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方法文章

利用实体瘤移植物骨内植入建立原发性骨肿瘤与骨转移模型

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DOI：

10.3791/61313

⸱

2020年9月9日

 ,  , 
1Department of Pathology and O'Neal Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham, 2Surgical Discovery Centre, Department of Veterinary Medicine, University of Cambridge

本文内容

摘要

骨转移模型的转移发生并不均匀，且发生率并非100%。直接骨内注射肿瘤细胞可能导致肺栓塞。我们提出一种通过将实体瘤移植物植入骨骼来模拟原发性骨肿瘤和骨转移的技术，该方法可实现可重复的移植物植入与肿瘤生长。

摘要

原发性骨肿瘤或实体瘤的骨转移可导致疼痛性的溶骨性、成骨性或混合性溶骨/成骨病变。这些病变会破坏骨结构，增加病理性骨折的风险，并使患者面临治疗选择有限的困境。原发性骨肿瘤可转移至远处器官，某些类型还可扩散至其他骨骼部位。然而，近期研究表明，在许多实体瘤中，已扩散至骨骼的癌细胞可能是最终转移至其他器官系统的癌细胞的主要来源。目前大多数原发性骨肿瘤的同基因型或异种移植小鼠模型均采用将肿瘤细胞悬液直接注射入骨内（原位）的方法。一些实体瘤骨转移的动物模型也依赖于直接骨内注射，而另一些模型则通过血管内注射或原发肿瘤器官内注射细胞，试图模拟骨转移级联过程中的其他步骤。然而，这些模型均无法稳定地或以100%发生率诱导骨转移。此外，已有研究显示，直接骨内注射肿瘤细胞可能引起肺部肿瘤栓塞。这些栓塞的肿瘤细胞虽可成功植入，但并不能真实再现转移级联过程。我们报道了一种骨肉瘤小鼠模型，该模型采用微创手术技术，将新鲜或冻存的肿瘤组织碎片（包含肿瘤细胞及其间质）直接植入胫骨近端。这些动物可稳定出现肿瘤植入、生长，并随时间推移发生溶骨性破坏和肺转移。该技术具有良好的可扩展性，可用于建立实体瘤骨转移模型，并可灵活使用包含一种或多种细胞类型、基因修饰细胞、患者来源异种移植组织和/或可被光学或高级成像技术追踪的标记细胞的移植物。本文中，我们将演示利用实体瘤移植物植入骨骼来模拟原发性骨肿瘤及骨转移的技术。

引言

人类和动物疾病的鼠类模型在生物医学研究中正变得越来越受欢迎。在此背景下使用小鼠的优势在于，其解剖结构和生理特征与人类非常相似。小鼠的妊娠期相对较短，出生后达到成熟所需的时间也较短，且饲养成本相对较低、操作简便，尽管随着基因修饰程度的增加、免疫缺陷程度的提高和/或人源化水平的提升，其开发或购买成本也在不断上升1。使用近交系小鼠可在研究开始前获得遗传背景高度一致的动物群体。小鼠基因组已被全面解析，显示出与人类基因组高度相似。在小鼠基因组中已鉴定出许多疾病过程的同源分子靶点，且目前已有大量易于获取的小鼠特异性试剂库。因此，与大型动物模型相比，小鼠模型能够以更快的速度、更低的成本实现相对高通量的分析1。此外，随着基因编辑技术的发展，可实现特定基因的全身性或细胞类型特异性、组成型或诱导型的过表达或敲除，使得小鼠成为研究人类和动物疾病极具生物学价值的模型系统2。

癌症研究是小鼠模型具有重要应用价值的领域之一。癌症的遗传小鼠模型依赖于单独或联合调控癌基因或肿瘤抑制基因的表达，以诱导细胞发生癌变转化。此外，也可将原代或已建立的肿瘤细胞系注射入小鼠体内。将来自人类或其他动物物种（包括小鼠）的细胞系或组织引入体内，仍是目前最广泛使用的癌症体内模型。其中，在免疫缺陷小鼠中使用不同物种来源的细胞或组织（异种移植）最为常见2。然而，当供体与受体属于同一物种时（同种移植），若将肿瘤细胞或组织移植至相同品系的宿主小鼠体内，可在同源系统中实现与完整免疫系统的相互作用3。

