使用 德罗索菲拉· 拉瓦在恒温遗传神经元屏幕上摄入的宏量营养素的量化

摘要

这里描述的是一个协议，使颜色定量在定义的时间间隔内食用的食物量，由 德罗索菲拉梅拉诺加斯特 幼虫暴露在不同宏量营养素品质的饮食。这些检测是在神经元恒温屏幕的背景下进行的。

摘要

觅食和喂养行为使动物能够获得对其发育、健康和健身至关重要的能量和营养来源。研究这些行为的神经元调节对于理解营养平衡背后的生理和分子机制至关重要。使用遗传可牵引的动物模型，如蠕虫、苍蝇和鱼，极大地促进了这些类型的研究。在过去的十年里，果蝇果蝇褪黑素被神经生物学家用作一种强大的动物模型，研究喂养和觅食行为的神经元控制。虽然毫无疑问是有价值的，但大多数研究都对成年苍蝇进行了研究。在这里，我们描述了一个协议，利用更简单的幼虫神经系统来研究神经元基板控制喂养行为时，幼虫暴露在饮食不同的蛋白质和碳水化合物含量。我们的方法基于定量色度无选择喂养检测，在神经元恒温激活屏幕的背景下执行。作为读出，幼虫在1小时间隔内食用的食物量被用于暴露在三种染料标签饮食之一，这些饮食的蛋白质与碳水化合物（P:C）的比例不同。通过识别调节不同宏量营养素质量饮食中食用食物量的候选神经元人群，在幼虫果蝇的神经遗传学筛查中证明了此协议的有效性。我们还能够将测试的基因型分类并归类为表型类。除了简要回顾文献中目前可用的方法外，还讨论了这些方法的优点和局限性，并就如何使该方案适应其他具体实验提出了一些建议。

引言

所有动物都依靠均衡的饮食来获得生存、生长和繁殖所需的营养^物质。选择吃什么和吃多少受许多相互作用的因素的影响，相关的动物的内部状态，如饱腹程度和环境条件，如食物质量^{2，3，4，5。}蛋白质和碳水化合物是两种主要的宏量营养素，其均衡摄入对维持动物的生理过程至关重要。因此，对控制喂养行为和维持这些宏量营养素均衡摄入的神经机制的理解是极其相关的。这是因为生命史特征，如寿命，胎儿和代谢健康直接影响蛋白质摄入量水平^{6，7，8，9，10。}

使用更简单、更易操作的生物体，表现出与复杂动物（包括哺乳动物）一起进化保存的喂养习惯，对于这类研究至关重要。重要的是，这些更简单的动物模型提供了一个很好的机会，在昂贵，道德和技术更有效的环境中剖析复杂的生物问题。在过去的几十年里 ，Drosophila以其强大的遗传工具包、复杂而陈规定型的行为以及保存了哺乳动物的外围和营养感应机制结构，成为行为神经生物学家¹¹的富有成效的模型。归根结底，希望通过了解这种动物的食物摄入是如何调节的，有了更简单的神经系统，我们就可以开始解开人类饮食失调背后的神经元故障。

对喂养行为的神经元基材的研究在很大程度上取决于能否同时测量动物的食物摄入量，同时操纵动物的神经元活动。由于摄入的食物数量最少，量化苍蝇吃的食物量极具挑战性，目前所有可用的方法都存在重大限制。因此，金本位制是采用互补方法¹²的组合。从历史上看，成年苍蝇一直被看好为遗传和行为模型。然而，果蝇幼虫，也提供了机会，以研究神经元基质编码喂养行为。幼虫中枢神经系统（CNS）约有12，000个神经元，比包含约150，000个神经元的成人要复杂得多。这种较低的复杂性不仅在数字上，而且在功能上都是如此，因为幼虫行为依赖于更简单的机车功能和感官系统。尽管幼虫的神经系统明显简单，但幼虫仍然表现出完整的喂养行为，一些方法可以量化果蝇幼虫的食物^摄入量。通过与神经元活动的操纵配对，果蝇幼虫可以构成一个高度可牵引的模型，用于理解食物摄入的神经调节。

