骨转移模型的转移发生并不均匀，且发生率并非100%。直接骨内注射肿瘤细胞可能导致肺栓塞。我们提出一种通过将实体瘤移植物植入骨骼来模拟原发性骨肿瘤和骨转移的技术，该方法可实现可重复的移植物植入与肿瘤生长。
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摘要
摘要
原发性骨肿瘤或实体瘤的骨转移可导致疼痛性的溶骨性、成骨性或混合性溶骨/成骨病变。这些病变会破坏骨结构，增加病理性骨折的风险，并使患者面临治疗选择有限的困境。原发性骨肿瘤可转移至远处器官，某些类型还可扩散至其他骨骼部位。然而，近期研究表明，在许多实体瘤中，已扩散至骨骼的癌细胞可能是最终转移至其他器官系统的癌细胞的主要来源。目前大多数原发性骨肿瘤的同基因型或异种移植小鼠模型均采用将肿瘤细胞悬液直接注射入骨内（原位）的方法。一些实体瘤骨转移的动物模型也依赖于直接骨内注射，而另一些模型则通过血管内注射或原发肿瘤器官内注射细胞，试图模拟骨转移级联过程中的其他步骤。然而，这些模型均无法稳定地或以100%发生率诱导骨转移。此外，已有研究显示，直接骨内注射肿瘤细胞可能引起肺部肿瘤栓塞。这些栓塞的肿瘤细胞虽可成功植入，但并不能真实再现转移级联过程。我们报道了一种骨肉瘤小鼠模型，该模型采用微创手术技术，将新鲜或冻存的肿瘤组织碎片（包含肿瘤细胞及其间质）直接植入胫骨近端。这些动物可稳定出现肿瘤植入、生长，并随时间推移发生溶骨性破坏和肺转移。该技术具有良好的可扩展性，可用于建立实体瘤骨转移模型，并可灵活使用包含一种或多种细胞类型、基因修饰细胞、患者来源异种移植组织和/或可被光学或高级成像技术追踪的标记细胞的移植物。本文中，我们将演示利用实体瘤移植物植入骨骼来模拟原发性骨肿瘤及骨转移的技术。
引言
人类和动物疾病的鼠类模型在生物医学研究中正变得越来越受欢迎。在此背景下使用小鼠的优势在于，其解剖结构和生理特征与人类非常相似。小鼠的妊娠期相对较短，出生后达到成熟所需的时间也较短，且饲养成本相对较低、操作简便，尽管随着基因修饰程度的增加、免疫缺陷程度的提高和/或人源化水平的提升，其开发或购买成本也在不断上升1。使用近交系小鼠可在研究开始前获得遗传背景高度一致的动物群体。小鼠基因组已被全面解析，显示出与人类基因组高度相似。在小鼠基因组中已鉴定出许多疾病过程的同源分子靶点，且目前已有大量易于获取的小鼠特异性试剂库。因此，与大型动物模型相比，小鼠模型能够以更快的速度、更低的成本实现相对高通量的分析1。此外，随着基因编辑技术的发展，可实现特定基因的全身性或细胞类型特异性、组成型或诱导型的过表达或敲除，使得小鼠成为研究人类和动物疾病极具生物学价值的模型系统2。
癌症研究是小鼠模型具有重要应用价值的领域之一。癌症的遗传小鼠模型依赖于单独或联合调控癌基因或肿瘤抑制基因的表达，以诱导细胞发生癌变转化。此外，也可将原代或已建立的肿瘤细胞系注射入小鼠体内。将来自人类或其他动物物种（包括小鼠）的细胞系或组织引入体内，仍是目前最广泛使用的癌症体内模型。其中，在免疫缺陷小鼠中使用不同物种来源的细胞或组织（异种移植）最为常见2....