原发性骨肿瘤或由实体瘤转移至骨的骨转移可导致疼痛性的溶骨性、成骨性或混合性溶骨/成骨病变3，4。这些肿瘤破坏骨结构，增加病理性骨折的风险，且患者治疗选择有限。原发性骨肿瘤可转移至远端器官，某些类型还可扩散至其他骨骼部位。在乳腺癌患者中，骨是首次转移最常见的部位，也是转移性肿瘤最常见的首发表现部位5，6。此外，在其他器官转移发生之前，骨髓中即可检测到播散性肿瘤细胞（DTCs），其存在可预测后续转移的发展7。因此，人们认为存在于骨中的癌细胞是最终转移至其他器官系统的细胞来源。目前已存在多种实体瘤转移的小鼠模型，这些模型主要在肺和淋巴结中形成转移灶，根据肿瘤类型和注射方法的不同，也可能累及其他器官系统3。然而，尚缺乏可靠且可重复地在小鼠因原发肿瘤负荷过重或转移至其他器官而需提前处死之前，即稳定产生特定骨骼转移灶的骨转移小鼠模型。我们曾报道一种原发性骨肿瘤——骨肉瘤的小鼠模型，该模型依赖于将实体瘤同系移植物外科植入小鼠胫骨近端8。该模型中，100%的小鼠形成骨肿瘤，88%出现肺转移。此转移发生率高于临床人群中通常报道的数据（约20–50%），但由于肺是骨肉瘤最常见的转移部位，因此该模型具有重要意义9，10，11。尽管该模型在模拟原发性骨肿瘤方面具有优势，但其在模拟乳腺、肺、前列腺、甲状腺、肝、肾及胃肠道等其他嗜骨性实体瘤的骨转移方面也具有重要应用价值。

建立该模型的目的是为了开发一种替代传统骨内注射（通常注射至近端胫骨或远端股骨）的方法，以用于模拟原发性骨肿瘤或骨转移12。我们的主要目标是克服该技术已知的局限性，即肿瘤细胞肺栓塞。这种情况会导致栓塞性肿瘤细胞在肺部定植，形成“人为性转移”，而无法真实再现由已确立的原发性骨肿瘤向肺部转移的完整转移级联过程8,13。当已确立的骨转移灶向远处部位扩散时，也会出现类似情况。此外，该技术的开发还旨在建立一种骨转移模型，与原位或血管内注射技术相比，能够确保更高的肿瘤定植率和骨内肿瘤生长率，并且转移部位更为一致。该模型相较于上述方法具有明显优势。该模型可实现对肿瘤细胞向骨组织的可控且稳定的递送。同时，它避免了因肺栓塞导致的人为性肺转移，建立了基线一致的研究群体。使用该模型可获得部位特异性的肿瘤，且无需担心因原发肿瘤或其他器官转移而导致的早期剔除标准。最后，该模型具有良好的可修改性，包括可使用患者来源的异种移植瘤（patient-derived xenografts）。

本模型与通过手术入路后将细胞悬液直接注射至骨组织的方法具有相似性，后者可通过骨皮质注射或将细胞注入骨髓腔（在骨皮质上制造小缺损后，无论是否扩髓）实现8,14,15,16,17。然而，本技术因植入肿瘤同种异体移植物而具有显著区别。因此，本报告旨在介绍一种可克服既往多种模型局限性的原发性骨肿瘤及实体瘤骨转移模型。具备细胞培养、小鼠模型、小鼠麻醉与手术操作以及小鼠解剖学经验的研究团队，均能顺利重现本研究建立的用于模拟小鼠原发性骨肿瘤或骨转移的技术。

