大鼠声带神经肌肉分析前的制备

摘要

本方案描述了用于制备大鼠声带以进行组织化学神经肌肉研究的方法。

摘要

本教程旨在介绍用于组织化学神经肌肉研究的大鼠声带制备方法。该方案概述了大鼠喉部解剖、快速冷冻以及声带冷冻切片的操作步骤。本研究描述了如何对声带进行纵向和横断面冷冻切片。本方案的创新之处在于冷冻切片过程中对喉部结构的追踪，可准确识别喉部固有肌肉，并降低组织丢失的风险。图示展示了两种切面下逐步冷冻切片的过程。共对29个大鼠半喉标本进行冷冻切片并追踪，从甲状软骨首次出现至首次观察到完整声带的切片为止。在所有动物中，两种切面均成功显示了完整的声带结构。从甲状软骨出现到完整声带出现之间的距离在两种切面中均表现出高度个体差异。体重与喉部解剖标志的深度无相关性，提示个体差异以及与组织制备相关的其他因素可能是切片过程中解剖标志出现位置变异较大的原因。本研究详述了一种方法，并提供了用于大鼠声带组织化学神经肌肉研究的形态学数据。由于个体差异显著，在冷冻切片过程中应密切追踪喉部解剖标志，以避免过度切片和组织丢失。采用一致的研究方法，包括充分的组织制备以及对大鼠喉部内部解剖标志的准确认识，将有助于不同研究之间获得可重复的结果，并为希望利用大鼠声带模型研究喉部神经肌肉机制的新研究人员提供支持。

引言

大鼠喉部是研究喉部神经肌肉结构与功能在发育、衰老、疾病及药物作用下适应性变化的成熟模型^1,2,3,4,5。组织学方法的一致性对这一研究方向至关重要，因为喉部肌肉的制备与分析涉及多个复杂环节，同时喉部本身体积小、形态不规则，且肌肉被包裹于喉软骨内，其拓扑结构也带来诸多挑战^{1,6,7,8,9,10,11}。由于大鼠喉部固有肌体积较小，系统性的包埋、冷冻及冷冻切片过程对于获得一致且准确的结果尤为关键。例如，在冠状面切取大鼠声带时，四块喉部固有肌的神经肌肉接头（NMJs）位于组织深度不足1.8 mm的范围内¹¹。因此，在冷冻切片过程中必须精确定位喉部肌肉解剖结构，以准确识别目标切片并防止过度切片。若目标肌肉被过度切片，可能导致NMJs数量和分布位置的误判¹¹，或因解剖标志定位混乱而误弃目标组织，从而整体减少样本量¹²。随着喉部肌肉及其适应性研究新模型的不断建立，制定标准操作流程对于确保研究结果的精确性、可靠性和可重复性至关重要。

本文的目的是详细介绍大鼠声带组织的制备方法，以实现最佳的纵向和横截面分析。本文描述了我们在实验室中常规使用的详细方法，用于在冷冻切片过程中识别目标肌肉的解剖标志。尽管类似的方法已在多个实验室中应用，但本文提供的细节较现有文献更为详尽，以确保初学者研究人员能够可靠且准确地重复该技术。本教程的目标是为大鼠声带的免疫组织化学（IHC）评估提供一种标准化的方法，从而提高不同实验室和研究之间结果的一致性。

方案

本研究遵循纽约大学医学院机构动物护理与使用委员会的规定进行。

1. 解剖大鼠喉部

1. 根据机构批准的安乐死操作规程处死大鼠。剃除从下颌至胸骨柄的腹侧颈部毛发，并用酒精擦拭，以防止组织样本被毛发污染。
2. 在解剖显微镜下使用10倍放大倍数，用手术刀沿颈部正中线切开，直至暴露气管，完整切除整个喉部。
3. 使用镊子和解剖剪或手术刀，在正中线分离腹侧喉外肌，以暴露喉部。
4. 在第三气管环尾侧切断气管，并在舌骨头侧做切口，使用解剖剪完整切除喉部。
5. 在放大条件下，使用显微解剖工具（镊子、针和显微剪）去除喉部周围的喉外组织（食管、甲状腺及喉外肌）。
6. 使用显微剪，以两侧后环杓肌之间的正中线为标志，在杓状软骨之间从背侧将喉部一分为二。将喉部侧壁固定，暴露声带，然后使用显微剪沿甲状软骨正中线、在声带前联合之间进行腹侧切割（图1）。
   注意：此步骤可选；可跳过以保持喉部完整。将喉部分为两半可利用同一喉部的左右两侧进行多种免疫染色技术。
7. 将每个半喉用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗约10秒，并用擦拭纸轻轻吸干，以减少冷冻过程中冰晶的形成。