提供这里是一个详细的协议，量化食物摄入量在幼虫暴露在不同宏量营养素品质的饮食。饮食，所谓的宏量营养素平衡饮食，在蛋白质和碳水化合物含量上有所不同，特别是关于蛋白质与碳水化合物（P:C）的比例:1:1（富含蛋白质的饮食），1:4（中间饮食）和1:16（蛋白质贫乏的饮食），如 图1A所示。简言之，使用这三种异种糖-酵母（SY）为基础的饮食用蓝色食物染料染色，建立了定量无选择喂养检测。由于酵母提取物和蔗糖被用作蛋白质和碳水化合物来源，并且都含有碳水化合物，因此通过改变这两个成分的平衡（如图¹⁶ 和 图1B所示）获得了P:C比率的变化。 图 2中提供了协议的示意图概述，其中显示了主要的实验步骤。

该协议的建立旨在调查特定神经元人群在调节幼虫喂养水平在不同P:C比率的饮食中以及在恒温遗传神经元屏幕中的作用。一个特征良好的神经遗传学工具被使用从瞬态受体潜力（TRP）家族:嗜异性瞬态受体潜力通道（dTRPA1），这是一个温度和电压门的晶体通道，允许在环境温度上升到25°C¹⁷以上时激发行动潜力。为了表达dTRPA1转基因，我们利用了Gal4线基于从罗宾实验室建立的d罗索菲拉基因组的cis-监管区域，在Janelia研究校园^18，19的FlyLight项目的背景下。

虽然协议，这里描述，已经建立在激活屏幕的背景下，它可以很容易地适应实验者的其他特定需求或兴趣，即执行抑制屏幕使用温度敏感神经元消音器ShibireTS^20，替代dTRPA1。此适应和其他适应性在协议和讨论部分进行讨论。

方案

1. 准备蔗糖酵母 （SY） 饮食

1. 称量所有干成分（阿加，酵母，蔗糖）的宏量营养素平衡和L3饲养饮食。准备1升食物所需的每种成分的克数在 图1B中注明。
   注意:考虑到需要大约 13 mL 的食物来填充 60 毫米的培养皿。
2. 将所有成分溶解在无菌蒸馏水中（使用准备食物所需的总水量的约 50%），搅拌介质 5-10 分钟。
3. 自动滑轮50分钟。
4. 允许介质冷却后，在饮食中加入尼帕金和丙酸溶液，最终浓度（v/v）分别为3%和0.3%。在宏量营养素平衡饮食中，将蓝色食物染料添加到 1% 的最终浓度 （v/v） 中。用蒸馏水完成总体积。
5. 小心地将食物饮食倒入 60 毫米的培养皿中，使每个盘子中浇注的食物数量大致相同。用饮食的 P:C 比率标记盘子。
   注意:在喂养检测当天准备宏量营养素平衡饮食。如果不可能，将准备好的饮食储存在4°C，密封容器中，最长持续3天。更长的储存期使饮食过于干燥和困难，幼虫无法钻进媒介。

2. 父母线的遗传交叉

注:使用Gal4/UAS系统²¹ 来设置遗传交叉。在此协议中，为了激活特定神经元群体的神经元功能，使用 UAS dTRPA1 线¹⁷ 的女处女，并从 Janelia Gal4 线（图 2A）交叉到男性。使用的基因控制是 dTRPA1 线和"空 GAL4"线之间的交叉的后代，该线在用于生成 Rubin Gal4 集合的向量中携带 Gal4，但没有存在调节片段 （attP2）²²。为了促进神经元抑制，可以使用 UAS 线编码 ShibireTS^20， 而不是 dTRPA1。

1. 设置60毫米胚胎收集笼与L3饲养饮食板，辅以一些活性酵母膏。
2. 将成年 UAS dTRPA1 女处女和 Janelia Gal4 雄性（5-8 天）转移到胚胎采集笼中，让交配在 25 °C、60% 湿度和 12:12 光暗周期（图 2A）下进行 24-48小时。对于60毫米胚胎采集笼，每个十字架使用约100个处女雌性和30个雄性。
3. 在交配期结束时，取出并丢弃遗传十字架中使用的L3饲养饮食板。用它们代替新鲜的L3饲养饮食板，以执行卵子产卵和幼虫分期。