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方案

所有描述的动物实验均经英国剑桥大学剑桥校区机构动物护理与使用委员会批准。

1. 细胞系的制备

  1. 根据实验室传统的细胞培养或小鼠注射标准操作规程培养细胞系。本实验中采用的标准培养条件为：在含10%胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基中培养（下文简称完全生长培养基）。
    注意：本实验使用Abrams骨肉瘤细胞接种于Balb/c Foxn1 nu/nu小鼠。对于乳腺癌研究，使用4T1细胞接种于Balb/c小鼠，或EO771细胞接种于C57BL/6小鼠。
  2. 将细胞置于通气的组织培养瓶或6孔组织培养板中，在37 °C、5% CO2条件下培养。
  3. 传代目标细胞系，并在细胞达到常用于小鼠注射的汇合度时，制备细胞用于注射。

2. 动物

  1. 使用至少6-8周龄的Balb/c Foxn1 nu/nu小鼠进行皮下肿瘤造模，以确保动物已度过快速生长期，并达到成年期和骨骼成熟期。
  2. 可选用雄性或雌性小鼠。仅在选择激素响应性细胞系时例外（例如，雌性小鼠接种乳腺癌细胞，雄性小鼠接种前列腺癌细胞）。
  3. 进行异种移植实验时，应使用免疫缺陷型无胸腺裸鼠，因为该细胞系在正常条件下与完整的小鼠免疫系统不相容。
  4. 在使用小鼠来源细胞系进行同种移植实验时，同样建议使用免疫缺陷型裸鼠，以避免小鼠遗传背景和免疫背景的差异影响实验结果。然而，在同系移植实验中，应使用与目标细胞系相同品系的动物。
  5. 根据各机构的饲养管理政策，按照标准密度饲养动物。

3. 皮下肿瘤

  1. 通过胰蛋白酶消化法从培养物中收获细胞系，并将其重悬于无菌磷酸盐缓冲液（PBS）中。
  2. 采用台盼蓝排斥法评估细胞活力并测定细胞密度。使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。用于注射小鼠以建立皮下肿瘤的细胞，其活力应至少达到90%。
  3. 调整细胞密度，使每0.1至0.15 mL（100至150 µL）无菌PBS中含1-2 × 105个细胞。细胞在注射前需置于冰上保存。
  4. 或者，将细胞在800 x g 条件下离心5分钟形成沉淀。弃去上清液，将沉淀细胞重悬于未稀释的无菌基底膜基质培养基中，使终体积为0.1至0.15 mL（100至150 µL），含1-2 × 105个细胞。细胞在进一步使用前需置于冰上保存。
  5. 使用氧气混合异氟烷对用于皮下肿瘤生长实验的小鼠进行麻醉。诱导麻醉剂量为5%异氟烷（氧气流速2 L/min），维持麻醉剂量为2-3%异氟烷（氧气流速2 L/min）。在继续操作前，需确认小鼠角膜反射或足底反射消失。
    注意：异氟烷为吸入性麻醉剂。应在通风良好的环境中使用，并配备适当的废气清除和收集系统。请咨询机构兽医人员，制定麻醉诱导、维持和监测方案，并确保实验室人员接受过麻醉监测及吸入性麻醉剂操作的适当培训。
  6. 使用脱毛剂或电动剃毛器去除麻醉小鼠胸部或腹部背侧区域的毛发。推荐使用脱毛剂以尽量减少对皮肤的潜在损伤。若使用裸鼠（athymic nude mice），可跳过此步骤。
  7. 在注射细胞悬液前，使用70%乙醇棉片清洁已准备好的区域。
  8. 使用1 mL结核菌素注射器和27 G针头，将细胞悬液注射至胸部或腹部背侧区域的皮下组织，注射位置应避开肩胛骨活动区域。或者，可将细胞以商业可得的细胞外基质为载体进行皮下注射。
    注意：商业可得的细胞外基质在室温下会凝固，因此可限制细胞悬液在皮下空间的迁移。
  9. 将小鼠转移至加热垫上的独立笼具中恢复，直至其能够自主活动。之后可将小鼠放回常规笼具，使用清洁干燥的垫料。
  10. 使用游标卡尺定期监测覆盖于胸部或腹部背侧的皮下肿瘤大小，并每周测量小鼠体重，以确保肿瘤未发生溃烂，且小鼠未达到机构动物护理与使用委员会规定的提前处死标准。建议肿瘤任一维度的最大尺寸不超过15 mm，以降低皮肤溃烂或肿瘤中心坏死的风险。
    注意：请参照当地指南确定允许的最大肿瘤尺寸或体积。
  11. 在接种后三至四周，通过CO2吸入法处死荷瘤小鼠，随后进行颈椎脱位。操作应遵循机构认可的小鼠安乐死政策。
  12. 采用无菌外科技术收获皮下肿瘤。若适用，先去除肿瘤表面毛发，再用70%乙醇对皮肤进行消毒。使用#15手术刀片（可配合或不配合刀柄）切开肿瘤表面皮肤。使用无菌外科剪刀锐性分离肿瘤与其周围附着的软组织。
  13. 将肿瘤置于含有完全生长培养基的6孔细胞培养板中，使用#15手术刀片（可配合或不配合刀柄）将其切割成多个预定大小的小片段（约0.6 mm × 0.6 mm × 0.6 mm – 0.25 mm3 至1 mm × 1 mm × 1 mm – 1 mm3）。
  14. 将肿瘤片段在室温下保存于无菌完全生长培养基中，直至进行胫骨内植入。对于携带荧光素酶或荧光报告基因的细胞系，可在植入小鼠前通过离体生物发光或荧光成像确认肿瘤活性。
  15. 如需冷冻保存，将多个肿瘤片段置于同一冻存管中，加入含20%胎牛血清（FBS）和10%二甲基亚砜（DMSO）的完全生长培养基。使用商用程序性冷冻系统在–80 °C条件下逐步降温，随后长期保存于液氮中。如仅用于后续分析而非再次移植，可通过液氮速冻方式保存肿瘤片段，并长期储存在–80 °C。
    注意：已有文献报道，速冻肿瘤无法在体内成功移植并生长8。

