建立和维护侏罗育美国蟑螂 （佩里普拉内塔美洲）

侏儒动物已被证明是微生物群研究的宝贵工具^1，2，3。无细菌和定义的植物动物允许阐明宿主-微生物相互作用，包括宿主免疫反应、肠道上皮成熟和宿主代谢^{1、4、5、6、7。}接种简化社区的侏罗育动物也有助于更全面地了解肠道社区的微生物-微生物相互作用，特别是解开交叉喂养和对抗关系^{8、9、10、11。}目前首选的哺乳动物肠道微生物群研究模型系统是穆林模型。虽然该系统在上述发现中至关重要，但一个关键缺陷是所涉及的成本。建立和维护侏罗万象设施需要专门设备和训练有素的技术人员。这一点，结合必须给予格诺特生物动物维护的各个方面的额外照顾，导致侏罗纪动物的繁殖成本比标准动物模型¹²高出十到二十倍。由于成本高昂，许多研究人员可能买不起侏罗纪穆林模型。此外，虽然穆林模型可能是最广泛接受的研究选择，希望转化为人类健康，仍然有许多生理和形态差异的人和老鼠的肠道^13。显然，没有一个奇异的模型足以回答越来越多的关于肠道微生物群许多方面的问题。

与哺乳动物相比，昆虫模型的维护成本较低，因此是一种更便宜的替代品。在各种昆虫物种中广泛开展无细菌和侏罗育研究，导致多种常用模型的发展。蚊子和嗜血杆菌是无细菌工作的常见模型，因为它与全球疾病和遗传可及性^有关。另一个新兴的模型系统是蜜蜂（阿皮斯梅利维拉），因为它在授粉和社会研究^{中的重要性16。}然而，许多这些常用的昆虫缺乏哺乳动物肠道群落¹⁷的分类复杂性，限制了它们模拟高阶相互作用的能力。不仅美国蟑螂肠道中微生物的完全多样性与哺乳动物更为相似，而且蟑螂肠道中存在的许多微生物都属于哺乳动物^{和人类肠道}微生物群中常见的家族和植物。蟑螂的后腿在功能上也类似于哺乳动物的大肠，因为它是一个发酵室，里面密密麻麻地挤满了细菌，有助于提取^19、20的营养物质。最后，蟑螂的杂食性允许多样化的饮食制度，这是不可能与饮食专家。

美国蟑螂可以是一个有用的模型系统，了解肠道微生物群落在更高的生物体，但蟑螂作为害虫的地位也使该系统相关害虫控制^21。利用肠道社区对蟑螂健康和生理的影响的基本知识，有助于开发新的害虫管理技术。

这种方法的目的是概述一个全面描述建立和维护侏罗育美国蟑螂（佩里普兰塔美洲），但这个协议可以用来产生任何异性蟑螂的仙女。它包括一种高效、非侵入性地收集成熟卵母细胞的方法，以及一种监测昆虫^22、23、24的侏罗育物状态的无损技术。虽然以前实现和维持侏罗纪蟑螂的方法描述 ootheca 集合^{23，24，25，26，27，}ootheca 成熟度要么解释在物种特定的线索 （在布拉特拉德国^{22，24，25），}或没有明确描述^27，28，使那些不熟悉该系统的人难以实施.由于此处描述的方法使用自然掉落的卵子，因此不存在过早取卵的错误。该协议包含依赖文化和文化独立的质量控制方法，而依赖文化的方法不需要牺牲昆虫。最后，这种方法汇集了来自多种侏罗育蟑螂研究的信息，以创建一个全面的协议，为实现和维持侏罗育蟑螂提供一切必要的信息。

