方法文章

通过实体瘤移植植入骨模拟原发性骨肿瘤和骨转移

DOI：

10.3791/61313

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2020年9月9日

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1Department of Pathology and O'Neal Comprehensive Cancer Center, University of Alabama at Birmingham, 2Surgical Discovery Centre, Department of Veterinary Medicine, University of Cambridge

本文内容

摘要

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骨转移模型不会均匀地发生转移或发生 100%。骨内肿瘤细胞直接注射可导致肺栓塞。我们展示了我们的技术，使用实体瘤移植物植入骨骼来模拟原发性骨肿瘤和骨转移，从而实现可重复的植入和生长。

摘要

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原发性骨肿瘤或实体瘤的骨转移会导致疼痛性溶骨性、成骨性或混合性溶骨性/成骨细胞性病变。这些病变会损害骨骼结构，增加病理性骨折的风险，并使患者的治疗选择有限。原发性骨肿瘤转移到远处器官，某些类型能够扩散到其他骨骼部位。然而，最近的证据表明，对于许多实体瘤，已经扩散到骨骼的癌细胞可能是最终转移到其他器官系统的细胞的主要来源。原发性骨肿瘤的大多数同系或异种移植小鼠模型涉及骨内（原位）注射肿瘤细胞悬液。实体瘤骨骼转移的一些动物模型也依赖于直接骨注射，而另一些动物则试图通过血管内或原发肿瘤器官注射细胞来概括骨转移级联的其他步骤。然而，这些模型都没有可靠地发生骨转移或发生率为 100%。此外，骨内直接注射肿瘤细胞已被证明与潜在的肺肿瘤栓塞有关。这些栓塞肿瘤细胞移植但不概括转移级联反应。我们报告了一种骨肉瘤小鼠模型，其中使用微创手术技术将新鲜或冷冻保存的肿瘤碎片（由肿瘤细胞和基质组成）直接植入胫骨近端。这些动物发展出可重复的植入、生长，并随着时间的推移出现骨质溶解和肺转移。该技术具有用于模拟实体瘤骨转移的多功能性，并且可以很容易地使用由一种或多种细胞类型、转基因细胞、患者来源的异种移植物和/或可以通过光学或高级成像跟踪的标记细胞组成的移植物。在这里，我们展示了这种技术，使用实体瘤移植物植入骨来模拟原发性骨肿瘤和骨转移。

引言

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人类和动物疾病的小鼠模型在生物医学研究中越来越受欢迎。在这种情况下使用小鼠的效用在于它们的解剖学和生理学与人类非常相似。它们的妊娠期和产后生命达到成熟的时间相对较短，并且主要与相对较低的成本和住房便利性有关，尽管开发或购买成本的增加与更大程度的基因改造、免疫缺陷和/或人源化有关1。使用近交品系导致在研究纳入之前动物种群基本均匀。对它们基因组的完整了解表明与人类高度相似。许多疾病过程的直系同源分子靶标已经在小鼠基因组中鉴定出来，现在有一个广泛的小鼠特异性试剂库，很容易获得。因此，与大型动物模型相比，它们以更快速、更便宜的方式提供了相对高通量分析的机会1。此外，随着基因编辑策略的出现，允许全局或以细胞类型特定方式和/或组成或诱导方式过表达或删除某些基因，它们代表了用于研究人类和动物疾病的非常生物学上有用的模型系统2。

癌症是小鼠模型具有巨大实用性的领域之一。癌症的遗传小鼠模型依赖于单独或组合调节癌基因或肿瘤抑制基因的表达，使细胞经历致癌转化。还进行将原代或已建立的肿瘤细胞系注射到小鼠中。从人类或其他动物物种（包括小鼠）引入细胞系或组织仍然是体内使用最广泛的癌症模型。在免疫功能低下的小鼠中使用来自不同物种（异种移植物）的细胞和组织是最常见的2。然而，当宿主和受体属于同一物种时，使用同种异体移植....