2. 固定和/或快速冷冻喉部组织

注意：固定可能并不适用于所有免疫染色方案。通常喉组织在解剖后会立即新鲜速冻。如需在不固定的情况下速冻喉组织，请跳过步骤 2.1。

1. 将半喉组织置于含有4%多聚甲醛PBS溶液的离心管中，在室温下以70 rpm的转速于摇床上固定1小时。将组织转移至洁净的离心管中，用PBS清洗3次，每次20分钟。然后转移至另一洁净离心管中，浸入20%蔗糖/5%甘油溶液中（约18小时或直至组织沉底），4 °C保存。
   警告：甲醛具有危害性，应在通风橱中使用，并佩戴适当个人防护装备。
2. 将所有半喉组织以一致的方向放入盛有最佳切割温度（OCT）包埋剂的冷冻模具中。对于半喉样本，应使声带内侧面朝向冷冻模具底部，声带的纵轴与模具开口的下边缘平行。对于完整喉部样本，应使环杓后肌朝向模具底部，声带纵轴与模具开口的下边缘平行。
   注：喉组织在OCT包埋剂中的方向一致性对大鼠声带的冷冻切片至关重要。一旦半喉组织被包埋并冻结，若需调整方向则必须解冻，这会因多次冻融循环而增加组织损伤风险。
3. 使用液氮冷却的金属烧杯中的异戊烷（2-甲基丁烷）进行组织速冻。
   注：当烧杯壁和底部开始出现白色沉淀时，表明异戊烷已达到组织冷冻的最佳温度¹³。选用异戊烷是因为其热导率高于液氮，有助于防止组织块在快速冷冻过程中开裂。有关在OCT中冷冻组织的更详细描述，请参见Kumar等人的研究¹³。
4. 用预先标记的铝箔包裹每个模具，并分别装入独立的冷冻袋中以防止脱水，立即置于干冰上保存，直至转移至-80 °C超低温冰箱中长期储存。

3. 横断面冷冻切片半喉

1. 将冰冻切片机的腔室温度设置为 -20 °C，该温度位于制造商操作手册推荐的肌肉组织切片温度范围（15−25 °C）的中间。
2. 将冰冻切片机的切片厚度设置为 10 µm。
   注：对于肌纤维横截面分析，10 µm 厚的切片最为理想，可确保染色完全，并为肌纤维分型分析提供标记肌纤维的强成像信号强度^14,15,16。某些实验方案可能根据神经肌肉靶标的不同而需要不同的切片厚度。
3. 将组织转移至冰冻切片机腔室，在冰冻切片机标本盘（持样头）上添加一层均匀的OCT包埋剂，并将包埋好的组织块置于标本盘的OCT包埋剂上。为获得声带横截面以进行甲杓肌（TA）肌纤维分析，应将标本固定在持样头上，使甲状软骨腹侧朝向冰冻切片机刀片，而杓状软骨朝向标本盘。
   注：需特别注意，由于OCT包埋剂在冷冻后会变白且不透明，因此在此阶段无法观察到上述解剖标志。正因如此，在快速冷冻阶段准确记录半喉的方位至关重要。
4. 通过将标本头推进 100 µm 来修切OCT包埋剂，直至甲状软骨腹侧部分出现。
5. 随后，从甲状软骨起始处开始，以 30 µm 厚度连续修切并追踪切片，直至暴露声韧带、内侧甲杓肌和外侧甲杓肌。
   注：应从甲状软骨起始处开始，每隔 100 µm 追踪并记录喉部解剖标志，以确保切片角度不偏斜。图2展示了在10倍放大倍数下横截面平面上的两组喉部解剖标志。
6. 当到达目标甲杓肌区域后，使用带正电荷的载玻片以 10 µm 厚度收集切片。
7. 将切片保存在 4 °C 的PBS中以保持湿润，直至准备进行染色。
   注：固定后的组织可根据免疫组化靶标的不同在PBS中保存最多一周，而未固定的组织则应立即处理。