1. 材料准备

1. 维持股票蟑螂文化
   注意:有许多方法可以饲养这些强壮的昆虫。提供住所和水的具体细节可能因易用材料（即鸡蛋纸箱而不是纸板管）而异。以下绝育协议将适用于任何库存罐设置。
   1. 在 37.85 L （10 加仑） 鱼缸中铺上足够的木片床上用品，用大约 1 英寸的床上用品覆盖鱼缸底部。通过将（平）纸板切成2×4件来准备外壳。将纸板片插入纸板管（如卫生纸管）和水箱一端的堆叠管（图1）。
   2. 在油箱内侧的顶部两英寸处涂抹一层薄薄的石油果冻，以防止昆虫逃跑。
      注意:一定要正确涂上油箱内角。
   3. 添加蟑螂，从以前的股票罐转移（占用）纸板管，摇动它们释放他们的居民。每次转移，移动100−200混合年龄，混合性别蟑螂。加入狗粮（20−30块），监测狗粮在油箱中的含量，并在低位时重新填充。
   4. 设置一个水菜。
      1. 用双蒸馏水（ddH₂O）填充一个小塑料可重复使用的食品容器。将食品容器盖上的纤维素海绵和孔切成大致相同的大小。
         注:纤维素海绵防止蟑螂淹死在水盘中。
   5. 将海绵插入盖子上的孔中，并将盖子放在填充容器上。将容器放在油箱中，并在低位时重新加注。用棉布盖住油箱，用弹性带固定到位。
   6. 随着坦克开始积累过多的碎屑和昆虫尸体，建立新的坦克和转移蟑螂。
      注:坦克通常每6个月转移一次。退役库存罐中剩余的蟑螂/鸡蛋在-20°C冻结1小时后被安乐死，然后将储存罐中的内容转移到高压灭菌袋中，并在处置前自动切割（1小时，重力周期）。库存罐在使用之间用2%的漂白剂进行消毒。
2. 对二次容器进行消毒。
   注意:此容器不包括过滤器，而是允许免费换气。
   1. 用 2% 漂白剂喷洒盖子和底部的内部，使其浸泡 10 分钟。用干净的纸巾擦去漂白剂。
   2. 用70%的乙醇喷洒盖子和底部，用干净的纸巾擦干。更换盖子，直到使用。
3. 使BHI倾斜和烧瓶孵化鸡蛋和住房仙女。
   1. 根据包装说明准备 BHI，添加 2% agar。煮沸BHI-阿加解决方案，直到澄清。
   2. 对于倾斜，将 5 毫升的别名转移到 18 mm x 150 mm 玻璃试管和盖子上。通过高压灭菌（消毒时间 = 20 分钟，液体循环）。以 45° 角放置高压管，以冷却成倾斜。凝固后，冷藏至使用以防止干燥。
   3. 对于烧瓶，将10 mL的煮BHI-agar溶液转移到250mL埃伦迈尔烧瓶中，以完全覆盖烧瓶底部。用铝箔盖住烧瓶，通过高压灭菌（20分钟，液体循环）灭菌。允许自碎烧瓶冷却和冷藏，直到使用以防止干燥。
      注意:此设置无需空气滤清器。铝箔盖足以进行气体交换，同时防止露天流动污染。
4. 通过高压灭菌:可自封的鼠排在铝箔覆盖的烧杯中分解成半尺寸（+1~2英寸）（灭菌时间=1 h，重力周期），在封顶瓶中消毒2_O（灭菌时间=20分钟，液体循环），在铝箔覆盖的烧杯中钳子（灭菌时间=20分钟，重力周期）。
   注意:不要过度填充老鼠烧杯。小丸子会在高压灭菌片中膨胀。
5. 设置一个"产房"坦克。
   注:此水箱包含与库存罐相同的材料（纸板管、带海绵的水菜、狗粮、木片床上用品;见 图1），除非转移到乌特卡收集处，否则应空蟑螂（见第2节）。
6. 通过准备装满超饱和氯化钠 （NaCl） 溶液的烧杯来加湿孵化器。通过每 100 毫升 ddH₂O 添加 37 克 NaCl 并搅拌至溶解来准备此解决方案。
   注:通常，500 mL 的饱和盐溶液通常使具有腔室尺寸为 51 厘米 x 46 厘米 x 46 厘米（H x W x D） 的孵化器加湿约一个月，然后才能添加更多水。