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方案

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所有描述的动物实验均获得英国剑桥大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 细胞系的制备

  1. 根据实验室的标准细胞培养方案培养细胞系，用于传统细胞培养或注射到小鼠体内。这里使用的标准方案是在Dulbecco的改良Eagle培养基中生长，其中含有10%胎牛血清（FBS），L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素（以下简称完全生长培养基）。
    注意:在本实验中，艾布拉姆斯骨肉瘤细胞用于Balb / c Foxn1 nu / nu 小鼠。对于乳腺癌研究，使用Balb / c小鼠中的4T1细胞和C57BL / 6小鼠中的EO771细胞。
  2. 在37°C的5%CO2中在通风的组织培养瓶或6孔组织培养板中培养细胞。
  3. 传代感兴趣的细胞系，并在细胞达到通常用于将这些细胞注射到小鼠中的汇合度时准备注射细胞。

2. 动物

  1. 使用至少6-8周龄的Balb/c Foxn1 nu/nu 小鼠进行皮下肿瘤生成，以确保动物超越快速生长期并已达到成年和骨骼成熟。
  2. 使用雄性或雌性小鼠。选择激素反应性细胞系时要例外（例如，雌性小鼠的乳腺癌细胞和雄性小鼠的前列腺癌细胞）。
  3. 对于异种移植实验，使用基于细胞系在正常条件下与完整小鼠免疫系统不相容的免疫缺陷无胸腺裸鼠。
  4. 对于使....

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结果

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阳性结果将与肿瘤植入和随着时间的推移进行性肿瘤生长有关。根据肿瘤类型，骨内肿瘤生长可能与进行性后肢跛行有关，但尽管伴有骨病体征，但许多肿瘤不会引起跛行。通过先进的成像记录了成功的植入，从而在与目标细胞系的骨表型（溶骨性、成骨细胞性或混合性溶骨/成骨细胞转移）相关的胫骨近端会发生进行性放射成像、μCT 或 μMRI 变化（图 1）8。在我们之前的报告中，植入后1周在胫骨近端可见为肿瘤移植物植入而产生的皮质缺陷（图1A）。到第2周，皮质缺损附近出现了可见的骨质溶解和骨重塑。从第2-5周开始，进行性骨破坏以及与肿瘤植入和生长相关的新骨的形成（图1B-E）。对于具有报告基因的细胞系，骨骼变化将伴随着荧光或生物发光成像输出随着时间的推移而增加。急性跛行可能是即将发生或实际病理性骨折的指标，需要立即对小鼠进行仔细的放射影像学评估，并可能尽早从研究中移除。根据正在研究的肿瘤细胞系，骨破坏可能会.......

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讨论

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本报告记录了我们在胫内植入肿瘤同种异体移植物后创建原发性骨肿瘤或骨转移的模型。我们认为，这一进程有几个关键步骤。应为皮下注射肿瘤细胞悬液和胫内放置所得肿瘤碎片建立安全的麻醉平面。手术部位应无菌准备，以移除皮下同种异体移植物和胫内放置同种异体移植物。应均匀地创建肿瘤同种异体移植片段，以便随后进行胫内植入。应在胫骨近端形成适当大小的缺损，以植入肿瘤碎片。手术皮肤伤口应完全闭合，以降低术后伤口并发症的风险。最后一个关键步骤是，如果将细胞外基质用作皮下注射的肿瘤细胞悬液的一部分，则应按照制造商推荐的处理说明进行操作，以避免在注射前悬浮液凝固。肢体的适当无菌准备、无菌的术中技术和完全闭合伤口将最大限度地减少术后手术伤口并发症的可能性。

植入肿瘤的特征和手术技术对于成功和可重复的结果以纳入您的研究人群至关重要。最初，应验证肿瘤异种移植物/同种异体移植物直接植入胫骨髓腔，确保肿瘤组织完全在骨内。防止或限制移植物移位到骨外的修改最初是在骨缺损中放置骨蜡或骨水泥，或者在骨孔上放置凝胶泡沫或皮下脂肪移植物。另一种方法是将肿瘤同种异体移植物插入颅胫肌下胫骨近端外侧的孔中。然后，颅胫肌的存在将作为骨缺损的.......

