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无菌美洲大蠊（Periplaneta americana）的建立与维持

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DOI：

10.3791/61316

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2021年5月28日

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1Department of Microbiology, University of Georgia

本文内容

摘要

本方案用于通过在卵鞘（卵荚）孵化前进行表面灭菌，以建立和维持无特定病原体的美洲大蠊（Periplaneta americana）。这些无特定病原体昆虫含有其垂直传播的Blattabacterium内共生菌，但肠道处于无菌状态。

摘要

无菌动物是研究微生物组结构与功能调控机制的有力工具。本文介绍了一种建立和维持无特定微生物的美洲大蠊（Periplaneta americana）的实验方案。该方法包含内置的无菌检测步骤，用于持续的质量控制。此处定义的无特定微生物昆虫是指仍携带其垂直传播的内共生菌（Blattabacterium），但缺乏通常存在于体表及消化道中的其他微生物的大蠊。在本方案中，从非无菌种群中取出卵鞘（oothecae），并对其进行表面灭菌。收集并灭菌后，将卵鞘置于脑心浸液（BHI）琼脂上，在30 °C下孵育约4−6周，直至孵化或因污染而被移除。孵化出的若虫被转移至含有BHI基质、无菌水和无菌大鼠饲料的锥形瓶中。为确保若虫体内不携带在当前条件下无法在BHI上生长的微生物，额外采用限制性片段长度多态性（RFLP）技术检测非内共生微生物，作为补充质量控制措施。通过该方法获得的无特定微生物若虫可接种简单或复杂的微生物群落，用于肠道微生物组研究。

引言

无菌动物已被证明是微生物组研究中不可或缺的工具1,2,3。无菌动物和已知菌群动物有助于阐明宿主与微生物之间的相互作用，包括宿主免疫反应、肠道上皮成熟以及宿主代谢过程1,4,5,6,7。接种了简化微生物群落的无菌动物也有助于更全面地理解肠道微生物群落中微生物之间的相互作用，特别是在解析互养关系和拮抗关系方面8,9,10,11。目前哺乳动物肠道微生物组研究中首选的模型系统是小鼠模型。尽管该系统在上述发现中发挥了关键作用，但其主要缺点在于成本高昂。建立和维持一个无菌动物设施需要专门的设备和高度训练的技术人员。再加上无菌动物饲养过程中各个环节都需要格外谨慎，导致无菌动物的繁育成本比标准动物模型高出十到二十倍12。由于成本过高，许多研究人员可能无法负担无菌小鼠模型。此外，尽管小鼠模型在旨在转化至人类健康的研究中被广泛接受，但人类与小鼠肠道之间仍存在许多生理和形态学上的差异13。显然，单一模型不足以回答关于肠道微生物组各个方面的日益增多的问题。

由于昆虫的维持成本远低于哺乳动物，因此昆虫模型是一种更为经济的替代选择。在多种昆虫物种中开展的大量无菌和已知菌群研究，已促成了多个常用模型的建立。蚊子和Drosophila是常见的无菌研究模型，因其与全球性疾病的相关性以及遗传操作的便利性14,15。另一个新兴的模型系统是蜜蜂（Apis mellifera），这源于其在授粉和社会性行为研究中的重要地位16。然而，许多常用的昆虫模型缺乏哺乳动物肠道菌群所具有的分类学复杂性17，限制了其对高阶相互作用的模拟能力。美洲大蠊肠道中微生物的总体多样性不仅更接近哺乳动物，而且其中许多微生物属于在哺乳动物和人类肠道微生物群中常见的科和门18。此外，蟑螂的后肠在功能上类似于哺乳动物的大肠，是一个富含细菌的发酵腔室，有助于营养物质的提取19,20。最后，蟑螂的杂食性使其能够适应多种饮食模式，这是食性特化的物种所无法实现的。

美洲大蠊可作为研究高等生物肠道微生物群落的有用模型系统，但其作为害虫的身份也使该系统在害虫防治方面具有实际意义21。利用关于肠道菌群对蟑螂健康和生理影响的基础知识，有助于开发新的害虫管理技术。