2. 奥特凯收藏

1. 将携带卵尸（图2）的雌性（在计划实验中适当数量）从储物罐转移到"产房"，用钳子移动含有幼女的纸板管。
   1. 如果车载管中除了雌性昆虫外，还含有多种昆虫，首先将管子摇出，放入一个用石油果冻环状的塑料容器中，然后鼓励目标昆虫单独爬回纸板管中。
2. 一旦女性掉了油箱，就将她们送回储罐。用钳子从罐中的垃圾中取回奥特卡。
   注:在女性被转移的24小时内，Oothecae经常被丢弃。

3. 清洗乌特卡

1. 将欧特卡添加到含有 3 mL 硫酸钠 （SDS） 的 5 mL 离心管中。漩涡为10s。使用含有新鲜 SDS 的离心机管重复第二步洗涤。
   注:每3 mL SDS最多可使用5个耳塞。
2. 使用精致的任务擦拭，轻轻擦洗每个乌塞卡的表面，以清除任何碎片。可能会添加更多 SDS，以帮助彻底清洁。将清洁的欧特卡放在称重船上，直到准备绝育。
   注意:协议可能会在这里暂停，但将乌特卡在低湿度环境中停留很长时间（天到周）会导致它们脱水并失去生存能力。

4. 乌特卡的绝育和孵化

1. 阿里引用无菌水进行消毒后冲洗。要灭菌，请用 1 mL 无菌水填充两个 1.5 mL 离心机管。
2. 添加 10 μL 的浓缩 （32%）在 5 mL 离心机管中将 3.2 mL 的 ddH₂O 的渗透酸储存溶液用于制造 0.1% 的灭菌溶液。盖和倒置几次混合。
   注意:与皮肤或肺部接触时，乙酸是有害的。在烟罩中稀释。
   注意:这必须与绝育工作在同一天进行。如果提前稀释，溶液会迅速分解，因此无法正确消毒。多达五个清洁的油箱可能在3.2 mL的稀释酸中消毒。
3. 将（最多5个）清洁的卵母鱼放在0.1%的渗透酸溶液中5分钟。每 60 年代倒置管子几次。
4. 在层压流罩中，使用无菌钳将每个 otheca 转移到自己的离心机管中，并加注无菌冲洗水（步骤 4.1）。倒置几次混合。重复进行第二次冲洗，然后使用无菌钳将每个冲洗的 ootheca 转移到自己的 BHI 倾斜。
5. 将倾斜处置于消毒的二级容器中。将容器以 30 °C 的速度放入加湿的孵化器中，持续 4−5 周，直到孵化。
   注意:倾斜可以由小型试管架或中/小型烧嘴直立。
6. 定期检查倾斜（每周1−2次）。如果真菌或细菌菌群生长出现在阿加，去除受污染的倾斜。当四周的时间点接近时，每天检查倾斜度。
   注:一旦孵化，仙女可以生存长达几个星期的BHI单独，但不会增长最佳。

5. 维持侏罗万象仙女

1. 在层压流罩中，无菌地将灭菌大鼠的颗粒转移到准备好的 BHI 烧瓶（从步骤 1.3.3 开始）与无菌钳子。作为不育检查，将烧瓶放在 30 °C 孵化器中的二次容器中 24 小时，如果出现生长，则不使用。
2. 将仙女加入带有无菌食物颗粒的 BHI 烧瓶中。将他们从 BHI 倾斜中摇出，让他们落入层压流罩中的烧瓶中。
   注:仙女在试管的玻璃墙上没有牵引力。摇动管子将他们从倾斜物上敲下来，然后翻倒管子，让他们从玻璃杯中滑入烧瓶是有效的。虽然仙女可以使用钳子转移，但致命伤害的风险很高。
3. 每周在层压流罩中使用 300μL 无菌水的水仙女，直接输送到烧瓶的 BHI 地板上。
4. 当仙女粪便开始覆盖BHI地板时，转移到一个新的BHI烧瓶中，提前24小时添加消毒的老鼠，以验证不育情况，就像第5.1步一样。