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披露

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Hildreth博士由NIH资助，奖励号为K01OD026527。 内容完全由作者负责，不一定代表NIH的官方观点。

致谢

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作者承认Beth Chaffee博士，DVM，PhD，DACVP对该技术发展的重要贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#15 手术刀刀片Henry Schein Ltd.75614无
6 孔组织培养板Thermo Fisher Scientific10578911用于切碎肿瘤块。也可用于细胞培养
艾布拉姆斯骨肉瘤 细胞系不适用不适用无
带异氟烷蒸发器和氧气罐的麻醉机VetEquip901805无
动物称重秤Kent ScientificSCL- 1015无
BALB/c 裸鼠 （nu/nu）Charles River Ltd.NA6-8 周龄。雄性或雌性小鼠
骨水泥Depuy Synthes160504可选用代替骨蜡
骨蜡EthiconW31G可选
丁丙诺啡Animalcare Ltd.N/ABuprecare 0.3 mg/ml 狗和猫注射液
二氧化碳安乐死站N/AN/A应在动物设施内提供
细胞培养箱设置为 37 °C 和 5% 二氧化碳HeraeusVarious无
洗必泰手术磨砂Vetoquinol411412无
冷冻管 （2 ml）Thermo Scientific Nalgene5000-0020可选，如果冷冻保存肿瘤片段
D-荧光素（萤火虫）、钾盐Perkin Elmer122799可选，如果感兴趣的细胞系具有生物发光报告基因
数字卡尺Mitutoyo500-181-30可手动
数字显微射线照相柜Faxitron Bioptics， LLCMX-20可选 评估骨骼对肿瘤生长的反应
二甲基亚砜 （DMSO）Sigma Aldrich1371171000可选 如果冷冻保存肿瘤碎片
Dulbecco's 修改后的鹰's 培养基Thermo Fisher Scientific11965092无
乙醇 （70%）Sigma Aldrich2483无
胎牛血清Thermo Fisher Scientific26140079无
镊子，DumontFine Science Tools， Inc.11200-33无
冷冻室 （– 80 °C）SanyoMDF-794C如果冷冻保存或快速冷冻肿瘤碎片，则为 可选
血细胞计数器Thermo Fisher Scientific11704939也可以使用自动细胞计数器（如果有
） 皮下注射针头（27 号）Henry Schein Ltd.DIS55510也可以使用 25G （DIS55509） 和 30G（目录 DIS599）针头
冰N/AN/A理想情况下，在容器中小块，用于注射器和细胞悬液储存
Iris 剪刀Fine Science Tools， Inc.14084-08无
异氟醚Henry Schein Ltd.1182098无
IVIS Lumina III 生物发光/荧光成像系统Perkin ElmerCLS136334如果感兴趣的细胞系具有生物发光或荧光报告基因，则为可选
L-谷氨酰胺Thermofisher scientifc25030081无
液氮British Oxygen CorporationNA如果冷冻保存或快速冷冻肿瘤片段，则为可选
液氮杜瓦瓶，5 升Thermo Fisher ScientificTY509X1如果冷冻保存肿瘤片段，则可选
Matrigel®基质 GFR，不含 LDEV，5 mL康宁生命科学356230可选。也可提供 10 ml 规格 （354230）
微量离心Thermo Fisher Scientific75002549以 1200 rpm 的速度沉淀细胞 5-6 分钟
Frosty 先生冷冻含水器Fisher Scientific10110051如果冷冻保存肿瘤片段，则可选
NAIR 脱毛剂 化妆水/油Thermo Fisher ScientificNC0132811也可使用带有细刀片的电动剪刀
青霉素/链霉素Sigma-AldrichP4333无
手术刀手柄，#7 ShortFine Science Tools， Inc.10007-12用户偏好只要接受 #15 手术刀刀片
小动物加热垫VetTechHE006无
立体显微镜GT Vision Ltd.H600BV1无
无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS）Thermo Fisher Scientific10010023用于注射，也用作手术擦洗的一部分，与洗必泰交替
粘合剂（无菌）3M Corporation84-1469SB可替代使用不可吸收的皮肤缝合线（6-0 尺寸）
台盼蓝Thermo Fisher Scientific5250061无
胰蛋白酶-EDTAThermo Fisher Scientific25300054使用 0.05%-0.25%
结核菌素注射器（1 ml，0.1 ml 渐变）Becton Dickinson309659Slip 吸头优于鲁尔
接头 通气组织培养瓶，T-75康宁生命科学CLS3290也可根据需要使用更小或更大的培养瓶
膏 机 使用 组织

参考文献

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  1. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  2. Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6

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