本方法旨在全面描述无菌美洲大蠊（Periplaneta americana）的建立与维持过程，但该方案也可用于获得任何卵生蟑螂的若虫。本方法包括一种高效、非侵入性的成熟卵鞘采集方法，以及一种非破坏性技术，用于监测昆虫的无菌状态22,23,24。尽管以往实现和维持无菌蟑螂的方法中已描述了卵鞘采集过程23,24,25,26,27，但卵鞘成熟度的判断要么依赖于物种特异性的提示（如在德国小蠊Blattella germanica中22,24,25），要么未明确描述27,28，这使得不熟悉该系统的操作者难以实施。由于本方法采用自然脱落的卵鞘，因此避免了过早取卵导致的误差。该方案包含依赖培养和非依赖培养两种质量控制方法，其中依赖培养的方法无需牺牲昆虫。最后，本方法整合了多项无菌蟑螂研究的信息，形成了一套完整、详尽的实验方案，提供了实现和维持无菌蟑螂所需的全部必要信息。

方案

1. 材料准备

  1. 维持蜚蠊种群培养
    注意：饲养这些强健的昆虫有多种方法。提供遮蔽物和水源的具体方式可根据可获得的材料而有所不同（例如，使用蛋盒代替纸管）。以下灭菌方案适用于任何种群培养箱的设置。
    1. 在37.85 L（10加仑）的鱼缸中铺入足够量的木屑垫料，使其覆盖缸底，厚度约为1英寸。通过将（扁平）纸板裁剪成2英寸×4英寸的片状来准备栖息环境。将纸板片插入纸管（例如卫生纸卷芯）中，并将纸管堆叠在缸的一端（图1）。
    2. 在缸内顶部两英寸处涂抹一层薄薄的凡士林，以防止昆虫逃逸。
      注意：务必彻底涂抹缸角内侧。
    3. 通过将（已使用的）纸管从先前的种群缸中转移，并轻轻摇晃以释放其中的个体，从而加入蜚蠊。每次转移时，加入100−200只不同年龄和性别的混合蜚蠊。添加狗粮（20−30块），监测缸内狗粮的剩余量，并在不足时补充。
    4. 设置一个水盘。
      1. 用双蒸水（ddH2O）装满一个小型可重复使用的塑料食品容器。将纤维素海绵裁剪成与食品容器盖上的孔大小相近的尺寸，并在盖上打孔。
        注意：纤维素海绵可防止蜚蠊在水盘中溺亡。
    5. 将海绵插入盖上的孔中，并将盖子盖在装满水的容器上。将容器放入缸中，并在水量减少时及时补充。用棉布覆盖缸口，并用橡皮筋固定。
    6. 当培养缸中开始积聚大量虫粪和昆虫尸体时，应设立新的培养缸并转移蜚蠊。
      注意：通常每6个月转移一次培养缸。废弃种群缸中残留的蜚蠊或卵鞘需在-20 °C下冷冻1小时以实施安乐死，随后将缸内内容物转移至高压灭菌袋中进行高压灭菌处理（1小时，重力循环），然后丢弃。种群缸在再次使用前需用2%次氯酸钠溶液进行灭菌。
  2. 对次级容器进行消毒。
    注意：该容器不包含滤膜，但允许自由空气交换。
    1. 用2%次氯酸钠溶液喷洒容器盖和底部内侧，并静置10分钟。随后用干净的纸巾擦去残留的次氯酸钠溶液。
    2. 用70%乙醇喷洒盖和底部内侧，并用干净的纸巾擦干。盖上盖子，待用。
  3. 制备用于孵化卵和饲养若虫的BHI斜面和锥形瓶。
    1. 按照包装说明配制BHI培养基，加入2%琼脂。将BHI-琼脂溶液煮沸至澄清。
    2. 对于斜面制备，将5 mL等分试样转移至18 mm × 150 mm的玻璃试管中并加盖。通过高压灭菌进行灭菌（灭菌时间=20分钟，液体循环）。将灭菌后的试管以45°角放置冷却，形成斜面。凝固后冷藏保存，以防干燥。
    3. 对于锥形瓶，将煮沸后的BHI-琼脂溶液以10 mL等分试样转移至250 mL的锥形瓶中，使其完全覆盖瓶底。用铝箔覆盖瓶口，并通过高压灭菌进行灭菌（20分钟，液体循环）。让灭菌后的锥形瓶冷却后冷藏保存，以防干燥。
      注意：此装置无需空气滤膜。铝箔覆盖足以允许气体交换，同时防止外界空气污染。
  4. 通过高压灭菌对以下物品进行灭菌：将铝箔包裹的烧杯中的可高压灭菌大鼠饲料掰成半块大小（约1/2英寸大小的碎片）（灭菌时间=1小时，重力循环）；装在带盖瓶中的ddH2O（灭菌时间=20分钟，液体循环）；以及铝箔包裹烧杯中的镊子（灭菌时间=20分钟，重力循环）。
    注意：不要将大鼠饲料烧杯装得太满。颗粒在高压灭菌过程中会膨胀。
  5. 设置“产房”培养缸。
    注意：该培养缸包含与种群缸相同的材料（纸管、带海绵的水盘、狗粮、木屑垫料；见图1），除非为收集卵鞘而转移蜚蠊（见第2节），否则应保持无蜚蠊状态。
  6. 通过准备一杯饱和氯化钠（NaCl）溶液来增加培养箱的湿度。该溶液的配制方法为：每100 mL ddH2O中加入37 g NaCl，搅拌至完全溶解。
    注意：通常，500 mL的饱和盐溶液可在需要补充水分前，为尺寸为51 cm × 46 cm × 46 cm（高×宽×深）的培养箱维持约一个月的湿度。

