大鼠声带神经肌肉分析前的制备

摘要

本方案描述了用于制备大鼠声带以进行组织化学神经肌肉研究的方法。

摘要

本教程旨在介绍用于组织化学神经肌肉研究的大鼠声带制备方法。该方案概述了大鼠喉部解剖、快速冷冻以及声带冷冻切片的操作步骤。本研究描述了如何对声带进行纵向和横断面冷冻切片。本方案的创新之处在于冷冻切片过程中对喉部结构的追踪，可准确识别喉部固有肌肉，并降低组织丢失的风险。图示展示了两种切面下逐步冷冻切片的过程。共对29个大鼠半喉标本进行冷冻切片并追踪，从甲状软骨首次出现至首次观察到完整声带的切片为止。在所有动物中，两种切面均成功显示了完整的声带结构。从甲状软骨出现到完整声带出现之间的距离在两种切面中均表现出高度个体差异。体重与喉部解剖标志的深度无相关性，提示个体差异以及与组织制备相关的其他因素可能是切片过程中解剖标志出现位置变异较大的原因。本研究详述了一种方法，并提供了用于大鼠声带组织化学神经肌肉研究的形态学数据。由于个体差异显著，在冷冻切片过程中应密切追踪喉部解剖标志，以避免过度切片和组织丢失。采用一致的研究方法，包括充分的组织制备以及对大鼠喉部内部解剖标志的准确认识，将有助于不同研究之间获得可重复的结果，并为希望利用大鼠声带模型研究喉部神经肌肉机制的新研究人员提供支持。

引言

大鼠喉部是研究喉部神经肌肉结构与功能在发育、衰老、疾病及药物作用下适应性变化的成熟模型^1,2,3,4,5。组织学方法的一致性对这一研究方向至关重要，因为喉部肌肉的制备与分析涉及多个复杂环节，同时喉部本身体积小、形态不规则，且肌肉被包裹于喉软骨内，其拓扑结构也带来诸多挑战^{1,6,7,8,9,10,11}。由于大鼠喉部固有肌体积较小，系统性的包埋、冷冻及冷冻切片过程对于获得一致且准确的结果尤为关键。例如，在冠状面切取大鼠声带时，四块喉部固有肌的神经肌肉接头（NMJs）位于组织深度不足1.8 mm的范围内¹¹。....

方案

本研究遵循纽约大学医学院机构动物护理与使用委员会的规定进行。

1. 解剖大鼠喉部

1. 根据机构批准的安乐死操作规程处死大鼠。剃除从下颌至胸骨柄的腹侧颈部毛发，并用酒精擦拭，以防止组织样本被毛发污染。
2. 在解剖显微镜下使用10倍放大倍数，用手术刀沿颈部正中线切开，直至暴露气管，完整切除整个喉部。
3. 使用镊子和解剖剪或手术刀，在正中线分离腹侧喉外肌，以暴露喉部。
4. 在第三气管环尾侧切断气管，并在舌骨头侧做切口，使用解剖剪完整切除喉部。
5. 在放大条件下，使用显微解剖工具（镊子、针和显微剪）去除喉部周围的喉外组织（食管、甲状腺及喉外肌）。
6. 使用显微剪，以两侧后环杓肌之间的正中线为标志，在杓状软骨之间从背侧将喉部一分为二。将喉部侧壁固定，暴露声带，然后使用显微剪沿甲状软骨正中线、在声带前联合之间进行腹侧切割（图1）。
   注意：此步骤可选；可跳过以保持喉部完整。将喉部分为两半可利用同一喉部的左右两侧进行多种免疫染色技术。
7. 将每个半喉用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗约10秒，并用擦拭纸轻轻吸干，以减少冷冻过程中冰晶的形成。

2. 固定和/或快速冷冻喉部组织

注意：固定可能并....

结果

代表性结果来自一项关于发声锻炼对喉部神经肌肉系统影响的持续研究。29只雄性Fischer 344/brown Norway大鼠（12只为9月龄，17只为24月龄）经称重后，通过吸入CO₂实施安乐死，随后进行双侧开胸术。

实验步骤遵循既定方案，对胫骨前肌外侧和内侧的神经肌肉接头（NMJs）及肌纤维大小进行标记。在冰冻切片过程中，通过喉部肌肉及周围软骨，在纵向和横断面平面上追踪喉部解剖标志之间的距离，以确定切片进展（表1）。追踪始于两个方向平面上甲状软骨首次出现的位置。图2按时间顺序展示了横断面冰冻切片过程中喉部解剖标志的出现情况，其中甲状软骨（图2a,b）的出现早于内侧胫骨前肌和固有层（图2c,d）。图3按时间顺序展示了纵向冰.......

讨论

进行大鼠声带的神经肌肉分析前处理时可能面临多种挑战。喉部肌肉不仅体积小且被软骨包围，使得直接提取目标肌肉变得困难，而且动物之间喉部解剖标志的深度也存在较大变异。在肌肉横截面切片方案中，自甲状软骨腹侧首次出现后，完整的声带切片出现在第21至85个切片（每切片10 µm）之间，这明显少于用于神经肌肉接头分析的纵切面方案中的第63至126个切片（每切片35 µm）（表1）。

尽管每种实验方案的组织包埋、定位和切片过程均保持一致，但在不同喉部解剖标志点之间的距离上仍观察到变异。此外，体重差异并不能解释从一组喉部解剖标志点到下一组之间组织深度广泛变化的原因。这种喉部解剖标志点间距离的变异可能源于动物间喉部解剖结构的个体差异，或在解剖时喉体于OCT包埋剂中置于冷冻模具内的方向存在微小差异，亦或是在冰冻切片机中进行切片时标本在标本盘上的放置方式不同所致（例如，放置标本前在标本盘上添加的OCT包埋剂量的多少，或标本放置角度的细微差异）。

鉴于这些标本制备中的细微差异可能导致喉部组织解剖标志深度出现显著变异，初.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-甲基丁烷 认证级	Fisher Chemical	35514
铝箔	Fisherbrand	1213101
不锈钢冻存钳	Thermo Scientific	11679123
冷冻切片机	Leica Biosystems	CM3050
冷冻切片机刀片	C.L. Sturkey D554X50	22-210-045
一次性包埋模具 15 mm × 15 mm	Thermo Scientific	41-741
一次性吸水垫	Medline	23-666-062
解剖工具包	Thermo Scientific	9996969
DPBS - 达尔伯克氏磷酸盐缓冲液	Gibco	14190136
冷冻切片包埋介质	Fisher Healthcare	23-730-571
冰桶	Bel-Art	11999054
免疫染色湿盒	Ted Pella Inc	NC9425474
持针器	Assi	ASSI.B148
非织造海绵，4层	Quick Medical	9023
旋转摇床	Troemner	02-217-987
疏水笔
多聚甲醛，16% w/v 水溶液，无甲醇	Alfa Aesar	50-00-0
优质微量离心管	Fisherbrand	5408129
标本储存袋	Fisherbrand	19240093
不锈钢量杯 32 oz/100 mL	Polar Ware	114231B
Superfrost Plus 显微镜载玻片	Fisherbrand	12-550-15
实验用擦拭纸	Kimberly-Clark Professional™ 34155	06666A
计时器	Fisherbrand	2261840
Vannas 剪刀	Assi	ASSI.SAS15RV
注：以上所列为可采购耗材与设备的示例，完成本实验方法无需使用完全相同的型号。