6. 不育质量控制

1. 从 BHI 烧瓶中取出一个仙女，通过限制片段长度多态性 （RFLP） 来牺牲对侏儒状态进行文化独立的质量控制检查。为此，将仙女倒入无菌离心管（类似于从步骤 5.1 的仙女转移），或将无菌木制施用器放入烧瓶中，等待仙女开始攀爬，然后将其转移到离心管。
2. 在离心管中的仙女中加入 0.5 mL 的 1 倍磷酸盐缓冲盐水 （PBS），然后用无菌微虫均质，直到所有大块碎裂。漩涡很好。
3. 使用细菌DNA提取剂盒（材料表）从仙女同源物中提取DNA如下。
   1. 在 5，000 x g 下将同质化仙女离心 10 分钟，并去除超自然。将热摇床预热至37°C。
   2. 加入100微升的1x特里斯-EDTA，并漩涡，以完全恢复颗粒。加入 10 μL 的溶酶和混合物，然后在预热的 37 °C 热摇床中孵育 30 分钟（无抖动）。
   3. 在样品中加入 25 毫克玻璃珠，以最大速度漩涡 5 分钟。将热摇床预热至 55 °C。
   4. 在将超母体转移到新的 1.5 mL 离心管（含 100 μL 蛋白酶 K 缓冲器和 20 μL 蛋白酶 K. Vortex）进行彻底混合之前，让珠子沉淀。
   5. 孵化，在600转/分钟摇晃，在55°C热摇床60分钟。离心机在10，000 x g 2分钟，并转移到一个新的1.5 mL离心机管超母体。将热摇床预热至 65 °C。 开始在 65 °C 混合烤箱中预热洗脱缓冲器。
   6. 加入220微升100%乙醇。漩涡以最高速度为20s。通过上下吹管 10 倍来分解任何可见的沉淀物。
   7. 将DNA柱插入2mL收集管，并将样品转移到柱中，包括可能形成的任何沉淀物。离心机在10，000 x g 1分钟，丢弃过滤从收集管，并更换收集管。
   8. 在柱中加入 500 μL 的绑定缓冲，在 10，000 x g 下以离心机加 1 分钟。从收集管中丢弃过滤，并更换收集管。
   9. 在柱中加入 700 μL 的 DNA 洗涤缓冲器，在 10，000 x g 下将离心机加到 1 分钟。从收集管中丢弃过滤，并更换收集管。重复进行第二次洗涤步骤。
   10. 离心机空柱2分钟晾干，之后将柱子转移到新的1.5mL离心机管上。将 50 μL 的预热洗脱升缓冲直接添加到 DNA 列矩阵中，并在 65 °C 下孵育 5 分钟。
   11. 离心机在10，000 x g 1分钟以示。通过光谱光度计或荧光测量对过滤中提取的DNA进行量化。
4. 放大和消化整个16S基因。使用凝胶电泳可视化碎片。
   1. 使用 12.5μL 的 2 倍主混合，每个引金 1492R （5+-GGTTACCTTTTTACCTACTT） 和 27F （5'- 阿加格特加特克特克特加特卡格）， 5 ng 的 DNA 和分子级水， 总反应量为 25 μL.
   2. 运行以下恒温器程序:94°C 60s:其次是35个周期94°C 30s，50°C 45s，68°C 90s:然后是68°C 5分钟。
   3. 使用脱氧核糖核酸净化剂盒（材料表）净化聚合酶链反应 （PCR） 产品。
      1. 在 PCR 产品和漩涡中加入 120 μL 的净化缓冲区。简要离心机收集盖子内的液滴。将DNA柱插入2mL收集管中，将液体转移到准备好的柱子和离心机，≥13，000 x g，1 分钟。
      2. 丢弃过滤，更换收集管。在 13，000 x g ≥加入 700 μL 的 DNA 洗涤缓冲器和离心机，1 分钟。丢弃过滤，更换收集管。重复进行第二次洗涤步骤。
      3. 将空柱离心2分钟干燥，并将柱子转移到新的1.5mL离心机管中。将 50 μL 的预热洗放缓冲液直接添加到 DNA 列基质中，并在室温下孵育 2 分钟。
      4. 离心机在10，000 x g 1分钟以示。通过光谱光度计或荧光测量对过滤中提取的DNA进行量化。
   4. 将 1μg 纯化 PCR 产品添加到 5μL 的消化缓冲器、10 个单位 RsaI 和分子级水中，总反应量为 50 μL。
   5. 通过在2%的蔗糖凝胶上运行20μL的消化DNA，通过凝胶电泳分离消化的产品。可视化凝胶以确认侏托生物状态。
      注:根据内窥镜的16S rDNA序列，侏罗纪昆虫只能产生402个基点、201个基点和163至148个基点的涂 片。在凝胶中看到的任何额外的带子都表明微生物物种会受到污染物的污染物。