2. 蜚蠊卵鞘的收集

  1. 使用镊子移动装有怀卵雌虫的纸管，将携带卵鞘的雌虫（数量根据计划实验的需要而定）（图2）从种群饲养罐转移至“产房”。
    1. 如果纸管中除怀卵雌虫外还含有多个其他昆虫，应先将纸管中的昆虫轻轻振落到另一个内壁涂有凡士林的塑料容器中，然后引导目标昆虫单独爬回原纸管内。
  2. 雌虫产下卵鞘后，将其移回种群饲养罐。用镊子从罐内垫料中取出卵鞘。
    注意：雌虫通常在转移后24小时内产下卵鞘。

3. 蚂蟥卵鞘的清洁

  1. 将卵鞘加入含有 3 mL 十二烷基硫酸钠（SDS）的 5 mL 离心管中。涡旋振荡 10 秒。用另一管新鲜 SDS 重复进行第二次清洗步骤。
    注意：每 3 mL SDS 最多可处理五个卵鞘。
  2. 使用精细擦拭纸轻轻擦洗每个卵鞘的表面，以去除任何碎屑。可添加更多 SDS 以辅助彻底清洁。将清洁后的卵鞘置于称量舟中，待灭菌时使用。
    注意：此处可暂停实验流程，但若将卵鞘长时间（数天至数周）置于低湿度环境中，会导致其脱水并丧失活性。

4. 卵鞘的灭菌与培养

  1. 为灭菌后冲洗准备无菌水。每灭菌一个卵鞘，需在两个1.5 mL离心管中各加入1 mL无菌水。
  2. 在5 mL离心管中，将10 µL浓（32%）过氧乙酸储备液加入3.2 mL ddH2O中，配制成0.1%的灭菌用溶液。盖紧管盖并反复倒置数次以混匀。
    注意：过氧乙酸接触皮肤或吸入肺部有害。应在通风橱内进行稀释。
    备注：此步骤必须在灭菌当天进行。若提前稀释，溶液会迅速分解，从而无法有效灭菌。最多可将五个清洁后的卵鞘置于3.2 mL稀释酸液中进行灭菌。
  3. 将（最多五个）清洁后的卵鞘放入0.1%过氧乙酸溶液中处理5分钟。每隔60秒倒置离心管数次以混匀。
  4. 在超净工作台内，使用无菌镊子将每个卵鞘转移至含有分装无菌冲洗水（步骤4.1）的独立离心管中。反复倒置数次以充分冲洗。重复冲洗一次后，再用无菌镊子将每个冲洗后的卵鞘转移至各自的BHI斜面培养基中。
  5. 将斜面管放入已灭菌的次级容器中，并将容器转移至30 °C恒温培养箱内进行培养，保持4−5周，直至孵化。
    备注：可用小型试管架或中/小型烧杯固定斜面管，使其保持直立。
  6. 定期检查斜面管（每周1−2次）。若发现琼脂表面出现真菌或细菌菌落生长，应立即移除污染的斜面管。接近第四周时，应每日检查。
    备注：一旦孵化，若仅提供BHI培养基，若虫可存活数周，但无法实现最佳生长。

