 培养基制备 |
| Noble 琼脂 | Sigma-Aldrich | A5431 | 最小培养基底物 |
| Parafilm 封口膜 | Bemis | PM-996 | 文中简称为封口膜 |
| Seaplaque GTG 琼脂糖 | Lonza | 50111 | 最小培养基底物 |
| 硫胺素 B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | 最小培养基溶液 |
| 酵母提取物 | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB 培养基制备 |
参考文献
- Daniel, R., Rubens, J. R., Sarpeshkar, R., Lu, T. K. Synthetic analog computation in living cells. Nature. 497, 619-623 (2013).
- Yang, X. S. Y., L, A. B. Imaging Bacterial Molecules, Structures and Cells. Harwood, C., Jensen, G. , (2016).
- Joyce, G., Robertson, B. D., Williams, K. J.
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