4. 皮下肿瘤组织片段的手术移植

  1. 在手术移植前，将皮下肿瘤的新鲜或冻存组织碎片置于完全培养基中，恢复至室温。
  2. 使用氧气混合异氟烷对目标品系小鼠进行麻醉，方法见第3节。在继续操作前确认足底反射消失。术前给予皮下注射布托啡诺，剂量为0.02–0.05 mg/kg，以提供围手术期镇痛。如需要，可在术后每6–8小时重复给药一次。
  3. 使用脱毛剂去除后肢右侧膝关节及近端胫骨区域的毛发，以尽量减少对皮肤的潜在损伤。
  4. 用外科消毒剂擦拭已准备好的区域。先用70%乙醇棉片擦拭，再交替使用氯己定和生理盐水进行擦洗。
  5. 在屈伸关节时，将膝关节远端紧邻的区域视为近端胫骨位置。
  6. 使用#15手术刀片（可带或不带刀柄）在肢体内侧近端胫骨水平处做一3–4 mm的切口。切开皮肤和皮下组织，暴露近端胫骨的内侧皮质。
  7. 用25 G针头尖端轻轻施压并同时旋转，于近端胫骨内侧皮质上钻出一个小孔。该孔应位于膝关节远端约2 mm处，且处于胫骨前、后皮质之间等距的位置。根据肿瘤组织碎片的大小选择合适的针头尺寸。
  8. 使用无菌镊子夹取肿瘤组织碎片，并将其插入近端胫骨的骨髓腔内。使用27至30 G针头将肿瘤碎片推入骨髓管。根据肿瘤碎片的大小，每个胫骨至少植入0.5 mm3的总肿瘤体积。根据所制备肿瘤碎片的大小，可能需要植入一个或多个碎片。
    注意：为防止或限制移植物从骨内移位，可在骨缺损处填充骨蜡或骨水泥，或在骨孔上方覆盖明胶海绵或皮下脂肪移植物。
  9. 使用无菌液体组织粘合剂或单个皮肤缝线闭合皮肤切口边缘。此部位不得使用伤口夹。若在术后使用荧光成像，需特别注意，因为组织粘合剂和缝线均可能产生荧光。
  10. 将小鼠置于加热垫上，在单独的笼子中恢复，直至能够自主活动。