5. 无菌若虫的维持

  1. 在超净工作台中，使用无菌镊子将一粒灭菌的大鼠饲料颗粒无菌转移至已准备好的BHI培养瓶（来自步骤1.3.3）。作为无菌检测，将培养瓶放入二次容器中，在30 °C培养箱中孵育24小时，若出现微生物生长则不得使用。
  2. 将若虫连同无菌饲料颗粒一起加入BHI培养瓶中。在超净工作台中，通过轻轻振荡使其从BHI斜面脱落，并让其自然落入培养瓶内。
    注意：若虫在试管玻璃壁上无法抓附。通过振荡试管使若虫脱离斜面，随后倾斜试管使其沿玻璃壁滑入培养瓶，此方法效果良好。虽然可使用镊子转移若虫，但致死性损伤的风险较高。
  3. 每周在超净工作台中使用移液器将300 µL无菌水直接滴加至培养瓶的BHI培养基底部，以提供水分。
  4. 当若虫粪便开始覆盖BHI培养基表面时，将其转移至新的BHI培养瓶，并提前24小时加入灭菌的大鼠饲料（以确认无菌状态），操作同步骤5.1。

6. 无菌质量控制

  1. 从BHI烧瓶中取出一只若虫，用于通过限制性片段长度多态性（RFLP）方法进行无培养的无菌状态质量控制检测。操作时，将若虫倒入无菌离心管中（类似于5.1步骤中的若虫转移），或向烧瓶中放入一根无菌木制涂布棒，等待若虫开始攀爬后，将其转移至离心管中。
  2. 向离心管中的若虫加入 0.5 mL 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），用无菌微型研杵充分匀浆，直至所有大块组织完全破碎。充分涡旋振荡。
  3. 使用细菌DNA提取试剂盒从若虫匀浆中提取DNA（材料表如下所示。
    1. 将匀浆后的若虫在5,000 x g下离心10分钟 g 离心并移除上清液。将恒温振荡器预热至 37 °C。
    2. 加入100 µL 1x Tris-EDTA，涡旋振荡以充分重悬沉淀。加入10 µL溶菌酶并混匀，随后在预热至37 °C的恒温振荡器中孵育30分钟（不振荡）。
    3. 加入25 mg玻璃珠至样品中，最大速度涡旋振荡5分钟。将恒温振荡器预热至55 °C。
    4. 让磁珠沉降后，将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，加入100 µL蛋白酶K缓冲液和20 µL蛋白酶K，涡旋振荡以充分混匀。
    5. 在55 °C恒温振荡器中以600 rpm振荡孵育60分钟。在10,000 x g 孵育2分钟，将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。将温控振荡器预热至65 °C。同时在65 °C杂交炉中预热洗脱缓冲液。
    6. 加入 220 µL 100% 乙醇。最大速度涡旋振荡 20 秒。用移液器吹打 10 次以充分分散任何可见的沉淀物。
    7. 将DNA柱插入2 mL收集管中，并将样品（包括可能形成的任何沉淀）转移至柱中。以10,000 x g 1 分钟后，弃去收集管中的滤液，并更换收集管。
    8. 向柱中加入 500 µL 结合缓冲液，于 10,000 x g 1 分钟。弃去收集管中的滤液，并更换新的收集管。
    9. 向柱中加入 700 µL DNA 洗涤缓冲液，于 10,000 x g 离心1分钟。弃去收集管中的滤液，更换新的收集管。重复进行第二次洗涤步骤。
    10. 将空柱放入离心机离心2分钟以干燥，随后将柱子转移至新的1.5 mL离心管中。向DNA柱基质直接加入50 µL预热的洗脱缓冲液，于65 °C孵育5分钟。
    11. 在 10,000 x g 条件下离心 g 孵育1分钟以洗脱。通过分光光度法或荧光法测定滤液中提取的DNA含量。
  4. 扩增并消化完整的16S基因，通过凝胶电泳观察片段。
    1. 使用12.5 µL的2x主混合液，0.5 µL的每种引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT）和27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG），5 ng DNA，以及分子生物学级水，总体积为25 µL。
    2. 运行以下PCR程序：94 °C 预变性60 s；随后进行35个循环，每个循环为94 °C 变性30 s、50 °C 退火45 s、68 °C 延伸90 s；最后68 °C 终延伸5 min。
    3. 使用DNA纯化试剂盒纯化聚合酶链式反应（PCR）产物（材料表).
      1. 向PCR产物中加入120 µL纯化缓冲液，涡旋混匀。短暂离心以收集管盖内的液滴。将DNA纯化柱插入2 mL收集管中，将液体转移至准备好的纯化柱中，并在≥13,000 x g 1 分钟。
      2. 弃去滤液，更换收集管。加入 700 µL DNA 洗涤缓冲液，于 ≥13,000 x g 1 分钟。弃去滤液，更换收集管。重复进行第二次洗涤步骤。
      3. 将空柱在离心机中离心2分钟以干燥，并将柱子转移至新的1.5 mL离心管中。直接加入50 µL预热的洗脱缓冲液至DNA柱基质中，在室温下孵育2分钟。
      4. 在 10,000 x g 条件下离心 g 孵育1分钟以洗脱。通过分光光度法或荧光光度法测定滤液中提取的DNA含量。
    4. 将1 µg纯化的PCR产物加入5 µL限制性酶切缓冲液、10单位RsaI及分子生物学级水，总体积为50 µL。用移液器吹打混匀，于37 °C孵育60分钟。
    5. 通过凝胶电泳分离消化产物，将20 µL消化后的DNA上样至2%琼脂糖凝胶中进行电泳。观察凝胶以确认无菌状态。
      注意：根据内共生菌的16S rDNA序列，无菌昆虫应仅在402 bp、201 bp处出现条带，以及在163至148 bp范围内出现弥散条带， Blattabacterium凝胶中出现的任何额外条带均表明存在污染的微生物物种。