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方案
所有描述的动物实验均经英国剑桥大学剑桥校区机构动物护理与使用委员会批准。
1. 细胞系的制备
- 根据实验室传统的细胞培养或小鼠注射标准操作规程培养细胞系。本实验中采用的标准培养条件为：在含10%胎牛血清（FBS）、L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基中培养（下文简称完全生长培养基）。
注意：本实验使用Abrams骨肉瘤细胞接种于Balb/c Foxn1 nu/nu小鼠。对于乳腺癌研究，使用4T1细胞接种于Balb/c小鼠，或EO771细胞接种于C57BL/6小鼠。 - 将细胞置于通气的组织培养瓶或6孔组织培养板中，在37 °C、5% CO2条件下培养。
- 传代目标细胞系，并在细胞达到常用于小鼠注射的汇合度时，制备细胞用于注射。
2. 动物
- 使用至少6-8周龄的Balb/c Foxn1 nu/nu小鼠进行皮下肿瘤造模，以确保动物已度过快速生长期，并达到成年期和骨骼成熟期。
- 可选用雄性或雌性小鼠。仅在选择激素响应性细胞系时例外（例如，雌性小鼠接种乳腺癌细胞，雄性小鼠接种前列腺癌细胞）。
- 进行异种移植实验时，应使用免疫缺陷型无胸腺裸鼠，因为该细胞系在正常条件下与完整的小鼠免疫系统不相容。
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结果
阳性结果将表现为肿瘤成功植入并随时间推移持续生长。根据肿瘤类型的不同，骨内肿瘤生长可能伴随进行性后肢跛行，但许多肿瘤即使存在明显的骨病变体征，也不会引起跛行。成功的肿瘤植入可通过高级影像学手段加以证实，表现为近端胫骨区域出现与目标细胞系骨表型（溶骨性、成骨性或混合性溶骨/成骨转移）相关的进行性X线、µCT或µMRI改变（图1）8。在我们此前的研究报告中，用于肿瘤移植物植入所造成的皮质骨缺损在术后1周即可在近端胫骨处观察到（图1A）。至第2周时，缺损邻近区域已出现明显的骨溶解和骨重塑现象。从第2周至第5周，可见进行性骨破坏以及伴随肿瘤植入与生长而形成的新骨（图1B-E）。对于携带报告基因的细胞系，骨组织的改变将伴随荧光或生物发光成像信号随时间逐渐增强。急性跛行可能是病理性骨折即将发生或已经发生的征象，需立即对小鼠进行细致的X线检查，并可能需要提前将其退出实验。根据所研究的肿瘤细胞系.......
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讨论
本报告记录了我们通过胫骨内植入肿瘤同种异体移植物来建立原发性骨肿瘤或骨转移模型的方法。我们认为该过程包含若干关键步骤：应为肿瘤细胞悬液的皮下注射以及后续肿瘤组织片段的胫骨内植入建立安全的麻醉状态；在切除皮下移植物及进行胫骨内移植物植入时，均需对手术部位进行无菌准备；应制备大小均匀的肿瘤同种异体移植物片段，以便后续胫骨内植入；应在胫骨近端创建适当尺寸的骨缺损，以容纳肿瘤片段的植入；手术皮肤切口应完全闭合，以降低术后伤口并发症的风险。最后一个关键步骤是：如果在皮下注射的肿瘤细胞悬液中使用细胞外基质材料，则应遵循生产商推荐的操作说明，防止悬液在注射前发生凝固。正确的肢体无菌准备、术中无菌操作技术以及彻底的伤口闭合，将最大限度地减少术后手术伤口并发症的发生概率。
植入肿瘤的特征及手术技术对于将模型成功且可重复地纳入研究群体至关重要。首先应确认肿瘤异种移植或同种移植组织被直接植入胫骨髓腔内，并确保肿瘤组织完全位于骨内。为防止或限制移植物移位至骨外，可采取的改进措施包括：在骨缺损处使用骨蜡或骨水泥，或在骨孔上方覆盖明胶海绵或皮下脂肪移植物。另一种方法是通过在胫前肌下方于近端胫骨外侧建立的骨孔植.......