3. 准备三星幼虫 （L3）

1. 将交美成人苍蝇转移到新鲜的L3饲养饮食板，并允许产卵发生3-4小时，在25°C（图2B）。确保所有的盘子都标有基因型、饮食的P:C比例和产卵日期。
   注意:为了节省时间，将产卵直接放入 L3 饲养饮食中，从而避免对鸡蛋进行额外的处理。在小规模基因筛选的情况下，使用苹果汁阿加板可以优化产卵。
2. 在产卵期结束时，从笼子里取出盘子，用塑料盖盖住它们。如果酵母提取物用于补充L3饲养板，请务必在产卵结束时去除所有残留酵母。这对于避免幼虫生长过程中的不均匀喂养非常重要。
   注:交美成人可以转移到新鲜的L3饲养饮食板，所以更多的蛋下进行，并可以获得更多的实验幼虫。在整个工作周内，可以与同一成年人一起连续产卵。
3. 估计每盘卵子的数量，并将幼虫密度保持在每盘最多200个胚胎。这种估计可以通过计算四分之一的盘子中的胚胎数量来完成。
   注意:过度拥挤的盘子会延缓幼虫发育，影响幼虫喂养行为。
4. 在 18 °C（允许温度）、60% 湿度和 12:12 光暗循环下孵育 L3 饲养板，使幼虫生长 9 天（图 2B）。
5. 在产卵（AEL）后的第九天，从每个基因型（和复制品）中收集三组10L3进行测试。此外，收集 10 L3 组用于"零染料食品"控制。确保幼虫的收集是在一天中用于产卵的同等时间段内完成的（例如，如果卵子产卵发生在上午 10 点到下午 2 点之间，在 AEL 的同一时间段内收集幼虫），并且通过使用钳子#5或羽毛重量钳尽可能轻轻地进行。按照下一步（3.6）所示直接转移幼虫。
   注:"零染料食品"控制动物是幼虫，在喂养检测中给予食物没有蓝色染料。这种控制是必要的，以消除后吸收的幼虫提取物。
6. 将收集的实验幼虫转移到含有1mL水的塑料盘重量船上。请按照 图 3中给出的指示，确保收集 L3 而不是 L2。
   注:收集L3到含有水或1倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）的塑料船，对于在喂养检测开始前保持幼虫良好的水分非常重要。如果同时收集来自不同基因型的几个实验 L3 组，这一点尤其重要。跟踪每个组的收集顺序，因此将每个组食物匮乏时间的差异降至最低。在这一步中使用塑料船有利于可选的步骤4.3，因为它使幼虫直接漂浮到水浴。

4. 恒温遗传活化和无选择喂养检测

注意:建议在一天中大致相同的时间执行喂养检测，以尽量减少与昼夜节律相关的可能变化。此外，始终运行控制实验（"空Gal4"线的后代交叉到UAS dTRPA1和"零染料食物"幼虫），与兴趣的基因型平行。

1. 设置一个孵化器到30°C（不允许的温度），并保持高湿度（至少65%）避免在检测过程中幼虫脱水。
2. 在开始进食检测之前，通过在 30 °C 加热板 30 分钟来平衡检测板的温度。
3. （可选）在37°C的水浴中加热实验幼虫2分钟。执行这一步骤与动物在塑料重量船包含一些水。
   注:此步骤的目的是通过促进自喂养检测开始以来神经元的启动来加强神经元激活。
4. 将多个定时器设置为1小时。使用的定时器数量取决于正在测试的实验组的数量和实验者处理幼虫的熟练程度。
   注意:使用多个定时器对于保持所有基因型的检测持续时间一致至关重要。
5. 小心地从塑料船上排出水，用湿润的软刷，轻轻地将 L3 组从船上转移到检测板的中心。将板盖放回原处，启动每个板（或一组板）的限时器，以保持准确的 1 小时进餐会话。
6. 允许幼虫在黑暗中以30°C（图2C）为食1小时。
   注意:在黑暗中检测的性能对于控制不同饮食中视觉暗示的差异非常重要，因为饮食的色调会有所不同，即使它们含有相同的染料浓度。
7. 通过将盘子转移到冰浴中来停止喂食检测。尽可能压下冰层，为板块提供稳定的表面。
   注意:寒冷的温度会通过抑制挖洞和挖掘行为来促进喂养的结束。大多数幼虫会在几分钟后浮出水面，促进它们在以下步骤中的恢复。