7. 若虫生长的无菌监测

  1. 通过测量烧瓶透明BHI底部的昆虫，记录体长以追踪若虫的生长情况。
    注意：可将若虫置于4 °C环境中15分钟以减缓其活动，从而更便于测量。

结果

如图1所示设置种群培养罐。通过观察附着在腹部后端的卵鞘可识别“怀孕”雌虫，如图2所示。将卵鞘接种于BHI琼脂上孵育，可非破坏性地进行无菌状态的质量控制。在某些情况下，灭菌失败，卵鞘周围出现微生物生长，如图3B所示。此类卵鞘应被移除并丢弃。在本实验条件下，灭菌失败率平均为10%（n = 51）。若培养基上无微生物生长，卵鞘通常在灭菌后平均34天孵化，如图3A所示。我们观察到经灭菌且未受污染的卵鞘平均孵化率为41%（n = 46），每个卵鞘平均孵出11只若虫。体型较大的若虫被转移至用铝箔封口的BHI培养瓶中，如图4所示。铝箔可防止污染，同时为若虫提供生长空间。通过提取均质化若虫样本的16S rDNA进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析，以确认其无菌状态。观察发现，无菌若虫的生长速度较非无菌对照若虫更慢，如图5所示。图6展示了成功获得的无菌昆虫与普通（非无菌）若虫的实验结果。

尽管该检测尚未在无阳性培养结果的情况下发现污染，但在关键实验中仍常规执行此步骤，以排除存在污染性的氧敏感或难养微生物。与标准/非无菌昆虫相比，无菌蟑螂的生长速度较慢。

在垫料表面使用纸板管和海绵为蟋蟀提供潮湿环境的栖息地设置。
图 1：蜚蠊种群培养装置示意图。
可见纸板管堆放在饲养箱远端。食物和水均放置在饲养箱前部。为便于观察，已移除棉布盖和弹性绑带。请点击此处查看该图的放大版本。