7. 仙女生长的天体跟踪

1. 通过通过烧瓶的半透明 BHI 地板测量昆虫来记录身体长度以跟踪仙女生长。
   注:Nymphs 可放置在 4 °C 15 分钟，以减慢其移动速度，从而使其更易于测量。

库存坦克设置如 图1所示。"怀孕"的女性被附着在后腹部的卵母识别，如 图2所示。BHI agar上孵育的卵石允许以无损的方式进行侏罗万象的质量控制。在某些情况下，绝育是不成功的，生长出现在乌特卡周围，如 图3B。这些乌特卡应该被移除和丢弃。在我们手中，观察到灭菌的平均失败率为10%（n = 51）。如 图3A所见，在灭菌后，oothecae平均孵化34天，而介质上没有生长。我们观察到灭菌、无毒卵母的典型孵化率为41%（n = 46），平均每个卵母细胞有11个仙女。较大的仙女被转移到BHI烧瓶覆盖着铝箔，如 图4。铝箔防止污染，仙女有生长的空间。来自同质化仙女的 16S rDNA RFLP 用于确认侏托生物状态。观察到，侏罗纪仙女的生长速度比非无菌的仙女慢， 如图5所示。 图6 显示成功侏罗万象昆虫以及标准（非固醇）仙女的结果。

虽然在没有阳性培养结果的情况下，该测试尚未确定污染，但这一步骤在关键实验期间已定期进行，以排除存在污染氧敏感或挑剔的微生物。与标准/非星体昆虫相比，侏罗纪蟑螂的生长速度较慢。

图1:蟑螂股票文化设置。
纸板管可以看见堆放在坦克的远端。食物和水都在水箱前部附近。棉布盖和弹性带已被移除，以获得可见性。 请单击此处查看此图的较大版本。

图2:一只"怀孕"的美国蟑螂。
箭头表示奥特卡。 请单击此处查看此图的较大版本。

图3:在BHI斜面上成功孵化并成功灭菌的侏罗万象仙女的图像。
正如本议定书所述，Oothecae进行了绝育和孵化。（A） BHI倾斜上微生物生长不足，表明昆虫没有可培育的生物体。（B） 导致殖民地形成的倾斜处的奥特卡应作为污染物丢弃。 请单击此处查看此图的较大版本。

图4:侏罗万象饲养装置。
昆虫被保存在无菌烧瓶中，盖上铝箔盖，以防止污染。二次容器（绿色盖子）用2%漂白剂消毒，然后是70%乙醇。二级容器内不限制气流。 请单击此处查看此图的较大版本。

图5:比较侏罗万象和非固醇仙女体长度的代表性增长率数据。 两组昆虫都食用了自体啮齿动物饮食。侏罗万象昆虫（这里:n = 105）如所述保持在BHI上。非固醇昆虫（这里:n = 50）生活在烧瓶与自动切割木片床上用品与小菜水。非固醇仙女的平均生长速度为0.059毫米/天，而侏罗育仙女生长在0.028毫米/天（p<0.0001）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图6:RFLP结果的代表性凝胶图像，用于质量控制。
全16S基因放大器通过RSAI消化。PCR的DNA是从1倍PBS中同质化的仙女中提取的。"G 仙女"车道对应于侏罗万象仙女，而"康夫仙女"车道对应于传统的，不耐人知的同行。根据虚拟限制摘要，内窥镜（Blattabact）的波段尺寸为402 bp、206 bp和163 bp，波段涂抹在163 bp和148 bp之间。侏罗万象昆虫只应显示 布拉塔细菌 带状模式。混合细菌群落预计将有不同大小的带状涂片，标有"其他细菌16S片段"。 请单击此处查看此图的较大版本。

作者没有利益冲突要披露。