5. 食品染料提取

1. 为每组 10 个 L3 测试准备 2 mL 微管，其中含有大约相同数量的 0.5 mm 玻璃珠（足以填充微管底部）和 300 μL 的冰冷甲醇。使用长凳冷却器将微管保持在寒冷中。
   注意:甲醇具有高度易燃性和毒性。遵循所有安全程序建议处理这种试剂，包括在通风良好的区域工作，戴氮化物手套。
   注意:使用甲醇对于修复幼虫样本和避免基质层中的黑色素化反应非常重要。
2. 使用#5或羽毛重量力，小心地从进食检测板中回收 10 L3 组，并将它们转移到含有一些水的检测板的盖子上。冲洗幼虫，以清除他们身上的任何食物碎片，同时轻轻地处理幼虫，以避免任何伤害。记录每个复制品的幼虫数量，以便量化每种幼虫的平均食物摄入量。
   注意:受伤的幼虫应该丢弃，因为它们会有黑色素化角质层，不适合着色定量。
3. 将 L3 组转移到 5.1 中准备的 2 mL 微管。
4. 使用在第 5.1 步添加的组织裂解器和玻璃珠，用机械裂解方法将幼虫组织酶从肠道中提取食物染料。（如果组织解酒器不可用，请使用同质化的害虫）。优先执行此步骤在 4 °C （图 2D）。
   注:此步骤的持续时间将取决于所使用的设备。使用传统的组织解压器，1分钟的提取就足够了。如果时间限制，协议可以在本步骤结束时暂停，然后继续。将样品储存在-20°C。
5. 通过将 2 mL 微管直接倒置到新的 1.5 mL 微管上，将提取物转移到清洁 1.5 mL 微管中。如果轻轻执行，大部分玻璃珠将停留在2毫升微管的底部。
6. 通过离心提取物（最高速度为 10 分钟）在 4 °C 下清除细胞碎片。
7. 收集超自然人清洁1.5 mL微管。如果细胞碎片在超自然体中仍然可见，则重复步骤 5.6 和 5.7。

6. 食品消费的彩色定量

1. 准备标准解决方案，通过在开始的蓝色染料溶液的甲醇中执行串行 1:2 稀释，生成校准曲线。作为空白，仅使用甲醇。标准的浓度取决于动物的食物摄入水平。
   注意:在此处显示的试验屏幕中，由于幼虫提取物获得的染料浓度在 0.02 至 1.93 μL/mL 之间，因此使用通过测量甲醇中 2 μL/mL 蓝色染料溶液 8 个连续稀释的吸收量而获得的标准曲线。如有必要，根据实验样品的染料浓度增加或降低这些溶液的浓度。
2. 将实验样品的 100 μL（第 5.7 步获得）、标准和空白（步骤 6.1）转移到 96 井微板的井中，并使用板阅读器（图 2E）测量 600 nm 的吸收量。要去除背景吸收，测量从幼虫饲料中获得的提取物的吸收量，而不使用蓝色染料作为幼虫提取物的"零"（"零染料食物控制"）。
3. 生成标准曲线，并将每个实验幼虫组样品的吸收值与食物摄入量（mL 中的体积）相关联。通过考虑步骤 5.2 中每组采集的幼虫数量，查找每只幼虫的平均食物消耗量

结果

果蝇幼虫以摄入过量碳水化合物^23（图2E中的示意图图）为代价调节其蛋白质摄入量。事实上，这种蛋白质摄入的优先顺序已经观察到在许多其他动物，被称为蛋白质杠杆^24，25。

利用这种强大的喂养行为反应，设计了一个基于行为的屏幕，旨在识别参与宏量营养素平衡的神经元群体。建立了无选择的喂养检测， 其中包括允许L3组（每组10个人）在神经元热遗传激活条件下使用dTRPA1喂养1小时，在三种同位素（248 Cal/L）食物染色饮食中含有特定的P:C比率（1:1、1:4和1:16）（图1和图2C）。作为读出，在不同P:C比率的宏量营养素饮食中所吃的食物的平均量被使用。利用Gal4/UAS系统^21，