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披露
Hildreth 博士由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助编号为 K01OD026527。 本内容完全由作者负责， 并不一定 代表 NIH 的官方观点。
致谢
作者们感谢 Beth Chaffee 博士（兽医学博士、哲学博士、美国兽医病理学会认证专家）在本技术开发过程中所做出的重要贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #15 手术刀片 | Henry Schein Ltd. | 75614 | 无 |
| 6 孔组织培养板 | Thermo Fisher Scientific | 10578911 | 用于切碎肿瘤组织，也可用于细胞培养 |
| Abrams 骨肉瘤细胞系 | 不适用 | 不适用 | 无 |
| 配备异氟烷蒸发器和氧气瓶的麻醉机 | VetEquip | 901805 | 无 |
| 动物体重秤 | Kent Scientific | SCL- 1015 | 无 |
| BALB/c 裸鼠 (nu/nu) | Charles River Ltd. | NA | 6–8 周龄，雄性或雌性小鼠 |
| 骨水泥 | Depuy Synthes | 160504 | 可选，可替代骨蜡使用 |
| 骨蜡 | Ethicon | W31G | 可选 |
| 丁丙诺啡 | Animalcare Ltd. | N/A | Buprecare 0.3 mg/ml 犬猫用注射液 |
| 二氧化碳安乐死装置 | N/A | N/A | 应由动物设施提供 |
| 细胞培养孵箱，设定为 37 °C 和 5% 二氧化碳 | Heraeus | Various | 无 |
| 氯己定外科洗手液 | Vetoquinol | 411412 | 无 |
| 冻存管（2 ml） | Thermo Scientific Nalgene | 5000-0020 | 如需冻存肿瘤碎片，则可选 |
| D-荧光素（萤火虫），钾盐 | Perkin Elmer | 122799 | 如目标细胞系含有生物发光报告基因，则可选 |
| 数显卡尺 | Mitutoyo | 500-181-30 | 可使用手动卡尺 |
| 数字显微放射成像柜 | Faxitron Bioptics, LLC | MX-20 | 可选，用于评估肿瘤生长对骨骼的影响 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma Aldrich | 1371171000 | 如需冻存肿瘤碎片，则可选 |
| Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | 无 |
| 乙醇（70%） | Sigma Aldrich | 2483 | 无 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | 无 |
| 镊子，Dumont 型 | Fine Science Tools, Inc. | 11200-33 | 无 |
| 超低温冰箱（– 80 °C） | Sanyo | MDF-794C | 如需冻存或速冻肿瘤碎片，则可选 |
| 血细胞计数板 | Thermo Fisher Scientific | 11704939 | 也可使用自动细胞计数仪（如有） |
| 皮下注射针头（27 号） | Henry Schein Ltd. | DIS55510 | 也可使用 25G（DIS55509）和 30G（目录号 DIS599）针头 |
| 冰 | N/A | N/A | 理想情况下应为小块冰，用于储存注射器和细胞悬液 |
| 虹膜剪 | Fine Science Tools, Inc. | 14084-08 | 无 |
| 异氟烷 | Henry Schein Ltd. | 1182098 | 无 |
| IVIS Lumina III 生物发光/荧光成像系统 | Perkin Elmer | CLS136334 | 如目标细胞系含有生物发光或荧光报告基因，则可选 |
| L-谷氨酰胺 | Thermofisher scientifc | 25030081 | 无 |
| 液氮 | British Oxygen Corporation | NA | 如需冻存或速冻肿瘤碎片，则可选 |
| 5 升液氮杜瓦瓶 | Thermo Fisher Scientific | TY509X1 | 如需冻存肿瘤碎片，则可选 |
| Matrigel® Matrix GFR，无 LDEV，5 ml | Corning Life Sciences | 356230 | 可选，也提供 10 ml 规格（354230） |
| 微量离心机 | Thermo Fisher Scientific | 75002549 | 以 1200 rpm 离心 5–6 分钟以沉淀细胞 |
| Mr. Frosty 冻存容器 | Fisher Scientific | 10110051 | 如需冻存肿瘤碎片，则可选 |
| NAIR 脱毛乳液/油 | Thermo Fisher Scientific | NC0132811 | 也可使用带精细刀头的电动剃毛器 |
| 青霉素/链霉素 | Sigma-Aldrich | P4333 | 无 |
| 手术刀柄，#7 短型 | Fine Science Tools, Inc. | 10007-12 | 用户可根据偏好选择，只要能安装 #15 手术刀片即可 |
| 小型动物加热垫 | VetTech | HE006 | 无 |
| 体视显微镜 | GT Vision Ltd. | H600BV1 | 无 |
| 无菌磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | 用于注射，也可作为外科洗手步骤的一部分，与氯己定交替使用 |
| 组织粘合剂（无菌） | 3M Corporation | 84-1469SB | 也可使用不可吸收缝线（6-0 规格） |
| 台盼蓝 | Thermo Fisher Scientific | 5250061 | 无 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 使用 0.05%–0.25% |
| 结核菌素注射器（1 ml，带 0.1 ml 刻度） | Becton Dickinson | 309659 | 滑动接头优于鲁尔接头 |
| 通气式组织培养瓶，T-75 | Corning Life Sciences | CLS3290 | 可根据需要使用更小或更大的培养瓶 |
参考文献
- Bryda, E. C. The Mighty Mouse: the impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
- Vandamme, T. F. Use of rodents as models of human diseases. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 6
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