显示卵鞘突出的蟑螂背视图，展示产卵过程。
图 2：一只“怀孕”的美洲大蠊。
箭头指示卵鞘的位置。请点击此处查看此图的放大版本。

蟑螂行为研究，试管中用诱饵进行酵母发酵，实验对比示意图。
图3：成功获得无菌若虫孵化及消毒失败的卵鞘在BHI斜面上的照片。
卵鞘按照本方案所述方法进行消毒和培养。(A) BHI斜面上无微生物生长，表明昆虫不含可培养的微生物。(B) 在斜面上出现菌落生长的卵鞘应视为污染，予以丢弃。 请点击此处查看该图的放大版本。

在厌氧条件下用锥形瓶进行的发酵实验，密封以防止污染，微生物生长。
图 4：无菌生物培养装置。
昆虫被饲养在无菌锥形瓶中，并用铝箔盖覆盖以防止污染。次级容器（绿色盖）使用2%次氯酸钠消毒，随后用70%乙醇处理。次级容器内的空气流通不受限制。请点击此处查看该图的放大版本。

按年龄划分的若虫生长图表；无菌与非无菌条件下的比较。散点图分析。
图 5：无菌与非无菌条件下若虫体长生长速率的代表性数据比较。 两组昆虫均饲喂经高压灭菌的啮齿类动物饲料。无菌昆虫（此处：n = 105）按前述方法在BHI培养基中培养。非无菌昆虫（此处：n = 50）饲养于含有高压灭菌木屑垫料的烧瓶中，并配备盛水的小型培养皿。非无菌若虫的平均生长速率为 0.059 mm/天，而无菌若虫的生长速率为 0.028 mm/天（p < 0.0001）。请点击此处查看该图的放大版本。

显示细菌16S rRNA片段及条带模式的凝胶电泳图，100-bp DNA标记。
图6：用于质量控制的RFLP结果代表性凝胶图像。
对全长16S基因扩增子使用RsaI进行酶切消化。用于PCR的DNA从在1×PBS中匀浆的若虫中提取。“G nymph”泳道对应无菌共生若虫，而“conv nymph”泳道对应常规非无菌若虫。根据虚拟酶切分析，内共生菌（Blattabacterium）预期在402 bp、206 bp和163 bp处出现条带，并在163 bp至148 bp之间出现弥散条带。无菌昆虫应仅显示Blattabacterium的条带模式。混合细菌群落预期呈现大小不一的弥散条带，此处标记为“其他细菌16S片段”。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

其他描述无菌蟑螂制备方法的研究，要么未说明卵鞘的收集方法，要么使用了适用于其他蟑螂物种的特定标准来判断卵鞘何时可从母体移除23,25,26。最初，卵鞘是从种群饲养箱的木屑垫料中收集的，其孵化率极低（约10%），远低于非无菌卵鞘（47%）29。这很可能是因为未孵化的卵鞘在种群饲养笼中随时间不断累积，无法确认其具体年龄或存活能力。采用“产房”策略后，可收集到年龄明确且新鲜产出的卵鞘，从而进一步便于实验规划，研究人员可据此预测各个卵鞘的可能孵化时间。另一项对初始及已发表方案的改进是将卵鞘和若虫置于半封闭培养室中孵育，同时在室内放置过饱和氯化钠溶液，以维持约75%的相对湿度30。卵鞘通常在30 °C条件下孵育，该温度已被证明可在最短孵化天数的同时，最大化胚胎存活率以及每个卵鞘孵出的若虫数量31。孵化后，无菌若虫通常在实验室室温及环境条件下于实验台面上培养，但在关键实验中仍会使用湿度可控的培养室。在实施了上述卵鞘收集与孵育条件的改进后，孵化率提升至约41%（n = 51），此数据未包含因污染而被剔除的卵鞘。进一步优化孵化率的潜在途径可能包括延长卵鞘收集与灭菌之间的时间间隔。卵鞘的角质层在刚产出时尚未完全鞣化32，因此在产出后的24小时内可能对灭菌过程中使用的溶液具有通透性。