讨论

通过此协议，当接触不同P:C成分的饮食时，可以测试幼虫在特定神经元种群的恒温激活下调节蛋白质和碳水化合物（两种主要宏量营养素）的摄入水平的能力。这种方法是在幼虫初步筛选的背景下测试的，目的是确定与控制不同宏量营养素质量的饮食中的食物摄入量相关的神经元人群。这项工作还有助于证明 ，果蝇 幼虫是研究与营养平衡相关的喂养行为的神经元基础的有价值的动物模型。

除了作为议定书中说明提供的信息外，我们还想进一步讨论一些重要方面。与任何行为检测一样，实验者必须采取措施，尽量减少与动物行为相关的变异。人们应该记住的一个非常重要的方面与获得发育同步动物的重要性有关。早期L3幼虫的使用在发育阶段很好地同步，将减少动物在^{喂养检测过程中}表现出的行为变异。幼虫的同步是通过短蛋产和控制幼虫在培养中的密度来实现的。不要使用比我们在协议中指出的更长的产卵周期（3-4小时）。此外，将幼虫密度控制在每盘最多200只动物，可以避免发育延迟，并消除喂养行为的其他变化。请注意，交配后第一个卵子必须丢弃，以保持均匀性，并获得更好的同步幼虫发育。雌性卵子在卵子中...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 微离心管	Sarstedt AG & Co.	72.690.001
10 倍 PBS	Nytech	MB18201
2.0 mL 微管	Sarstedt AG & Co.	72.695.500
60 mm 培养皿	Greiner Bio-one，奥地利	628161
96 孔微孔板	Santa Cruz Biotechnology	SC-204453
琼脂	Pró-vida，葡萄牙
冷却器	Nalgene，美国	Labtop 冷却器 5115-0032
蓝色食用染料	Rayner，比林斯赫斯特，英国
细胞破碎培养基	Scientific Industries， Inc.	888-850-6208	（0.5 mm glass beads）
培养皿重量舟	Santa Cruz Biotechnology	SC-201606
用于 60 mm 培养皿的胚胎采集笼	Flystuff，科学实验室用品，英国	FLY1212 （59-100）
羽量级镊子	BioQuip Products，美国	4750
用于库存维护			的苍蝇食品1 L 食物包含：10 g 琼脂、100 g 酵母提取物、50 g 蔗糖、30 mL Nipagin、3 mL 丙酸
镊子 #5	Dumont	0108-5-PS	标准尖端，INOX，11cm
培养箱	LMS Ltd，英国	系列 2，型号 230	用于产热喂养测定（30？C）
培养箱	Percival Scientific， USA	DR36NL	分期幼虫 （19？C）
Janelia lines	Janelia Research Campus		表 2 中的详细信息
宏量营养素均衡饮食			图 1 中的组成和营养信息
醇	VWR	CAS 号：67-56-1
Nipagin（4-羟基苯甲酸甲酯）	Sigma-Aldrich	H5501
丁腈手套	VWR，美国
冷冻离心机	Eppendorf， 德国	5804 R / 序列号：5805CI364293
Rubin Gal4 ines	Janelia Research Campus		Stoks 可在布卢明顿果蝇库存中心
ShibireTS UAS 线	布卢明顿果蝇库存中心	BDSC 编号：66600	由 Carlos Ribeiro Group 提供
软刷			用于分拣麻醉果蝇
分光光度计读板器	Thermo Fisher Scientific	Multiskan Go 51119300
立体显微镜	尼康	1016625
蔗糖	葡萄牙 Sidul
龄幼虫 （L3） 饲养饲料			图 1
		中的成分和营养信息 计时器
组织裂解器/珠子打浆器	MP Biomedicals， USA	FastPrep-24 6004500
TRPA1 UAS line	布卢明顿果蝇种群中心	BDSC 编号：26264	在 UAS 控制下表达 TrpA1;可用于在 25 ？C
水浴	美国 Sheldon Manufacturing Inc.	W20M-2 / 03068308 / 9021195
酵母提取物	Pró-vida， 葡萄牙		51% 蛋白质， 15% 碳水化合物