4. 纵切面冷冻切片半喉组织

1. 将冷冻切片机腔室温度再次设定为 -20 °C，调整切片厚度至 30 µm。
   注意：对于神经肌肉接头（NMJ）分析，喉部肌肉组织切片厚度在 30−60 µm 范围内可有效捕获多个完整的 NMJ，同时避免神经末梢或运动终板发生断裂^11,12,17。
2. 为获得用于甲杓肌（TA 肌）NMJ 分析的声带纵切面，将样本固定于样品头，使会厌朝向冷冻切片机刀片方向，气管腔面向下，朝向样品盘。
3. 通过将样本头前进 100 µm 来修切 OCT 包埋剂，直至甲状软骨出现。
4. 从甲状软骨起始处开始，连续修切并收集 30 µm 厚的切片，直至声带固有层以及 TA 肌的内侧和外侧部分完全暴露。
   注意：建议采用纵切面上五个系列的喉部解剖标志点，以追踪组织向目标 TA 肌推进的深度。图 3 展示了在 10 倍放大倍数下纵切面上的喉部解剖标志。
5. 当达到目标 TA 肌区域后，将 30 µm 厚的切片收集到带正电荷的载玻片上。
6. 将切片保存于 4 °C 的磷酸盐缓冲液（PBS）中以保持湿润，直至准备进行染色。

结果

代表性结果来自一项关于发声锻炼对喉部神经肌肉系统影响的持续研究。29只雄性Fischer 344/brown Norway大鼠（12只为9月龄，17只为24月龄）经称重后，通过吸入CO₂实施安乐死，随后进行双侧开胸术。

实验步骤遵循既定方案，对胫骨前肌外侧和内侧的神经肌肉接头（NMJs）及肌纤维大小进行标记。在冰冻切片过程中，通过喉部肌肉及周围软骨，在纵向和横断面平面上追踪喉部解剖标志之间的距离，以确定切片进展（表1）。追踪始于两个方向平面上甲状软骨首次出现的位置。图2按时间顺序展示了横断面冰冻切片过程中喉部解剖标志的出现情况，其中甲状软骨（图2a,b）的出现早于内侧胫骨前肌和固有层（图2c,d）。图3按时间顺序展示了纵向冰...

讨论

进行大鼠声带的神经肌肉分析前处理时可能面临多种挑战。喉部肌肉不仅体积小且被软骨包围，使得直接提取目标肌肉变得困难，而且动物之间喉部解剖标志的深度也存在较大变异。在肌肉横截面切片方案中，自甲状软骨腹侧首次出现后，完整的声带切片出现在第21至85个切片（每切片10 µm）之间，这明显少于用于神经肌肉接头分析的纵切面方案中的第63至126个切片（每切片35 µm）（表1）。

尽管每种实验方案的组织包埋、定位和切片过程均保持一致，但在不同喉部解剖标志点之间的距离上仍观察到变异。此外，体重差异并不能解释从一组喉部解剖标志点到下一组之间组织深度广泛变化的原因。这种喉部解剖标志点间距离的变异可能源于动物间喉部解剖结构的个体差异，或在解剖时喉体于OCT包埋剂中置于冷冻模具内的方向存在微小差异，亦或是在冰冻切片机中进行切片时标本在标本盘上的放置方式不同所致（例如，放置标本前在标本盘上添加的OCT包埋剂量的多少，或标本放置角度的细微差异）。

鉴于这些标本制备中的细微差异可能导致喉部组织解剖标志深度出现显著变异，初...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-甲基丁烷 认证级	Fisher Chemical	35514
铝箔	Fisherbrand	1213101
不锈钢冻存钳	Thermo Scientific	11679123
冷冻切片机	Leica Biosystems	CM3050
冷冻切片机刀片	C.L. Sturkey D554X50	22-210-045
一次性包埋模具 15 mm × 15 mm	Thermo Scientific	41-741
一次性吸水垫	Medline	23-666-062
解剖工具包	Thermo Scientific	9996969
DPBS - 达尔伯克氏磷酸盐缓冲液	Gibco	14190136
冷冻切片包埋介质	Fisher Healthcare	23-730-571
冰桶	Bel-Art	11999054
免疫染色湿盒	Ted Pella Inc	NC9425474
持针器	Assi	ASSI.B148
非织造海绵，4层	Quick Medical	9023
旋转摇床	Troemner	02-217-987
疏水笔
多聚甲醛，16% w/v 水溶液，无甲醇	Alfa Aesar	50-00-0
优质微量离心管	Fisherbrand	5408129
标本储存袋	Fisherbrand	19240093
不锈钢量杯 32 oz/100 mL	Polar Ware	114231B
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisherbrand	12-550-15
实验用擦拭纸	Kimberly-Clark Professional™ 34155	06666A
计时器	Fisherbrand	2261840
Vannas 剪刀	Assi	ASSI.SAS15RV
注：以上所列为可采购耗材与设备的示例，完成本实验方法无需使用完全相同的型号。