使用0.1%过氧乙酸的灭菌方案改编自Doll等人的研究25。其他研究已记录了卵鞘灭菌的替代技术23,26。污染率基于将卵鞘接种于BHI斜面培养基上进行非破坏性培养的方法测定。该方法具有显著优势，可快速识别并移除受污染的卵鞘。大多数先前的方案通过将粪便或若虫匀浆物接种至细菌培养基上并观察生长情况，来检测可培养的微生物22,23,25,27,28,33。至少有一项研究未充分描述无菌状态检测方法26。除Clayton在饲养瓶中添加一小块无菌检测培养基外24，以往的方法22,23仅在短时间内将无菌昆虫饲养于细菌培养基上，以初步评估灭菌方案的效果。

将获得的若虫持续饲养在BHI培养基上，作为一种内置的质量控制措施，可对它们的已知菌群状态进行半实时监测——这一技术在以往大多数方法中均未见报道22,23。这对于需要长期获取无菌若虫的实验尤为有用。若观察到若虫下方的BHI培养基表面出现细菌或真菌生长污染，则应丢弃该培养瓶。此类污染通常发生在为若虫加水而打开培养瓶时，但也可能源于卵鞘或食物灭菌不充分所带入的粪便污染物。在加水操作时使用层流洁净工作台，可降低因打开培养瓶所导致的污染率。

由于并非所有污染生物都能在BHI培养基上进行需氧生长，因此需要采用一种额外的、不依赖培养的无菌检测方法。一种可能的方法是显微镜检查27，但该方法可能劳动强度较大。其他方案则采用基于序列的技术来检测可能逃避培养的生物体14,23,27,28。然而，这类方法通常成本较高且难以解释，因为高通量测序结果极易受到试剂中低水平污染34和条形码跳跃35的影响。为此，已开发出一种新方法，该方法通过扩增16S rRNA基因并结合限制性片段长度多态性分析，以同时可视化内共生菌及任何污染性的肠道共生菌。该技术包含一个内部PCR对照，因为Blattabacterium的16S基因已被测序，其条带模式应在无菌和非无菌昆虫中均存在。由于内共生菌的限制性酶切图谱可根据其基因组序列预测得出36，因此除非需要鉴定任何污染物，否则无需对扩增子或限制性片段进行测序。本方案当前版本要求牺牲若虫用于PCR/RFLP分析，但该技术也可应用于粪便样本，作为一种非破坏性检测手段。然而，由于粪便中应含有极少的Blattabacterium，因此该方法将不包含内置对照。

饲养无菌动物时另一个易于调整但至关重要的因素是饮食。虽然BHI琼脂可作为昆虫的临时食物来源，但研究发现，若长期将其作为唯一食物，会导致若虫出现显著的生长缺陷。尽管已尝试多种饮食方案，但推荐使用可高压灭菌的大鼠饲料作为维持无菌昆虫的常规饮食。许多未专门设计用于灭菌的饲料往往难以实现完全无菌，且不少无菌或可高压灭菌的实验动物饲料在非无菌条件下易迅速滋生真菌。这种在非无菌环境中易降解的特性使其不适用于直接比较无菌与非无菌昆虫的实验。推荐使用的饲料可在无菌昆虫与常规若虫之间保持饮食的一致性，从而便于比较两组之间的特征——例如生长速率。

正如其他研究者所观察到的27，无菌若虫的生长速度比非无菌若虫更慢。在相同条件下饲喂经高压灭菌的啮齿类饲料并在室温下饲养的无菌若虫（n = 105）与非无菌若虫（n = 50）之间，体长比较显示，非无菌若虫平均每日增长0.059 mm，而无菌若虫仅为0.028 mm/天（p < 0.0001）（图5）。已有研究表明，P. americana 肠道微生物群可改变昆虫的代谢速率37，而一般而言，肠道微生物群落被认为会影响营养物质的吸收38,39。这些因素支持了无菌与非无菌若虫在生长速率上所观察到的差异。