5. 连续性和终点评估

  1. 使用异氟烷在氧气中进行麻醉，方法如前所述。
  2. 通过每周一次的数字化X射线摄影、生物发光或荧光成像（若使用表达荧光素酶或荧光报告基因的细胞）无创评估胫骨肿瘤生长情况。也可在清醒小鼠中通过游标卡尺测量植入部位肢体尺寸。
  3. 除传统监测荷瘤小鼠的指标（体重、活动水平、呼吸频率、理毛行为、姿势、精神状态和行为表现）外，还需每周监测小鼠是否出现后肢跛行、肿胀及手术部位感染的迹象。
  4. 在术后最初10-14天内密切观察皮肤切口，注意是否存在过度红肿、渗出或伤口裂开，直至皮肤伤口完全愈合。在4-5周后，根据研究终点评估要求，在小鼠存活状态下或实施安乐死后进行评估。

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结果

阳性结果将表现为肿瘤成功植入并随时间推移持续生长。根据肿瘤类型的不同，骨内肿瘤生长可能伴随进行性后肢跛行，但许多肿瘤即使存在明显的骨病变体征，也不会引起跛行。成功的肿瘤植入可通过高级影像学手段加以证实，表现为近端胫骨区域出现与目标细胞系骨表型（溶骨性、成骨性或混合性溶骨/成骨转移）相关的进行性X线、µCT或µMRI改变（图1）8。在我们此前的研究报告中，用于肿瘤移植物植入所造成的皮质骨缺损在术后1周即可在近端胫骨处观察到（图1A）。至第2周时，缺损邻近区域已出现明显的骨溶解和骨重塑现象。从第2周至第5周，可见进行性骨破坏以及伴随肿瘤植入与生长而形成的新骨（图1B-E）。对于携带报告基因的细胞系，骨组织的改变将伴随荧光或生物发光成像信号随时间逐渐增强。急性跛行可能是病理性骨折即将发生或已经发生的征象，需立即对小鼠进行细致的X线检查，并可能需要提前将其退出实验。根据所研究的肿瘤细胞系...

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讨论

本报告记录了我们通过胫骨内植入肿瘤同种异体移植物来建立原发性骨肿瘤或骨转移模型的方法。我们认为该过程包含若干关键步骤：应为肿瘤细胞悬液的皮下注射以及后续肿瘤组织片段的胫骨内植入建立安全的麻醉状态；在切除皮下移植物及进行胫骨内移植物植入时，均需对手术部位进行无菌准备；应制备大小均匀的肿瘤同种异体移植物片段，以便后续胫骨内植入；应在胫骨近端创建适当尺寸的骨缺损，以容纳肿瘤片段的植入；手术皮肤切口应完全闭合，以降低术后伤口并发症的风险。最后一个关键步骤是：如果在皮下注射的肿瘤细胞悬液中使用细胞外基质材料，则应遵循生产商推荐的操作说明，防止悬液在注射前发生凝固。正确的肢体无菌准备、术中无菌操作技术以及彻底的伤口闭合，将最大限度地减少术后手术伤口并发症的发生概率。

植入肿瘤的特征及手术技术对于将模型成功且可重复地纳入研究群体至关重要。首先应确认肿瘤异种移植或同种移植组织被直接植入胫骨髓腔内，并确保肿瘤组织完全位于骨内。为防止或限制移植物移位至骨外，可采取的改进措施包括：在骨缺损处使用骨蜡或骨水泥，或在骨孔上方覆盖明胶海绵或皮下脂肪移植物。另一种方法是通过在胫前肌下方于近端胫骨外侧建立的骨孔植...