该技术的一个可能局限在于，无菌若虫可能无法达到性成熟，因为目前最老的无菌群体已超过10个月，仅发育至第七龄期（共10个龄期，第11阶段为成虫），此判断依据为体长估算40。这些最老的群体并未饲喂高压灭菌大鼠饲料，而是食用辐照大鼠颗粒饲料，这种饲料含水量过高，若用于非无菌群体将导致霉菌过度生长。在实验室条件（室温与湿度）下，饲喂非灭菌狗粮的非无菌若虫可在9−10个月内发育至成虫。目前，共同饲喂高压灭菌大鼠颗粒饲料的无菌与非无菌若虫群体年龄均不足7个月，其中非无菌昆虫估计处于第七龄期（平均体长：16.7 mm），而无菌昆虫估计处于第五龄期（平均体长：11.2 mm）。因此，截至目前，我们尚无法确认这些无菌蟑螂是否能够成功繁殖。然而，鉴于利用该方法建立新的无菌群体十分简便，即使尚未证实无菌昆虫的繁殖能力，该技术仍具有广阔的应用前景。

综上所述，本实验方案提供了一种多功能工具，使微生物组研究人员能够利用常见的实验材料自行建立低成本的无菌生物“设施”。该方法可用于制备无菌蟑螂，以开展研究微生物群在宿主行为、免疫、发育及应激反应中作用的实验21,26,27。这些无菌昆虫还可接种合成菌群或异源菌群，随后作为肠道微生物组研究的实验对象23,28。此外，该方法中的部分要素——例如使用涂布细菌培养基的培养室作为内置的无菌检测手段——可推广至其他模式系统，有助于在小规模实验设施中常规维持无菌动物的培养。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本出版物由美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所根据资助编号R35GM133789提供支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。作者谨此感谢Josey Dyer在监测无菌蟑螂的消毒率、孵化率和生长率方面所做的工作。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2X 预混液New England BioLabsM0482OneTaq MasterMix
可高压灭菌的大鼠饲料ZeiglerNIH-31 Modified Auto
细菌DNA提取试剂盒Omega Bio-TekD-3350E.Z.N.A. 细菌DNA试剂盒；包含溶菌酶、玻璃珠、蛋白酶K、缓冲液（蛋白酶K缓冲液、结合缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液）、DNA纯化柱、2 mL收集管
结合缓冲液Omega Bio-TekPD099包含于Omega Biotek的细菌DNA提取试剂盒中（"HBC"缓冲液）
脑心浸出液（BHI）肉汤Research Products InternationalB11000
精密擦拭纸KimWipeJS-KCC-34155-PKKimWipes
DNA纯化试剂盒Omega Bio-TekD6492E.Z.N.A. Cycle Pure试剂盒；D6493也可使用；包含纯化缓冲液、洗涤缓冲液、洗脱缓冲液
洗脱缓冲液Omega Bio-TekPDR048包含于Omega Biotek的细菌DNA提取试剂盒中
玻璃珠Omega Bio-Tekn/a包含于Omega Biotek的细菌DNA提取试剂盒中
杂交炉UVP95-0330-01我们使用杂交炉预热洗脱缓冲液，但水浴锅可能也可使用
层流式生物安全柜NuAire, Inc.NU-425-400为简洁起见，本方案中将其简称为“层流罩”"laminar flow hood"
溶菌酶Omega Bio-Tekn/a包含于Omega Biotek的细菌DNA提取试剂盒中
过乙酸储备液（32%）Sigma-Aldrich269336
凡士林Vaselinen/a
蛋白酶K缓冲液Omega Bio-TekPD061包含于Omega Biotek的细菌DNA提取试剂盒中（"TL缓冲液"）
纯化缓冲液Omega Bio-TekPDR042包含于Omega Biotek的CyclePure试剂盒中（"CP"缓冲液）
RsaINew England BioLabsR0167包含CutSmart（消化）缓冲液
次级容器n/an/a带盖的塑料容器（例如Kritter Keeper）适用于此用途（25 cm长 × 15 cm宽 × 22 cm高）；应足够大以容纳BHI斜面和试管
分光光度计ThermoFisherND-2000目录信息对应NanoDrop2000
温控振荡仪EppendorfEP5386000028Thermomixer R
Tris-EDTAFisherBP1338-110 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8
洗涤缓冲液Omega Bio-TekPDR044包含于Omega Biotek的细菌DNA提取试剂盒中（"DNA wash"缓冲液）
木屑垫料P.J. Murphy Forest ProductsSani-Chips

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无菌美洲大蠊（Periplaneta americana）的建立与维持
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