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披露

Hildreth 博士由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 K01OD026527。  本内容完全由作者负责， 并不一定 代表 NIH 的官方观点。   

致谢

作者们感谢 Beth Chaffee 博士（兽医学博士、哲学博士、美国兽医病理学会认证专家）在本技术开发过程中所做出的重要贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#15 手术刀片Henry Schein Ltd.75614无
6 孔组织培养板Thermo Fisher Scientific10578911用于切碎肿瘤组织，也可用于细胞培养
Abrams 骨肉瘤细胞系不适用不适用无
配备异氟烷蒸发器和氧气瓶的麻醉机VetEquip901805无
动物体重秤Kent ScientificSCL- 1015无
BALB/c 裸鼠 (nu/nu)Charles River Ltd.NA6–8 周龄，雄性或雌性小鼠
骨水泥Depuy Synthes160504可选，可替代骨蜡使用
骨蜡EthiconW31G可选
丁丙诺啡Animalcare Ltd.N/ABuprecare 0.3 mg/ml 犬猫用注射液
二氧化碳安乐死装置N/AN/A应由动物设施提供
细胞培养孵箱，设定为 37 °C 和 5% 二氧化碳HeraeusVarious无
氯己定外科洗手液Vetoquinol411412无
冻存管（2 ml）Thermo Scientific Nalgene5000-0020如需冻存肿瘤碎片，则可选
D-荧光素（萤火虫），钾盐Perkin Elmer122799如目标细胞系含有生物发光报告基因，则可选
数显卡尺Mitutoyo500-181-30可使用手动卡尺
数字显微放射成像柜Faxitron Bioptics, LLCMX-20可选，用于评估肿瘤生长对骨骼的影响
二甲基亚砜（DMSO）Sigma Aldrich1371171000如需冻存肿瘤碎片，则可选
Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基Thermo Fisher Scientific11965092无
乙醇（70%）Sigma Aldrich2483无
胎牛血清Thermo Fisher Scientific26140079无
镊子，Dumont 型Fine Science Tools, Inc.11200-33无
超低温冰箱（– 80 °C）SanyoMDF-794C如需冻存或速冻肿瘤碎片，则可选
血细胞计数板Thermo Fisher Scientific11704939也可使用自动细胞计数仪（如有）
皮下注射针头（27 号）Henry Schein Ltd.DIS55510也可使用 25G（DIS55509）和 30G（目录号 DIS599）针头
冰N/AN/A理想情况下应为小块冰，用于储存注射器和细胞悬液
虹膜剪Fine Science Tools, Inc.14084-08无
异氟烷Henry Schein Ltd.1182098无
IVIS Lumina III 生物发光/荧光成像系统Perkin ElmerCLS136334如目标细胞系含有生物发光或荧光报告基因，则可选
L-谷氨酰胺Thermofisher scientifc25030081无
液氮British Oxygen CorporationNA如需冻存或速冻肿瘤碎片，则可选
5 升液氮杜瓦瓶Thermo Fisher ScientificTY509X1如需冻存肿瘤碎片，则可选
Matrigel® Matrix GFR，无 LDEV，5 mlCorning Life Sciences356230可选，也提供 10 ml 规格（354230）
微量离心机Thermo Fisher Scientific75002549以 1200 rpm 离心 5–6 分钟以沉淀细胞
Mr. Frosty 冻存容器Fisher Scientific10110051如需冻存肿瘤碎片，则可选
NAIR 脱毛乳液/油Thermo Fisher ScientificNC0132811也可使用带精细刀头的电动剃毛器
青霉素/链霉素Sigma-AldrichP4333无
手术刀柄，#7 短型Fine Science Tools, Inc.10007-12用户可根据偏好选择，只要能安装 #15 手术刀片即可
小型动物加热垫VetTechHE006无
体视显微镜GT Vision Ltd.H600BV1无
无菌磷酸盐缓冲液（PBS）Thermo Fisher Scientific10010023用于注射，也可作为外科洗手步骤的一部分，与氯己定交替使用
组织粘合剂（无菌）3M Corporation84-1469SB也可使用不可吸收缝线（6-0 规格）
台盼蓝Thermo Fisher Scientific5250061无
胰蛋白酶-EDTAThermo Fisher Scientific25300054使用 0.05%–0.25%
结核菌素注射器（1 ml，带 0.1 ml 刻度）Becton Dickinson309659滑动接头优于鲁尔接头
通气式组织培养瓶，T-75Corning Life SciencesCLS3290可根据需要使用更小或更大的培养瓶

参考文献

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